Summary
Burada mitokondri zar potansiyel (MMP) belirlemek ve CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre apoptosis içinde vitroçalışma rodamine 123 uygulanması için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı değişiklik kaydedildi.
Abstract
(MMP, ΔΨm) mitokondri zar potansiyel tükenmesi apoptotik art arda en erken olay olarak kabul edilir. Hatta kromatin yoğunlaşma ve DNA kırılması gibi nükleer apoptotik özellikleri öncesinde ortaya çıkar. Bir kez MMP çöker, hücre apoptosis geri dönüşümsüz başlatacaktır. Lipofilik katyonik boya bir dizi hücre membran geçmek ve mitokondri matriksi içinde toplamak ve MMP değişiklik değerlendirmek için floresans marker olarak hizmet. Cl- hücre içi kanal (klik) Aile, altı üyelerinden biri hücre apoptotik süreci mitokondrial yolu üzerinden olmak üzere CLIC4 katılmaktadır. Burada rodamine 123 (Rh123), hangi aracılığıyla biz apoptosis CLIC4 nakavt tarafından indüklenen çalışma floresans dalgalanma izleme yoluyla MMP ölçmek için detaylı bir protokol açıklayın. Biz tartışın avantajları ve confocal lazer tarama ve normal floresan mikroskop ayrıntılı uygulama sınırlamaları ve ayrıca diğer yöntemleri ile karşılaştırın.
Introduction
Rh123 transmembran potansiyel bir göstergesi olarak hizmet veren bir katyonik floresans boya var. Rh123 hücre zarı delici ve mitokondrial matris bağlı olarak potansiyel farkı iç ve dış membran1girme yeteneğine sahiptir. Apoptozis mitokondrial membran bütünlüğü zarar yol açar. Mitokondri geçirgenliği geçiş gözenek (MPTP) açın ve sırayla mitokondri dışına Rh123 sürümdeki sonuçları MMP, daraltmak için yol. Son olarak, güçlü yeşil floresans sinyali floresan mikroskop altında tespit edilecektir. MMP ve yükseltilmiş membran geçirgenliği tükenmesi hücre apoptosis2erken ibretler vardır iyi belgelenmiştir. Bu nedenle, Rh123 MMP değişiklik algılanması ve hücre apoptosis oluşumu için uygulanabilir.
Dünyada 6 en yaygın Karsinomu, baş ve boyun kanser ciddi bir kişinin sağlık3bozulur. Her ne kadar pek çok yaklaşım son yıllarda geliştirilen, hastalarda baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) için tedavi klinik sonuçlar hala ideal değil4' tür. Yeni tedavi yöntemleri keşfetmek tedavisi için HNSCC5artırabilirsiniz. İyon kanalları çok sayıda biyolojik süreçlerin içeren farklı kanser6gelişiminde önemli bir rol görüntüler. Kısmi veya toplam katılım Cl- kanalları son derece neoplastik dönüştürme etkin geçiş, yüksek orandaki yayılması ve invasiveness dahil olmak üzere çeşitli özelliklerini ilgili vardır. Bunun ışığında, CLIC, roman protein ailesi, kanser tedavi6,7için tedavi hedefleri gelecek vaat eden bir sınıf olarak listelendi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya CLIC1, CLIC4 ve CLIC5, gibi CLIC ailesinin üyeleri kalp mitokondrial yerelleştirmeniz ve reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesini mitokondrial bulunan Cl işlevsel rolü gösteren upregulated tarafından CLIC5, - kanalları apoptotik yanıt8. CLIC4, bir ailenin üyesi, CLIC (olarak da bilinen mtCLIC, P64H1 ve RS43) en yaygın kanser hücreleri ve hücre altı yerini Golgi, endoplazmik retikulum ve mitokondri içinde insan gibi onun apoptotik düzenleme özellikleri çalışılmıştır keratinositler7,9,10. CLIC4 ifade profil tümör nekrozis faktör-α (TNF-α), P53 ve dış uyarıcı tarafından düzenlenmiş. Overexpression ve CLIC4 downregülasyon esas olarak dengesizlik Bcl-2 aile üyeleri ile caspase art arda sıralı aktivasyonu ve serbest bırakmak-in sitokrom C11, eşliğinde mitokondrial yolu aracılığıyla bir apoptotik yanıt tetikler 12 , 13. bu nedenle, MMP ölçümdür apoptosis CLIC4 ilgili keşfetmek çok önemli ve Rh123 bir ideal floresans göstergesi olarak hizmet vermektedir.
Bu da çalışmanın CLIC4 nakavt kaynaklı apoptosis HN4 hücrelerdeki çalışmaya MMP tespiti için ayrıntılı bir protokolünü açıklar. Rh123 bir floresan sonda MMP değişimi gözlemlemek için kullanılır. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı dalgalanma çözülmüş olabilir. Biz tartışın avantajları ve confocal lazer floresan mikroskop ayrıntılı tarama uygulanması sınırlamaları ve ayrıca diğer yöntemleri ile karşılaştırın. Bu iletişim kuralı da apoptozis ile ilgili diğer çalışmalar için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre kültür ve Transfection
-
Hücre kültürü
Not: Hastaların HNSCC14ile HN4, bir HNSCC hücre kültürünü türetilmiştir.- Dulbecco'nın kültür HN4 hücrelerde % 10 fetal Sığır serum ve antibiyotik (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) ile desteklenmiş kartal Orta (DMEM, 4,5 g/M glikoz) değiştiren. Hücreleri % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
-
Hücre transfection
- Bir gün önce transfection, 5 x 105 hücreleri 2 mL/kültür ortamının de antibiyotik 6-şey plakaları olmadan plaka.
- Yavaşça 100 pmol CLIC4 siRNA veya düşük serum medya, 250 µL şifreli SiRNA oranında seyreltin. 5 µL lipozom reaktif düşük serum medya 250 µL sulandırmak ve 5 dk. birleştirmek ile seyreltilmiş lipozom reaktif seyreltilmiş siRNA kuluçkaya, karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
- Karışımı her de içeren hücreleri ve orta ekleyin. Karışımı yavaşça ileri geri plaka Rock yaparak. CO2 kuluçka Rh123 etiketleme yordamını işlemine devam etmeden önce 24 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Orta transfection sonra normal büyüme orta 4 h ile değiştirin.
2. Rh123 etiketleme
Not: Rh123 HN4 hücreleri1MMP ölçmek için kullanılmıştır.
- CLIC4 siRNA tedavi (Bölüm 1) sonra 6-şey plakaları HN4 hücrelerinde aşağıdaki tedavisi için kullanın. Her HN4 hücrelere miktarı de denemeyi 10 kez coverslips tekrarlamak için yeterlidir.
- Dairesel coverslips yeni 12-şey tabak dibinde koymak için cımbız kullanın. Plaka sayısı deneysel tasarım (Şekil 1A) göre ayarlanmıştır.
- 12-şey tabak içinde her coverslip ortasında 100 µg/mL polylysine 150 µL koyun ve 2 dk. polylysine coverslips dışında koymak için dikkat bekleyin. Polylysine pipettor tarafından iyice Kaldır (Şekil 1B).
- Kültür orta çanağı içinde HN4 hücrelerinin kaldırın ve 1 mL % 0.25 tripsin hücreleri ayırmak için ekleyin. 6 dakika sonra 2 mL kültür orta tripsin nötralize etmek için ekleyin. HN4 hücreleri pipettor tarafından 5 kez ve tohum 2-6 х için 104 hücreleri üzerinde dairesel coverslips karışımı yavaşça. Kuluçka 37 ° c % 5 CO2 (Şekil 1C) yerleştirin.
- 8 h kuluçka sonra 2 µmol/L Rh123 40 dk 37 ° C'de HN4 hücrelerle kuluçkaya Rh123 eşit dağılımı (Şekil 1D) ortamda sağlamak için orta alçalarak birkaç kez karışımı yavaşça.
- Hazırlamak yeterli normal fizyolojik serum çözüm (NPSS); NPSS (mmol/L) yapmak için: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 glikoz ve 5 HEPES, pH 7,4). Bir su banyosu içinde 37 ° c onceden.
- Coverslips kaldırıp kalan yıkamak için cımbız kullanın kısaca yerleştirerek coverslips onceden NPBS belleğe (Şekil 1E) yolu ile sıvı.
- Coverslips 500 µL paslanmaz çelik odası dibinde yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ile değiştirilebilir 25 mm cam coverslip alt kapalı yerinde bir o-ring tarafından. Odası (Şekil 1E) kapak sıkma tarafından tamir.
- 450 µL monte odası NPSS arabelleğe ısıtılmış ve floresan mikroskop veya floresan mikroskop (Şekil 1E) tarama confocal lazer görme alanı altında banyo koymak ekleyin.
3. MMP tespiti
-
Ortak floresans mikroskobu
- Üreticinin yönergelerini izleyerek floresan mikroskop açın.
Not: Bir civa lamba fiberoptik ışık kaynağı, Rh123 için ayarla FITC filtre ile ortak floresan mikroskop gerçekleştirilmiştir (480/40 uyarma filtre, 505 LP Dikroik ayna ve 535/40 emisyon filtre) Oda sıcaklığında. 20 X amaç canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için kullanıldı. - Görüntüleme sistemi yazılımı açın ve yeni bir deneme (Şekil 2A) başlamak için komut çubuğundan "Yeni" düğmesini seçin.
- Görme alanı ve beyaz ışık hücreleri konumunu bulmak için odağı ayarlayın.
- Işıkları kapat ve beyaz ışık kapatmak için düğmeye bas. Komut çubuğunu "Focus" düğmesine basın ve "Start floresans üzerinde geçmek için odaklanan" seçin. Hücreleri tekrar yolu ile mikroskop 507 nm uyarma ve 529 nm uzun pası emisyon konumunu bulmak dalga boyu (deneme önce Set). Görme alanı ve odak (Şekil 2B) gerekirse yeniden ayarlayın.
- Sadece 20-30 ayrı HN4 hücreleri içeren bir görme alanı seçin. Değiştir hücre içi floresans sinyalinin her hücre için doğru bir şekilde kaydedilir.
- Net görme alanı elde sonra odak çubuğundan "odaklanan yakın"'ı tıklatın. "Alma bir" görüntüleri bir dizi elde etmek için komut çubuğunda seçeneğini tıklatın. "Bölgeler" komut çubuğunu tıklatın ve ölçüm bölgeleri düzenlemek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
Not: Bölge Düzenle çubuğu'ndan çalışma bağlı olarak farklı bölge şekiller kullanılabilir. - Tek tek hücreler için farklı şekiller sığdırmak için "İzleme bölgesi" aracını seçin ve bir tek hücre bölge daire ve çift tıkırtı ne zaman tamamlanmak. Tüm hücreleri yordamı (Şekil 2C) Daire yineleyin. "Bitti"'yi tıklatın ve kaydedilmiş konumu bulmak için "görüntüleri Kaydet" seçin.
- Tıklayın "Zeroclock"ve hızlı bir şekilde floresan yoğunluğu değişiklik izlemeye başlamak için F4'e basın. Gerçek zamanlı kayıt değiştirmek floresan yoğunluğu bir kez her 5 s 5 min (Şekil 2D) için.
- Temel istikrarlı olur, 50 ekleyin µL NPSS 100 mmol/l ATP odasına pipettor üzerinden 0.5 µL ile karışık. Görme alanı (Şekil 2E) kaldırma önlemek için odası hatırlıyorum.
Not: Floresan görüntü için 20 dk kaydedilir ve sonra deneme el ile işlem sonunda olabilir. Bekleme süresi rutin için 20 dk tüm incelemek için yerleşmiş floresans değiştir. Ancak, beklenmedik etkileri eğrinin veya tüm süreç az 20 dk sürer istikrar etkisi yakalamayı durdurmak için el ile işlem uygulanır.
- Üreticinin yönergelerini izleyerek floresan mikroskop açın.
-
Confocal lazer tarama floresans mikroskobu
- Üreticinin yönergelerini izleyerek floresans mikroskobu tarama confocal lazer açmak ve bohça bilgisayar yazılımı açın.
Not: Burada, Rh123 488 ayarla bir Argon lazer tarafından heyecan duymuştur nm ve verilmiş sinyal 545-700 nm TD488/543/633 filtre uygulanması yoluyla aralığı boyunca kaydedildi. - 63 X seçmek için "Al" menüsünün altında "Objektif" tıklatın / 1.4 N.A. petrol objektif lens. Numune gözlemlemek ve açık bir görme alanı altında ışık alanını bulun.
- Floresans moduna geçirin ve karanlık yolu ile mikroskop altında hücrenin konumu bulmak için doğru floresan filtre seçmek için "TL/IL" düğmeye bas. "Perde" örnek gözlem bittiği zaman korumak için itin.
- "Ele geçirme" menüsünün altındaki uygun Devresel_ödeme kanal ayarlayın ve "elde" kapatılan optik yol (Şekil 3A) etkinleştirmek için tıklatın. "Yapılandırma" menüsünde'i tıklatın ve "lazer" gerekli lazer türünü belirlemek için seçin. "Argon" Bu Protokolü (Şekil 3B) önerilir.
- "Canlı gerçek zamanlı görüntü almak ve görme alanı sadece 20-30 ayrı HN4 hücreler içerdiğinden emin olun"'yı tıklatın. Değiştir hücre içi floresans sinyalinin her hücre için doğru bir şekilde kaydedilir.
- "Xyt" satın alma modunda (Şekil 3C) "Ele geçirme" menüsü altında "Satın alma" alt menüsünde seçin. 5 s ve 20 dk zaman aralığını ve süresi, anılan sıraya göre ayarlayın. Tıkırtı"Uygula" tüm parametreleri ne zaman yerleşti.
- "Sayabilirsiniz" menüsünün altında kayıt alan her hücrenin etrafında dönmeye "Çoklu çizgi çizmek" aracını kullanın. "Line profili" seçin ve "gözlem yapmak Başlat" ı seçin. Floresan yoğunluğu 5 min (Şekil 3D - E) için gerçek zamanlı değişikliği kaydetmek.
- Temel istikrarlı olur, 50 ekleyin µL NPSS 100 mmol/l ATP odasına pipettor üzerinden 0.5 µL ile karışık. Görme alanı kaldırma önlemek için odası hatırlıyorum.
Not: Floresan görüntü-ecek var olmak yazmak için 20 min ve o zaman deneme tamamlanır.
- Üreticinin yönergelerini izleyerek floresans mikroskobu tarama confocal lazer açmak ve bohça bilgisayar yazılımı açın.
4. istatistiksel analiz
-
Ortak floresans mikroskobu
- Rutin olarak operatörün el kitabı takip floresan mikroskop açın. Görüntüleme sistemi yazılımı açın ve komut çubuğu'ndan kaydedilen bir deney açmak için "Aç" düğmesini seçin. "Komut çubuğu' dan" bölgeleri "'i tıklatın ve ölçüm bölgeleri düzenlemek için"Tamam"düğmesini tıklatın.
- "İzleme bölgesi" aracını seçin ve bir tek hücre bölge daire ve çift tıkırtı ne zaman bitmiş. Tüm hücreleri daire içine kadar yordamı yineleyin. "Bitti"'yi tıklatın ve seçin "F4: ileri" düğmesi floresan yoğunluğu gösterilen bir izleme elde etmek için.
- Bir kez bitmiş, grafiğin sağ alt köşesinde yer alan aşağı ok düğmesini tıklatın ve "Grafik verileri göster" (Şekil 2F) seçeneğini tıklatın. Tıkırtı "OK" iki kere ve veri işleme yazılım arabirimini açmak için "Özellikler" düğmesini seçin. "Günlük verilerini" yeniden tıklatın ve gerçek zamanlı dalgalanma floresan yoğunluğu kayıtları elektronik tabloda görünür bulmak.
Not: her hücre için MMP değişimler floresan yoğunluğu uygulamadan önce ATP veya TG (F1/F0) göreli oranı olarak sergilendi. Her floresan yoğunluğu veri ortalama 20-30 hücre vardı. Ortalama ± SE. 2 grup sonuçlarından bağımsız iki uçlu t testi ve P değeri tarafından test edildi olarak sunulan verilerin Rh123 için < 0,05 istatistiksel anlamlılık olarak kabul. İstatistiksel analiz yazılımı bu deneyde istatistiksel analizler yapmak için uygulandı.
-
Confocal lazer tarama floresans mikroskobu
- Confocal lazer mikroskobunun açmak ve üreticinin yönergeleri izleyerek bohça bilgisayar yazılımı oturum.
- "Yangın" kaydedilen bir deney açmak için seçin.
- "Sayabilirsiniz" menüsü altında "profil yığını" aracını seçin, "Hepsi bir arada" seçim "Sıralama grafikler kanalları ve ROIs."
- "Çiz Çokgen" aracı daire hücre bölgeleri için gözlem için kullanın.
- "Grafik" menüsünü seçin ve farenin sağ düğmesini tıklayın ve "Excel'e aktar" işaretleyin floresan yoğunluğu değerleri bir e-tabloya eklemek için. Aşağıdaki analizi normal floresans mikroskoplar (Şekil 3F) ile tutarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu da çalışmanın, Rh123 MMP algılamak için uygulandı. Başlangıçta, HN4 hücreleri aşağıdaki floresans deneyler boyama için kültürlü. Cımbız 6-şey tabak (Şekil 1A) altta dairesel coverslips koymak için kullanılmıştır. Coverslips polylysine 5 min için ile kaplı ve daha sonra polylysine pipettor (Şekil 1B) yolu ile kaldırıldı. O zaman HN4 hücreleri trypsinized ve 6-şey levha altına yerleştirilir coverslips numaralı seribaşı. Rh123 uygun miktarda daha sonra eklendi ve karışık iyi (Şekil 1C-D). Önceden ısıtılmış NPSS ile yıkadıktan sonra coverslip görüş odasına toplandı. NPSS uygun miktarda aşağıdaki deneme (Şekil 1E) için eklendi.
Rh123 boyama işlemden sonra ortak floresans mikroskobu ve confocal mikroskop farklı adımlar ve yazılım gerçek zamanlı Rh123 floresan kaydetmek için kullanılmıştır. Ortak floresan mikroskop için görüntüleme yazılımı yeni bir deneme oluşturmak için açıldı. Yeşil floresan ışık göstermek için objektif kapağı açıldı ve odak ve konum uygun bir görme alanı elde etmek için ayarlandı. Bir hücre resim çektikten sonra şekil izleme araçları her tek hücre bölge çizmek ve floresan değişikliği kaydetmek için kullanılmıştır. Temel kararlı olunca, ATP mitokondri zar depolarizasyon tetiklemek için odasına eklendi. Confocal lazer floresans mikroskobu tarama denemede bohça bilgisayar yazılımı açıldı ve uygun bir optik yol kurulmuştur. Argon ışık kaynağı seçildi sonra odak ve hücre şekil ekranda net görüntü elde etmek için odası konumunu ayarlanabilir. "Xyt" tarama modu seçildi ve "Çiz Çokgen" aracı floresan değişimi her tek hücrede bulunan kaydetmek için hücre bölge daire uygulanır. Ham verileri çözümlemek üzere, F0 floresan yoğunluğu ATP uygulamadan önce değerini ve F1 floresan yoğunluğu maksimum değerini ATP uygulamadan sonra oldu. F1/F0 mitokondri zar depolarizasyon (Şekil 2 ve Şekil 3) değerlendirmek için kullanıldı. Şekil 4B ve Şekil 5B, floresan yoğunluğu seviyelerini ATP ve temel azalmış geri tedaviden sonra yaklaşık 10 dk. Şekil 4C ve Şekil 5C aşağıdaki yüksek açıkça Rh123 floresan yoğunluğu zirvesine CLIC4 siRNA tedavi altında grubunda kontrol grubunda daha yüksek olduğunu gösteriyor. Şekil 4 A ve Şekil 5A gösteri temsilcisi görüntüleri her aşamasında floresan değişimin. Ortak floresans mikroskobu ile karşılaştırıldığında, confocal mikroskop hücre çekirdeği ve mitokondri gösterilen görüntünün daha yüksek bir kalite elde. Ancak, iki yöntem verileri karşılaştırırken, hiçbir önemli farklılıklar bulundu. Sonuçlar floresan ve confocal mikroskop gelişmiş CLIC4 mitokondri zar ATP kaynaklı depolarizasyon HN4 hücrelerinde (Şekil 4 ve Şekil 5) Bu nakavt gösterdi.
Resim 1 . Rh123 etiketleme. (A)cımbız dairesel coverslips 6-şey tabak dibinde koymak için kullanılmıştır. (B) kaplama coverslips ile polylysine yolu ile pipettor 5 dk ve nihayet emme tekrar polylysine kaldırmak için pipettor içine için. 6-iyi tabak dibinde coverslips üzerinde numaralı seribaşı hücreleri (C) HN4. (D) Rh123 uygun bir miktar ekleniyor ve iyi karıştırma. (E) coverslips önceden ısıtılmış NPP ile yıkama ve NPSS uygun miktarda aşağıdaki deney odası montajı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Rh123 floresan gerçek zamanlı dalgalanma tarafından ortak floresan mikroskop izlemek için adımları. (A)açık yeni bir deneme. (B) odaklanarak başlamak ve floresan altında uygun bir görme alanı seçin. (C) kullanma "Bölgeler" gözlem bölgeleri düzenlemek için komut çubuğu aracı. (D) "Sıfır saat" tıklayın ve hızlı bir şekilde floresan yoğunluğu değişiklik izlemeye başlamak için F4'e basın. (E) ekleyerek ATP (100 µmol/temel kararlı olduktan sonra mitokondri zar depolarizasyon tetiklemek için M). (F) deney tamamlandıktan sonra verileri vermek için grafiğin sağ alt köşesinde bulunan aşağı oku tıklatın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Floresans mikroskobu tarama confocal lazerle Rh123 floresan gerçek zamanlı dalgalanma izlenecek adımlar. (A)Select Devresel_ödeme kanal ve küme uygun dalga boyu aralığı "Ele geçirme" menüsü altında. (B) "Geçerli kullanılabilir lazer" doğru lazer türünden seçin ve gücünü ayarlayın. (C) "modu gözlemleyerek xyt" seçin ve bir dizi kayıt parametreleri ayarlayın. (D) "Sıralama grafikler kanalları ve ROIs." Araçlar "Yığın profil" ve "All in One" seçim (E) kullanım aracı "Çiz Çokgen" Daire hücre bölgesi için gerçek zamanlı veri için. (F) Floresan yoğunluğu değerleri veri işleme yazılımı için vermek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Mitokondri zar ATP kaynaklı depolarizasyon CLIC4 nakavt etkisi çözüldü tarafından HN4 hücreleri ortak floresans mikroskobu. (A)temsilcisi Rh123. temsilcisi izlemeler (B) ve özetlenmiş veriler (C) ATP gösteren floresans dalgalanma görüntülerini (100 µmol/L)-HN4 hücre MMP değişimler indüklenen. Potansiyel zarda değişiklik öncesi ve sonrası ATP uygulanması floresan yoğunluğu oranı tarafından belirtilmiştir. Oranı artış membran potansiyeli depolarizasyon temsil eder. HN4 hücre CLIC4siRNA ile transfected (CLIC4 siRNA) veya şifreli siRNA (Con siRNA). Değerleri ortalama ± SEM n gösterilir = 5. P < 0,05 kontrol (Con siRNA) grubu vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Mitokondri zar ATP kaynaklı depolarizasyon confocal lazer HN4 hücreleri Floresan Mikroskobu tarama tarafından çözüldü CLIC4 nakavt etkisi. (A)temsilcisi Rh123. temsilcisi izlemeler (B) ve özetlenmiş veriler (C) ATP gösteren floresans dalgalanma görüntülerini (100 µmol/L)-HN4 hücre MMP değişimler indüklenen. Potansiyel zarda değişiklik öncesi ve sonrası ATP uygulanması floresan yoğunluğu oranı tarafından belirtilmiştir. Oranı artış membran potansiyeli depolarizasyon temsil eder. HN4 hücre CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) ile transfected veya siRNA (Con siRNA) şifreli. Değerleri ortalama ± SEM n gösterilir = 5. P < 0,05 kontrol (Con siRNA) grubu vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cl− kanalları iç ortam hemostaz sürdürmek için gerekli olan ve hücre proliferasyonu ve Apoptozis15,16önemli rollerde oynamak iyi belgelenmiş. Bu nedenle, iyon kanal hedefli müdahale ve Apoptozis ilişkisi büyük ihtiyaç ve önemi bir daha iyi tedavi yaklaşımı çeşitli kanserlerin17için bulmak için en önemli noktadır. Mitokondri bir hücre normal biyolojik durumunu korumak ve onun fonksiyonu son derece onun membran geçirgenliği ve transmembran potansiyeli ile ilgilidir. Kanser dışında biriken neuropathological araştırmalar mitokondrial bozuklukları myopathy, kardiyovasküler hastalık ve sensorinöral sağırlık, serebellar ataksi, demans gibi nörolojik belirtiler katkıda belgeledi ve epilepsi18,19. Tüm bunlar mitokondrial hedefli müdahale ile hangi klinik tedavi iyileştirmek araştırmada mahmuzlu. Rh123, bir mitokondri hedefli floresans boya, hücre zarı ve hizmet MMP algılamak için bir evrensel floresans sonda nüfuz. Hücre apoptosis erken eyaletinde MPTP açılışı dışında mitokondri yayımlanması Rh123 izin mitokondrial membran geçirgenliği yükseltir ve daha güçlü yeşil floresans sinyal son olarak algılanabilir. Bu durum altında ikili iyonları serbestçe dağıtmak ve elektron taşıma zinciri ayırımı neden MMP hızlı damla kurşun ve ciddi etkiler normal enerji kaynağı hücre ATP üretimi azalmıştır. Ayrıca, pro-apoptotik biyoaktif bileşiklerin Cyt C, faktör, apoptotik proteaz aktive faktör-1 ve ROS ve sonunda götürmek-e doğru geri dönüşü olmayan apoptosis20,21 inducing apoptosis dahil olmak üzere çıkış MPTP açılışı tetikler .
ATP mitokondri zar depolarizasyon Rh123 yükseltilmiş floresans tarafından gösterildiği gibi neden olabilir. Farklı tedaviler altında hücrelerinin mitokondri zar ATP kaynaklı depolarizasyon karşılaştırarak, mitokondri ve derecesi ve devlet apoptosis22değişimin biyolojik işlev deşifre mümkündür. Ortak floresans mikroskobu ve confocal lazer floresans mikroskobu tarama gerçek zamanlı MMP izleme Rh123 floresan yoğunluğu dalgalanma kayıt yoluyla elde edebilirsiniz, ama avantajları ve her iki yöntem de eksikliklerin olması gerekir kabul. Ortak floresans mikroskobu ile karşılaştırıldığında, floresans mikroskobu tarama confocal lazer tarafından yakalanan görüntüleri daha yüksek çözünürlüğü ve kalitesi var. Bu nedenle, daha fazla hücre altı ayrıntılar görüntülenir. Ayrıca, birden çok floresan boyalar kullanıldığında hafif çapraz-hadis etkileri azalır. Bu nedenle, confocal mikroskop tam olarak Rh123 gerçek zamanlı floresans dalgalanma kaydedebilir ve gerçek hücresel bioactivity yansıtır. Ancak, bizim yöntemleri MMP izlemek için sürekli olarak göreli uzun bir süre için kayıt gerekir ve Sitotoksin tek oksijen ve ROS, dahil olmak üzere, bir dizi hücre hasarı23için önde gelen lazer radyasyon altında üretilen. Ayrıca, yüksek lazer yoğunluğu genellikle floresan boyalar solma sürekli tarama24sırasında neden olur. Buna karşılık, ortak floresan mikroskop confocal mikroskop gibi yüksek kalitede görüntüler kabul edemem, ama yukarıda belirtilen olumsuz etkisi bulunmamaktadır ve böylece uzun zaman yazmak mümkün kılar. Ortak floresans mikroskobu ve confocal mikroskop bizim verileri karşılaştırarak, hiçbir belirgin fark, ortak floresan mikroskop MMP, dalgalanma izlemek için yetkili olduğunu gösterir-ebil bulunmak gibi maliyet-etkin ve daha uygun veri analizi. HN4 hücre coverslips deneme önce seribaşı. Polylysine hücresel eki geliştirmek için uygulanan rağmen hala coverslips ve kaba operasyon ilişkisi kesildi hücreleri küçük bir kısmı hücre canlılığı bozulma yol açar. Ayrıca, Rh123 veya ATP odanın içine ekleme, Oda ve coverslips dokunmamaya özen gösterilmelidir.
Rh123, DioC6, JC-1 ve tetramethyl rodamine metil ester (TMRM) yanı sıra MMP algılamak için kullanılan floresan boyalar vardır. Mikroskop üzerinden gerçek zamanlı kayıt yerine akış sitometresi da bu görevi gerçekleştirebilirsiniz. Ancak, floresan yoğunluğu gerçek zamanlı değişiklik mikroskopla kayıt hücresel bioactivity keşfetmek ve daha güvenilir sonuçlar veren Sezgici görüntüler oluşturmak daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Lütfen Bay Chao Fang hücre kültürü için teşekkür ederiz. Bu eser hibe Çin doğal Bilim Vakfı (Grant No 81570403, 81371284); tarafından desteklenen Anhui il doğal Bilim Vakfı (Grant No. 1408085MH158); Anhui Tıp Üniversitesi üstün genç araştırmacı; Program Anhui eyaleti üniversitelerde mükemmel genç yetenekleri için destek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
