Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för tillämpning av rodamin 123 att identifiera den mitokondriella membranpotentialen (MMP) och studera CLIC4 knockdown-inducerad HN4 cell apoptos in vitro. Under gemensamma fluorescens Mikroskop och confocal laser scanning fluorescens Mikroskop spelades realtid ändringen av MMP.
Abstract
Utarmning av den mitokondriella membranpotentialen (MMP, ΔΨm) anses vara den tidigaste händelsen i apoptotiska kaskad. Det förekommer även inför nukleära apoptotiska egenskaper, inbegripet kromatin kondens och DNA skador. När de MMP kollapsar, cell apoptos inleda irreversibelt. En serie av lipofila katjoniska färgämnen kan passera cellmembranet och aggregera inne i matrisen av mitokondrie, och fungera som fluorescens markör att utvärdera MMP förändring. Som en av de sex medlemmarna i Cl– intracellulära kanal (CLIC) Familj, deltar CLIC4 i cellen apoptotiska processen främst via mitokondriell vägen. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta MMP via övervakning av fluorescens fluktuationer i rodamin 123 (Rh123), genom vilken vi studerar apoptos induceras av CLIC4 knockdown. Vi diskutera fördelar och begränsningar av tillämpningen av confocal laserscanning och normala fluorescens Mikroskop i detalj, och även jämföra det med andra metoder.
Introduction
Rh123 är ett katjonaktiva fluorescens färgämne, som fungerar som en indikator för transmembrana potential. Rh123 kan penetrera cellmembranet och ange matrisen mitokondriell beroende på potentiella skillnaden av inom och utanför membranet1. Apoptos leder till skador på mitokondriella membranet integritet. Mitokondrien permeabilitet övergången pore (MPTP) öppnas och leda till kollaps av den MMP, vilket i sin tur resulterar i utsläpp av Rh123 på utsidan av mitokondrierna. Slutligen kommer starkare grön fluorescens signal detekteras under fluorescens Mikroskop. Det är väl dokumenterat att utarmning av MMP och förhöjda membran permeabilitet är tidiga tecken på cell apoptos2. Rh123 kan därför tillämpas på detektion av MMP förändring och förekomst av cell apoptos.
Som den 6: e vanligaste carcinom i världen försämras huvud och hals cancer allvarligt en persons hälsa3. Även om många metoder har utvecklats under de senaste åren, är kliniskt utfall av behandlingen för patienter som lider av huvud och hals skivepitelcancer (SCHH) fortfarande inte perfekt4. Utforska nya terapeutiska metoder kan förbättra behandlingen för SCHH5. Jonkanaler som involverar många biologiska processer visar en viktig roll i utvecklingen av olika cancerformer6. Helt eller delvis deltagande av Cl– kanaler är mycket engagerade i olika egenskaper av neoplastiska omvandling, inklusive aktiv migrering, hög spridning och invasivitet. Mot bakgrund av detta, har CLIC, en roman protein familj, listats som en lovande klass av terapeutiska mål för cancer behandling6,7. Senare studier visat att CLIC familjemedlemmar inklusive CLIC1, CLIC4 och CLIC5, lokalisera till hjärt mitokondrie och reaktivt syre artnivå (ROS) är uppreglerad av CLIC5, som anger den funktionella rollen för mitokondrie-ligger Cl - kanaler i apoptotiska svar8. CLIC4, en medlemmar av familjen CLIC (även känd som mtCLIC, P64H1 och RS43), har studerats mest för dess apoptotiska förordning boenden i cancerceller och subcellulär läge inklusive Golgi, endoplasmatiska retiklet och mitokondrier i mänskliga keratinocyter7,9,10. Uttryck profil CLIC4 reglerades av tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), P53 och yttre stimulans. Överuttryck och nedreglering av CLIC4 utlösa en apoptotiska svar främst via mitokondriell vägen tillsammans med obalansen av Bcl-2 familjemedlemmar, aktivering av kaspas cascade, och frisättning av cytokrom C11, 12 , 13. därför MMP mätning är avgörande för att utforska CLIC4-relaterade apoptos och Rh123 fungerar som en idealisk fluorescens indikator.
Föreliggande studie beskriver ett detaljerat protokoll för detektion av MMP att studera CLIC4 knockdown-inducerad apoptos i HN4 celler. Rh123 används som en fluorescens sond för att Observera ändringen av MMP. Under gemensamma fluorescens Mikroskop och confocal laser scanning fluorescens Mikroskop, kan realtid fluktuationer i MMP lösas. Vi diskutera fördelar och begränsningar av tillämpningen av confocal laserscanning fluorescens Mikroskop i detalj, och även jämföra det med andra metoder. Detta protokoll kan också tillämpas på andra apoptos-relaterade studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kultur och Transfection
-
Cellkultur
Obs: HN4, en cellinje i SCHH, härleddes från patienter med SCHH14.- Kultur HN4 celler i Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, 4,5 g/L glukos) kompletteras med 10% fetalt bovint serum och antibiotika (100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin). Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
-
Cell transfection
- En dag innan transfection, tallrik 5 x 105 celler i 2 mL/väl av odlingsmedium utan antibiotika i 6 brunnar.
- Späd 100 pmol CLIC4 siRNA eller kodade SiRNA i 250 µL minskade serum media, försiktigt. Späd 5 µL Liposom reagens i 250 µL minskade serum media och inkubera i 5 min. kombinera den utspädda siRNA med utspädda Liposom reagens, blanda försiktigt och inkubera i 20 min i rumstemperatur.
- Tillsätt blandningen till varje brunn innehållande celler och medium. Blanda försiktigt genom att gunga på plattan och tillbaka. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2 inkubator för 24 h innan du fortsätter med följande Rh123 märkning procedur. Ersätta mediet med normal tillväxt medium 4 h efter transfection.
2. Rh123 märkning
Obs: Rh123 utnyttjades för att mäta MMP i HN4 celler1.
- Efter CLIC4 siRNA behandling (avsnitt 1), användning av HN4 celler i 6 brunnar för följande behandling. Mängden HN4 celler i varje är väl nog att upprepa försöket 10 gånger på coverslips.
- Använda pincett för att sätta cirkulär coverslips nedtill på nya 12 brunnar. Antalet plåtar anges enligt experimentell design (figur 1A).
- Lägga 150 µL av 100 µg/mL polylysine på mitten av varje täckglas inuti 12-väl plattorna och vänta 2 min. var uppmärksam att inte sätta polylysine utanför coverslips. Ta sedan bort polylysine av vi rekommenderar grundligt (figur 1B).
- Ta bort odlingssubstratet HN4 celler inuti skålen och tillsätt 1 mL 0,25% trypsin för att lossa cellerna. Efter 6 min, tillsätt 2 mL odlingsmedium för att neutralisera trypsin. Blanda försiktigt HN4 cellerna av vi rekommenderar för 5 gånger och utsäde 2-6 х 104 celler på den cirkulära coverslips. Placera i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 (figur 1C).
- Efter 8 h inkubation, inkubera HN4 cellerna med 2 µmol/L Rh123 för 40 min vid 37 ° C. Blanda försiktigt de medelstora up-and-down flera gånger för att säkerställa jämn fördelning av Rh123 i mediet (figur 1D).
- Förbereda tillräckligt normal fysiologisk koksaltlösning lösning (NPSS); att göra NPSS (i mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 glukos och 5 HEPES, pH 7,4). Värm till 37 ° C i ett vattenbad.
- Använda pincett för att ta bort coverslips och tvätta de återstående vätska via kort att placera coverslips i förvärmd NPBS bufferten (figur 1E).
- Placera coverslips nedtill på 500 µL rostfritt stål kammare (se Tabell för material) med en utbytbar 25 mm glas täckglas botten förseglas på plats av en o-ring. Åtgärda det genom att dra åt locket på avdelningen (figur 1E).
- Lägga till 450 µL förvärmd NPSS buffert till monterade kammaren och lägga badet under synfältet av fluorescens Mikroskop eller confocal laserscanning fluorescens Mikroskop (figur 1E).
3. Påvisande av MMP
-
Gemensamma fluorescens Mikroskop
- Slå på mikroskopet fluorescens följa tillverkarens instruktioner.
Obs: Gemensamma fluorescens Mikroskop var fulländad med en mercury lamp fiberoptisk ljuskälla, ett FITC filter för Rh123 (480/40 excitationsfilter, 505 LP dichroic spegel och 535/40 utsläpp filter) vid rumstemperatur. 20 X mål användes för att utföra live-cell imaging. - Öppna system avbildningsprogrammet och välj knappen ”Nytt” från kommandofältet att börja ett nytt experiment (figur 2A).
- Justera synfältet och fokus att hitta platsen för cellerna i vitt ljus.
- Stänga av ljuset och tryck på knappen för att stänga vitt ljus. Klicka på knappen ”fokus” från kommandofältet och välj ”Starta fokus” för att slå på fluorescensen. Hitta platsen för cellerna igen via Mikroskop med en 507 nm excitation och 529 nm lång pass utsläpp våglängd (Set innan experimentet). Justera synfältet och fokus igen om det behövs (figur 2B).
- Välj ett synfält som innehåller bara 20 till 30 separerade HN4 celler. Ändringen av intracellulära fluorescens signal för varje cell kommer att registreras korrekt.
- När en tydlig synfältet uppnås, klicka på ”fokusering på nära håll” i fokus baren. Klicka på ”Acq One” från kommandofältet att förvärva en uppsättning bilder. Klicka på ”regioner” från kommandofältet och klicka på ”OK” för att redigera regioner med mätning.
Obs: I redigera regionen baren, annan region former kan användas beroende på studien. - För att passa för olika former av enskilda celler, Välj verktyget ”Trace Region” och cirkel regionen i en enda cell och dubbel klick när du är klar. Upprepa proceduren tills alla celler är inringad (figur 2C). Klicka på ”klar” och välj ”Spara bilder” för att hitta den sparade platsen.
- Klicka på ”Zeroclock” och snabbt tryck F4 för att börja övervaka byte av fluorescensintensiteten. Rekord i realtid ändra av fluorescensintensiteten en gång varje 5 s för 5 min (figur 2D).
- När originalplanen blir stabil, tillsätt 50 µL NPSS blandas med 0,5 µL 100 mmol/l ATP till kammaren via vi rekommenderar. Kom ihåg att inte röra i kammaren för att undvika att ta bort synfältet (figur 2E).
Obs: Fluorescens bilden kommer att registreras i 20 min och sedan experimentet kan avsluta via manuell drift. Tidslängden kvittas rutinmässigt för 20 min för att observera hela fluorescens förändring. Manuell drift att sluta fånga tillämpas dock när oväntade faktorer påverka stabiliteten av kurvan eller när hela processen tar mindre än 20 min.
- Slå på mikroskopet fluorescens följa tillverkarens instruktioner.
-
Confocal laser scanning fluorescens Mikroskop
- Slå på confocal laser skanning fluorescens Mikroskop efter tillverkarens anvisningar och öppna den stuvat mjukvaran.
Obs: Här, Rh123 var upphetsad av en Argon laser på 488 nm och den utsända signalen spelades över inom 545-700 nm via applikation av TD488/543/633 filtret. - Klicka på ”objektiva” under menyn ”skaffa” att välja 63 X / 1.4 objektiv N.A. olja. Observera preparatet och hitta en tydlig synfältet under fältet ljus.
- Tryck på knappen ”TL/IL” växla till fluorescens-läge och välj rätt fluorescens filtren för att hitta platsen för cellen under mörker via Mikroskop. Tryck ”slutare” att skydda preparatet när observationen är klar.
- Under menyn ”skaffa” justera lämplig PMT kanal och klicka på ”nå” för att aktivera den kvittade optiska vägen (figur 3A). Klicka på menyn ”konfiguration” och välja ”Laser” att bestämma behövs laser. ”Argon” rekommenderas för detta protokoll (figur 3B).
- Klicka på ”Live” för att få realtid bild och kontrollera synfältet innehåller bara 20 till 30 separerade HN4 celler. Ändringen av intracellulära fluorescens signal för varje cell kommer att registreras korrekt.
- Välj ”xyt” i förvärv läge i undermenyn ”förvärv” under menyn ”skaffa” (figur 3C). Ange 5 s och 20 min för tidsintervall och varaktighet, respektive. Klicka på ”Apply” när alla parametrar kvittas.
- Under menyn ”kvantifiera” verktyget ”Rita polylinje” för att cirkla området inspelning i varje cell. Välj ”Line profil” och välj ”Start” för att genomföra observation. Spela in i realtid ändringen av fluorescensintensiteten för 5 min (figur 3D - E).
- När originalplanen blir stabil, tillsätt 50 µL NPSS blandas med 0,5 µL 100 mmol/l ATP till kammaren via vi rekommenderar. Kom ihåg att inte röra i kammaren för att undvika att ta bort synfältet.
Obs: Fluorescens bilden kommer att registreras i 20 min och sedan experimentet är klar.
- Slå på confocal laser skanning fluorescens Mikroskop efter tillverkarens anvisningar och öppna den stuvat mjukvaran.
4. statistisk analys
-
Gemensamma fluorescens Mikroskop
- Slå på mikroskopet fluorescens rutinmässigt följa bruksanvisningen. Öppna system avbildningsprogrammet och välj knappen ”Öppna” från kommandofältet att öppna en sparad experiment. Klicka på ”regioner” från 'Kommandofältet' och klicka ”OK” knappen för att redigera regioner med mätning.
- Välj verktyget ”Trace region” och cirkel regionen i en enda cell och dubbel klick när du är klar. Upprepa proceduren tills alla celler har varit inringad. Klicka på ”klar” och välj den ”F4: framåt”-knappen för att få ett spår som visar fluorescensintensiteten.
- En gång färdig, klicka på nedåtpilen ligger på det nedre högra hörnet av diagrammet och klicka på ”Visa diagramdata” (figur 2F). Klicka ”OK” två gånger och välj knappen ”loggdata” att öppna gränssnittet för databehandling programvara. Klicka på ”Log Data” igen och hitta poster realtid fluktuationer av fluorescensintensiteten visas på kalkylbladet.
Obs: För varje cell, förändringar i MMP visades som förhållandet mellan fluorescens i förhållande till intensiteten innan tillämpningen av ATP eller TG (F1/F0). Varje fluorescens intensitet uppgifter var genomsnittet av 20-30 celler. Data för Rh123 presenteras som medelvärde ± SE. resultat från 2 grupper testades av tvåsidiga oberoende t -test och P -värdet < 0.05 ansågs som statistisk signifikans. Statistisk analysprogramvara användes för att genomföra statistiska analyser i detta experiment.
-
Confocal laser scanning fluorescens Mikroskop
- Slå på mikroskopet confocal laser och logga in på den medföljande programvaran följa tillverkarens instruktioner.
- Välj ”Fire” för att öppna ett inspelade experiment.
- Välj verktyget ”Stack profil” under menyn ”kvantifiera”, välj ”All in one” från ”sortera diagram av kanaler och ROIs”.
- Använd verktyget ”Rita polygon” cirkel cell regioner för observation.
- Välj menyn ”diagram” och klicka på höger musknapp och välj ”Exportera till excel” att lägga till värden för fluorescerande intensitet i ett kalkylblad. Följande analys överensstämmer med normala fluorescens Mikroskop (figur 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuella studien användes Rh123 för att upptäcka MMP. Inledningsvis odlades HN4 celler för följande fluorescensen färgning experiment. Pincett användes att sätta cirkulär coverslips nedtill på 6 brunnar (figur 1A). Coverslips belades med polylysine för 5 min och sedan polylysine bort via vi rekommenderar (figur 1B). Då var HN4 celler trypsinized och dirigeras till den coverslips placeras i botten av 6 brunnar. Nästa, lämplig mängd Rh123 lades och blandas väl (figur 1C-D). Efter tvätt med den förvärmd NPSS, var täckglaset monteras in i visning kammaren. Lämplig mängd NPSS lades för det följande experimentet (figur 1E).
Efter ingreppet av Rh123 färgning användes både vanliga fluorescens Mikroskop och confocal mikroskopet för att spela in i realtid Rh123 fluorescens med olika steg och programvara. För det vanliga fluorescens mikroskopet, var avbildningsprogrammet påslagen för att skapa ett nytt experiment. Slutaren öppnades för att Visa grön fluorescens ljus och fokus och läge justerades för att erhålla en lämplig synfältet. Efter att en cell bild, användes trace formverktygen att rita regionen i varje enskild cell och sedan registrera ändringen fluorescens. När originalplanen blev stabil, lades ATP in i kammaren att utlösa mitokondriella membranet depolarisation. I experimentet av confocal laser skanning fluorescens Mikroskop, den stuvat mjukvaran öppnades och en lämplig optisk väg var inställd. Efter argon ljuskällan valdes, justerat vi fokus och position av kammaren för att uppnå en tydlig visuell cell former på skärmen. ”Xyt” skanningsläge valdes och verktyget ”Rita polygon” tillämpades för att cirkeln regionen cell för att spela in fluorescens förändringen inom varje enskild cell. För att analysera rådata, F0 var värdet av fluorescensintensiteten innan ATP ansökan och F1 var det maximala värdet av fluorescensintensiteten efter ATP applicering. F1/F0 användes för att bedöma den mitokondriella membranet depolarisation (figur 2 och figur 3). Från figur 4B och figur 5B, var nivåerna av fluorescerande intensitet förhöjda efter behandling av ATP och minskad tillbaka till baslinjen efter ca 10 min. figur 4C och figur 5C visar tydligt att toppen av fluorescensintensiteten hos Rh123 var högre i gruppen under CLIC4 siRNA behandling än i kontrollgruppen. Figur 4 A och figur 5A Visa representativa bilder av fluorescerande ändringen i varje etapp. Jämfört med den vanliga fluorescens mikroskopet, erhålls mikroskopet confocal en högre kvalitet på bilden, visar cellkärnan och mitokondrier. Dock när man jämför data från de två metoderna, skillnader inga signifikanta. Resultat från fluorescens och confocal mikroskopet visade att Nedslagning av CLIC4 förbättrad ATP-inducerad mitokondriella membranet depolarisation i HN4 celler (figur 4 och figur 5).
Figur 1 . Rh123 märkning. (A) pincett användes för att sätta cirkulär coverslips nedtill på 6 brunnar. (B) beläggning coverslips med polylysine via vi rekommenderar för 5 min och slutligen sug tillbaka in vi rekommenderar att ta bort polylysine. (C) HN4 celler var seedad på coverslips nedtill på 6 brunnar. (D) lägga till en lämplig mängd Rh123 och blanda väl. (E) tvätta coverslips med förvärmd kärnkraftverk och montering kammaren med en lämplig mängd NPSS för det följande experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Åtgärder för att övervaka i realtid fluktuationer i Rh123 fluorescens genom gemensamma fluorescens Mikroskop. (A) öppna ett nytt experiment. (B) börjar fokusera och välja en lämplig synfältet under fluorescens. (C) använda ”regioner” verktyg från kommandofältet till redigera regioner med observation. (D) Klicka på ”noll klocka” och tryck snabbt F4 för att börja övervaka byte av fluorescensintensiteten. (E) lägga till ATP (100 µmol/L) att utlösa mitokondriella membranet depolarisation efter baslinjen blir stabil. (F) när experimentet är klar, klicka på nedpilen ligger på det nedre högra hörnet av diagrammet att exportera data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Åtgärder för att övervaka i realtid fluktuationer i Rh123 fluorescens av confocal laserscanning fluorescens Mikroskop. (A) Välj kanalen som PMT och Ställ in en lämplig våglängdsområdet under menyn ”skaffa”. (B) Välj rätt laser från ”nuvarande tillgängliga laser” och ange dess makt. (C) väljer den ”xyt” observation läge och en rad inspelningsparametrar. (D) Välj Verktyg ”Stack profil” och ”All in One” från ”sortera diagram av kanaler och ROIs”. (E) Använd verktyget ”Rita polygonen” cirkel regionen cell för realtidsdata. (F) exportera värdena av fluorescerande intensitet till databehandling programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Effekten av CLIC4 knockdown på ATP-inducerad mitokondriella membranet depolarisation lösas genom gemensamma fluorescens Mikroskop i HN4 celler. (A) representativa bilder av fluorescens fluktuationer Rh123. representativa spår (B) och summerade data (C) visar ATP (100 µmol/L)-inducerade förändringar i cellen HN4 MMP. Förändringen i membranpotentialen indikerades av förhållandet mellan fluorescensintensiteten före och efter tillämpningen av ATP. Baserat på ökningen representerar den membran potentiella depolarisation. HN4 cellerna var transfekterade med CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) eller kodade siRNA (Con siRNA). Värden visas som medelvärde ± SEM n = 5. P < 0,05 jämfört med kontrollen (Con siRNA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Effekt av CLIC4 knockdown på ATP-inducerad mitokondriella membranet depolarisation lösas genom confocal laserscanning fluorescens Mikroskop i HN4 celler. (A) representativa bilder av fluorescens fluktuationer Rh123. representativa spår (B) och summerade data (C) visar ATP (100 µmol/L)-inducerade förändringar i cellen HN4 MMP. Förändringen i membranpotentialen indikerades av förhållandet mellan fluorescens tätheten före och efter tillämpningen av ATP. Baserat på ökningen representerar den membran potentiella depolarisation. De HN4 cellerna var transfekterade med CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) eller äggröra siRNA (Con siRNA). Värden visas som medelvärde ± SEM n = 5. P < 0,05 jämfört med kontrollen (Con siRNA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är väl dokumenterat att Cl− kanaler är nödvändigt att upprätthålla hemostas av den interna miljön och spelar viktiga roller i cellproliferation och apoptos15,16. Förstå sambandet mellan ion kanal-riktad intervention och apoptos är därför i stort behov och betydelse för att hitta en bättre behandlingsmetoder för olika cancerformer17. Mitokondrier bibehålla normala biologiska statusen för en cell och dess funktion avser mycket dess membran permeabilitet och transmembrana potential. Förutom cancer, har ackumulera neuropatologiska utredningar dokumenterat att mitokondriell avvikelser bidra till myopati, hjärt-och kärlsjukdomar och neurologiska symtom inklusive sensorineural dövhet, cerebellär ataxi, demens , och epilepsi18,19. Alla dessa har sporrat forskningen i mitokondrie-riktade interventioner att lindra kliniska behandling. Rh123, en mitokondrie-riktade fluorescens dye, kan tränga in i cellmembranet, och serverar som en universell fluorescens sond att upptäcka MMP. I den tidiga delstaten cell apoptos, öppning av MPTP höjer mitokondriella membranet permeabilitet möjliggör Rh123 att släppas utanför mitokondrierna och slutligen starkare grön fluorescens signal kan upptäckas. I denna situation, bilaterala joner distribuera fritt och leda till snabba släpp av MMP orsakar frikoppling av elektron transportkedjan och minskad ATP-produktion, som allvarligt påverkar den normala energiförsörjningen av celler. Dessutom, utlöser öppning av MPTP utflödet av pro-apoptotiska bioaktiva föreningar inklusive Cyt C, apoptos inducerande faktor, apoptotiska proteas aktiverande faktor-1, och ROS och slutligen leder till oåterkalleliga apoptos20,21 .
ATP kan inducera mitokondriella membranet depolarisation framgår av förhöjda fluorescens av Rh123. Genom att jämföra ATP-inducerad mitokondriella membranet depolarisation av celler under olika behandlingar, är det möjligt att dechiffrera den biologiska funktionen av förändringen i mitokondrierna och graden och delstaten apoptos22. Både vanliga fluorescens Mikroskop och confocal laserscanning fluorescens Mikroskop kan uppnå realtidsövervakning av MMP via inspelning av fluktuationer i fluorescensintensiteten hos Rh123, men fördelar och brister i båda metoderna måste vara anses vara. Bilderna tagna av confocal laserscanning fluorescens Mikroskop jämfört med vanliga fluorescens Mikroskop, och har högre upplösning och kvalitet. Därför kan mer subcellulär Detaljer visualiseras. Dessutom, minskar det effekterna av de lätta överhörning när flera fluorescens färgämnen används. Därför kan mikroskopet confocal just spela in realtid fluorescens fluktuationer i Rh123 och återspeglar den verkliga cellulära bioaktiviteten. Men våra metoder för att övervaka MMP behöver kontinuerligt inspelning under relativt lång tid och en serie av cellgifter, inklusive enda syre och ROS, kan produceras enligt den laserstrålning leder till cell skador23. Dessutom orsakar hög laser intensitet oftast blekning av fluorescens färgämnen under kontinuerlig skanning24. Däremot gemensamma fluorescens Mikroskop inte kan ta bilder med hög kvalitet som confocal mikroskopet, men det har inte de ovannämnda negativa effekterna och därmed gör lång tid inspelning möjligt. Genom att jämföra våra data från både vanliga fluorescens Mikroskop och confocal Mikroskop, ingen uppenbar skillnad kunde hittas, vilket indikerar att den gemensamma fluorescens mikroskopet är kompetenta nog för övervakning av fluktuationer i MMP, samt kostnadseffektiva och bekvämare dataanalys. HN4 celler seedade på coverslips innan experimentet. Även om polylysine används för att förbättra den cellulära bifogade, leder en bråkdel av celler fortfarande fristående från coverslips och grov operationen till nedskrivning av cellernas viabilitet. Dessutom bör lägga Rh123 eller ATP in i kammaren, vara försiktig att inte röra den kammaren och coverslips.
Förutom Rh123, DioC6, JC-1 och tetrametyl rodamin metylester (TMRM) är fluorescens färgämnen som kan användas för att upptäcka MMP. I stället för realtid inspelning via Mikroskop, kan flödescytometri också utföra denna uppgift. Inspelning i realtid ändringen av fluorescensintensitet med mikroskopet är dock lämpligare att upptäcka den cellulära bioaktiviteten och generera intuitionistisk bilder, ger mer tillförlitliga resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vänligen tacka Mr Chao Fang för cellodling. Detta arbete stöds av bidrag från naturvetenskap Foundation i Kina (Grant nr 81570403, 81371284); Anhui provinsiella naturvetenskap Foundation (Grant No. 1408085MH158); Framstående unga forskare Anhui Medical University; Stödja Program för utmärkt unga talanger i universiteten i Anhui-provinsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
