Genetics

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/56318

Ashley H. Ramsawhook*¹, Lara C. Lewis*¹, Maria Eleftheriou¹, Abdulkadir Abakir¹, Paulina Durczak¹, Robert Markus², Seema Rajani², Nicholas R.F. Hannan¹, Beth Coyle³, Alexey Ruzov¹

¹Division of Cancer and Stem Cells, School of Medicine, Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, ²School of Life Sciences Imaging (SLIM), School of Life Sciences, University of Nottingham, ³Children's Brain Tumour Research Centre, School of Medicine, QMC, University of Nottingham

* These authors contributed equally

Summary

5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) और 5-carboxylcytosine (5caC) के नए ऑक्सीकरण रूपों की खोज अद्वितीय कार्यात्मक भूमिकाओं के साथ अलग डीएनए संशोधनों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । यहां oxi के दृश्य के लिए एक अर्द्ध मात्रात्मक कार्यप्रवाह-mCs ' स्थानिक वितरण, संकेत तीव्रता रूपरेखा और colocalization वर्णित है ।

Abstract

कई दशकों के लिए, 5-methylcytosine (5mC) metazoans में एक कार्यात्मक महत्व के साथ ही डीएनए संशोधन होने लगा है । 5mC के एंजाइमी ऑक्सीकरण की खोज 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) और 5-carboxylcytosine (5caC) के साथ ही N6 जीवों के डीएनए में methyladenine-6mA (कोशिकीय) का पता लगाने के अतिरिक्त डिग्री प्रदान की epigenetic अनुसंधान के लिए जटिलता । प्रयोगात्मक सबूत के एक बढ़ती शरीर के अनुसार, इन उपंयास डीएनए संशोधनों के विभिंन सेलुलर और विकास प्रक्रियाओं में विशिष्ट भूमिका निभा सकता है । महत्वपूर्ण बात, के रूप में इन चिह्नों के कुछ (ई. जी. 5hmC, 5fC और 5caC) प्रदर्शन ऊतक-और विकास के चरण-रीढ़ में विशिष्ट घटना, immunochemistry में डीएनए संशोधनों के स्थानिक वितरण के आकलन की अनुमति एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है विभिंन जैविक संदर्भों । यहां डीएनए संशोधन के अभिकलन विश्लेषण के लिए तरीके फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा immunostaining द्वारा visualized वर्णित हैं । विशेष रूप से, २.५ आयाम (2.5 d) संकेत तीव्रता भूखंडों की पीढ़ी, सिग्नल तीव्रता प्रोफाइल, एकाधिक कोशिकाओं और संकेत colocalization गुणांक के निर्धारण में दाग तीव्रता के ठहराव दिखाई जाती हैं । सामूहिक रूप से, इन तकनीकों के स्तर और नाभिक में इन डीएनए संशोधनों के स्थानीयकरण, metazoans में उनके जैविक भूमिकाओं elucidating योगदान का मूल्यांकन में कार्यरत हो सकता है ।

Introduction

डीएनए मिथाइल, transcriptional विनियमन के साथ जुड़े एक अच्छी तरह से प्रलेखित तंत्र 5 के लिए एक मिथाइल समूह के अलावा के माध्यम से एक 5 '-cytosine-फॉस्फेट-guanine-3 ' (CpG) dinucleotide संदर्भ में cytosine अवशेषों के संशोधन पर जोर देता है (-CH₃) cytosine न्यूक्लियोटाइड रिंग के कार्बन एटम 5-methylcytosine (5mC)¹बनाने के लिए । स्तनधारियों में, CpGs के लगभग ७०% मिथाइलयुक्त जो अपने जीनोम के केवल 1% का गठन कर रहे है के रूप में वे 5mC mutagenic प्रवृत्ति के कारण इस palindromic अनुक्रम के समाप्त कर रहे है अनायास deaminate करने के लिए thymine²। जीन प्रवर्तक अनुक्रम पर मिथाइल समूहों की उपस्थिति रीढ़³^,⁴^,⁵में transcriptional दमन के साथ मजबूत संबंध दिखाते हैं । इन मिथाइल समूहों के अलावा उच्च संरक्षित डीएनए methyltransferase (DNMT) एंजाइमों DNMT3a, 3 बी और 3L, और DNMT1 जो CpG cytosines में डी नोवो और रखरखाव मिथाइल संदर्भों में क्रमशः⁶संशोधित द्वारा catalyzed है । DNMT3A/बी अभिव्यक्ति भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और epiblast में विकास के दौरान ऊंचा है; लेकिन इसके कम अभिव्यक्ति pluripotent कोशिका वंश के दौरान दैहिक भाग्य के लिए प्रतिबद्धता के बाद मनाया जाता है⁸। कार्यात्मक अतिरेक साझा करने के लिए Whilst, DNMT3a और 3 बी प्रदर्शन ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न, 2 ए के साथ माउस भ्रूण में समान रूप से पता चला, लेकिन बी 1 मुख्य रूप से neuroectoderm और chorionic बाह्यत्वक ऊतकों के लिए अनुवादित⁸.

बँटवारा और अर्धसूत्रीविभाजन¹⁰के दौरान मिथाइल हस्ताक्षरों को विरासत में मिलाया जा सकता है । रखरखाव मिथाइल डबल-कतरा डीएनए¹¹पर hemi-मिथाइलयुक्त palindromes में मौजूदा CpG cytosine अवशेषों के DNMT1 सोल्यूशन संशोधन शामिल है । DNMT1 पुनरावृत्ति पर डीएनए बांधता है¹¹ और फलस्वरूप, सेल साइकिल¹²के एस चरण के दौरान जीनोमिक मिथाइल स्तर शिखर । DNMT1 methylates अनसंशोधित cytosines जिससे नव संश्लेषित डीएनए किस्में भेद, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता को बढ़ावा देने और transcriptional दमन प्रोफाइल बनाए रखने के¹³। hemi-मिथाइलयुक्त डीएनए CpG अनुक्रम की मांयता के माध्यम से, DNMT1 de नोवो मिथाइल उदा लंबे demarcated परमाणु तत्व 1 (Interspersed) के दमन द्वारा मिथाइल LINE1 की स्थापना की पैटर्न का कहना है retrotransposon प्रवर्तकों को अपने संभावित यलो प्रोपेगेशन¹⁴को बाधित करने के लिए । हालांकि रखने hemi-मिथाइलयुक्त डीएनए अधिमानी बाध्यकारी समानता, DNMT1 कर सकते है मिथाइलेट unmethylated CpG द्वीप (CGI) में अनुक्रम DNMT3a/बी^-/ उत्परिवर्ती कोशिकाओं, एक आपात de नोवो मिथाइल भूमिका को पूरा करने¹⁵. इस प्रकार, डीएनए प्रतिकृति¹⁶के अर्द्ध रूढ़िवादी प्रकृति के कारण, रखरखाव मिथाइल ईमानदारी से माता पिता से बेटी सेल¹⁷के लिए दोहराऊंगा मिथाइल हस्ताक्षर कर सकते हैं ।

हालांकि, जीन अभिव्यक्ति के लिए गतिशील संग्राहक के लिए, दमन मिथाइल संशोधन मिट जाना चाहिए, जो निष्क्रिय और सक्रिय मिथाइल तंत्र द्वारा प्राप्त किया जा सकता है¹⁸। dioxygenase प्रोटीन के एक संरक्षित परिवार से संबंधित दस-ग्यारह Translocase (TET) प्रोटीन CpG अवशेषों पर मिथाइल समूहों के चलने ऑक्सीकरण करने में सक्षम हैं¹⁹. ये Tet प्रोटीन, मुताबिक़ टू जे-बेस बाइंडिंग प्रोटीन्स (JBP) में खोजे गए Trypanosome bruceii, पहचान और बाँध संशोधित डीएनए कुर्सियां जैसे 5mC और आक्सीजन इन अवशेषों को 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) और 5- carboxylcytosine (5caC)²⁰. Tet प्रोटीन की सुविधा ऑक्सीकरण 5mC परिणामों के stepwise रूप में मिथाइल से हाइड्रॉक्सिल, carbonyl और carboxylate विन्यास में परिवर्तन, तथापि 5fC और 5caC संशोधनों के 5mC ऑक्सीकरण से सीधे संश्लेषित किया जा सकता है²¹^, ²² ^, ²³ ^, ²⁴.

उनके विनियमन को समझने में TET प्रोटीन गतिविधि के एक जानकारीपूर्ण संकेत वितरण और बहुतायत oxi-मिथाइल-cytosine के निशान का अध्ययन कर रहा है । CpG गरीब प्रवर्तकों पर महत्वपूर्ण 5mC उपस्थिति unmethylated CpG अमीर क्षेत्रों के विपरीत में detectable है, CpG द्वीप के बाद की विशेषता जा रहा है²⁵। ऊतकों के पार, उच्चतम ऊतक विशिष्ट मिथाइल मस्तिष्क में मनाया जाता है, वृषण और रक्त whilst मौखिक म्यूकोसा प्रदर्शन सबसे बड़ी hypomethylation, एक अंतर मिथाइल ऊतक विशिष्ट प्रवर्तकों पर होने वाले पैटर्न का संकेत²⁶.

चुनिंदा मिथाइल/hydroxymethyl डीएनए immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) में संवेदनशील विरोधी 5mC और विरोधी 5hmC एंटीबॉडी का उपयोग करने के माध्यम से, और बाद में उच्च प्रवाह अनुक्रमण, Ficz एट अल. प्रवर्तकों में उच्च 5hmC अधिभोग का प्रदर्शन किया, exons और लाइन-1 retrotransposon अनुक्रम जो माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं²⁷में इन स्थानों पर कम 5mC स्तर के साथ संबंधित. व्युत्क्रम, महानतम 5mC संवर्धन दोहराए उपग्रह अनुक्रम जहां 5hmC उपस्थिति²⁸सीमित था पर मनाया गया । मानव ललाट पालि पर किया अध्ययन मस्तिष्क ऊतक अत्यधिक महत्वपूर्ण 5hmC संवर्धन पता चलता है, चार गुना अधिक माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं²⁸में से । पिछले टिप्पणियों के साथ सामंजस्य में, ललाट पालि ऊतक के उच्च प्रवाह अनुक्रमण 5hmC कम घनत्व CpG प्रवर्तक क्षेत्रों, जीन निकायों के भीतर 35-38% और लगभग 6% अधिभोग में स्थानीयकृत संकेत के 55-59% सचित्र बहुमत intergenic क्षेत्रों. इसके विपरीत, 5mC intergenic क्षेत्रों में समृद्ध था (25-26%) और उच्च जीन निकायों के भीतर (52-55%) लेकिन प्रवर्तक अनुक्रम में कम (22-24%)²⁹। ये अध्ययन भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और दैहिक ऊतक में 5hmC की बहुतायत से संकेत मिलता है, विशेष रूप से मस्तिष्क, लेकिन 5fC और 5caC वितरण पर जांच सीमित हैं ।

दिलचस्प है, हाल ही में eukaryotes में खोज की, स्थिति में adenine अवशेषों के मिथाइल 6 नाइट्रोजन (एन⁶) (6mA) एक जीनोमिक बहुतायत प्रोफ़ाइल 5mC की है कि³⁰के लिए व्युत्क्रम प्रदर्शन । तरल क्रोमैटोग्राफी से टिप्पणियों युग्मित मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री पता चलता है 6mA निरपेक्ष स्तर ज़ेबरा मछली में अतिरिक्त में मौजूद है और सुअर जल्दी भ्रूण के साथ शुक्राणु की तुलना में अपने स्तर (जीनोमिक adenines के ०.००३%) निषेचन पर तेजी से बढ़ रही है, मोरूला विकास के चरण में नुकीला (३३ शुक्राणु से अधिक गुना) और जीनोमिक adenines के ०.००४% के स्थिर राज्य दैहिक स्तर तक पहुंचने³¹। 6mA समृद्ध डीएनए दृश्यों का Immunoprecipitation प्रमुख अधिभोग का प्रदर्शन किया है (लगभग ८०% संवर्धन) दोहराव तत्व क्षेत्रों और transcriptional शुरू साइटों^३२पर इस चिह्न का । ये अवलोकन contextualize और 6mA demethylase की खोज को मान्य करता है-नल etranscriptionally कोशिकाओं में wildtype सक्रिय तत्वों की तुलना में संचित 6mA मध्यस्थता लाइन-1 retrotransposon मुंह प्रदर्शित mbryonic स्टेम कोशिकाओं. ये डेटा 6mA^३३के लिए transcriptional विनियामक फ़ंक्शन सुझाते हैं.

Whilst संयुग्मित जैव रासायनिक बाद डुबकी परख के लिए युग्मित टैग उपस्थिति या ऑक्सीकरण methylcytosine डेरिवेटिव (oxi-mCs) की अनुपस्थिति का संकेत है, वे स्थानिक वितरण या quantifiable इन चिह्नों की जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं^३४^, ^३५. 5hmC और 5caC के संवेदनशील immunochemical डिटेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल हाल ही में^३६विकसित किया गया था. यह fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी आधारित immunostaining स्कैनिंग लेजर फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ युग्मित विधि कोशिकाओं के भीतर इन डीएनए संशोधनों के दृश्य स्थानीयकरण प्रदान करने का अनूठा लाभ के पास, इस प्रकार, व्यक्तिगत सकारात्मक या नकारात्मक इन निशान के विषम उपस्थिति के साथ इसी दाग कोशिकाओं पर जोर । 5hmC और 5caC निरपेक्ष संकेत तीव्रता के रूप में संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा प्रवर्धित अर्द्ध मात्रात्मक व्याख्याओं को सक्षम करने के लिए परिमाण और नाभिक के भीतर इन चिह्नों के पदों जैसे heterochromatic और euchromatic क्षेत्रों के बारे में प्रस्तावित किया जा ^३७ ^, ^३८. यहां फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों की गणना विश्लेषण के लिए एक तकनीक का वर्णन किया गया है । पिक्सेल प्रति विशिष्ट 5hmC और 5caC संकेत चोटियों और नाभिक के भीतर अपने स्थानों को प्रदर्शित करने के लिए 2.5 d स्थानिक वितरण भूखंडों की पीढ़ी का प्रदर्शन किया है । 5hmC और 5caC संकेत तीव्रता प्रोफाइल के हिस्टोग्राम भूखंड चोटियों और गर्त अलग गैर अतिव्यापी चैनलों के रूप में रची जाती है के रूप में इन चिह्नों की बहुतायत में प्रवृत्तियों को स्पष्ट कर सकते हैं । अंत में, colocalization समारोह को लागू करने से, एक दूसरे के संकेत की निकटता की डिग्री और निर्धारित किया जा सकता है इस का एक परिणाम के रूप में, उनके संबंधित जीनोमिक निर्देशांक पहचाना जा सकता है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. फोकल छवियों की पीढ़ी

cytosine के संशोधित रूपों के विश्लेषण के लिए तैयारी में, immunohistochemical & #160 द्वारा वर्णित के रूप में Abakir धुंधला प्रदर्शन; एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > ३४ .
बाहर स्लाइड की इमेजिंग एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर बाहर ले और एक LSM प्रारूप में फ़ाइलों को बचाने के ।
नोट: जब नमूनों के बीच तीव्रता प्रोफाइल की तुलना प्रत्येक चैनल के लिए लेजर शक्ति और लाभ के लिए इस्तेमाल किया मूल्यों छवि विश्लेषण चरण में प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देने के लिए प्रक्रिया लेने के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए.

< p class = "jove_title" > 2. 2.5 d तीव्रता भूखंडों की जनरेशन

सॉफ़्टवेयर खोलें ( उदा. , Zen Black) और select & #39; इमेज प्रोसेसिंग & #39;.
करेंफ़ाइलमेनू पर जाएं और खोलें का चयन करें । संसाधन की आवश्यकता वाली छवि का चयन करें ।
पर क्लिक करें & #39; सभी ग्राफ़िकल नियंत्रण दृश्यमान बनाने के लिए छवि के नीचे सभी & #39 दिखाएं; स्क्रीन के निचले आधे हिस्से में तीन टैब हैं; & #39;D imensions & #39;, & #39;D इसपलए & #39; र & #39; ग्राफ़िक्स & #39;, चय & #39; ग्राफ़िक्स & #39; tab.
1. & #39; आयत & #39; उपकरण का चयन करने के लिए नाभिक/ब्याज के क्षेत्र/
2. Select & #39; कट क्षेत्र & #39; छवि को क्रॉप करने के लिए । यह एक अलग टैब में फसली क्षेत्र के लिए एक नई छवि उत्पन्न करेगा.
3. करेंफ़ाइलमेनू पर जाएं और इस रूप में सहेजें का चयन करें । फ़ाइल को एक नाम दें और इसे किसी LSM या CZI फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
खुला लागेको ( उदा. , Zen Blue) र चय & #39; Zen Desk & #39;.
फ़ाइल का चयन और फ़ाइल मेनू पर क्लिक करके जेन काले से जेन ब्लू को फसली छवि भेजने और जेन २०१२-ब्लू संस्करण के लिए भेजें का चयन करें । इसके बाद संबंधित प्रोग्राम में क्रॉप की गई इमेज ओपन हो जाएगी ।
नोट: ज़ेन Black २०१२ में 2.5 d तीव्रता प्लॉट सुविधा एक साथ एकाधिक चैनल छवियाँ प्रदर्शित नहीं करता है, क्योंकि छवि फ़ाइल स्थानांतरित है ।
टैब का चयन करें बला & #39; 2.5 d & #39;, इस छवि के दृश्य में सक्षम बनाता है 2.5 d. & #39 पर क्लिक करें; सभी ग्राफ़िकल नियंत्रण दृश्यमान बनाने के लिए सभी & #39 दिखाएं;
छवि के बाईं और नीचे करने के लिए स्थित चार ग्रे सलाखों का उपयोग दृश्य सेटिंग्स में परिवर्तन.
नोट: बाएँ हाथ पट्टी, स्क्रीन के शीर्ष = ज़ूम. बाएँ हाथ पट्टी, स्क्रीन के नीचे = धुरी पर छवि बारी. स्क्रीन के नीचे, बाएँ हाथ पट्टी = रोटेशन छवि के. स्क्रीन के नीचे, दाहिने हाथ पट्टी = विस्तार और अनुबंध पैमाने सलाखों ।
सुनिश्चित करें कि रेंडर मोड चयनित सतह के रूप में यह व्यक्तिगत चोटियों का सबसे अच्छा दृश्य देता है ।
प्रतिशत बदलने से ग्रिड दूरी बदल, कम प्रतिशत और प्रत्येक व्यक्ति चोटी परिभाषित ।
2.5 डी छवि को बचाने के लिए, पहले फ़ाइल सूची को दाईं ओर और चित्र के नीचे के धूसर तीर पर क्लिक करके छवि के नीचे छिपाएं 2.5 d भूखंड (next & #39 के लिए; show all & #39;), यह ग्राफिक छवि को भरने के लिए विस्तार करने के लिए अनुमति टैब्स छिपा होगा रोड़ी n. 2.5 d प्लॉट को सेव करने के लिए & #39;P rtsc & #39; कुंजी कुंजीपटल पर दबाएं । यह प्रदर्शन के एक स्क्रीनशॉट पर कब्जा होगा । Microsoft Paint में स्क्रीनशॉट चिपकाएं और सहेजने से पहले छवि क्रॉप करें ।

< p class = "jove_title" > 3. तीव्रता profile

सॉफ़्टवेयर खोलें ( उदा. , Zen Black) और छवि संसाधन का चयन करें ।
करेंफ़ाइलमेनू पर जाएं और खोलें का चयन करें । संसाधन की आवश्यकता वाली छवि का चयन करें ।
के रूप में छवि स्क्रीन पर दिखाई देगा, छवि के बाएं हाथ की ओर टैब का चयन करें बला & #39;P rofile & #39;.
चुनें (टिक) द & #39; Show All & #39s; tab. यह सभी स्वरूपण विकल्पों तक पहुंच सक्षम करेगा ।
स्क्रीन के निचले आधे हिस्से में तीन टैब होते हैं; & #39;D imensions & #39;, & #39;D इसपलए & #39; र & #39;P rofile & #39;; चयन & #39;P rofile & #39; र चयन (टिक) द & #39; पटल & #39; बॉक्स । Select & #39; तीर & #39; बटन.
माउस का उपयोग करने के लिए एक शुरुआत बिंदु का चयन करें और माउस खींचें कोशिकाओं की एक सतत संख्या पर । लाइन के साथ कोशिकाओं के लिए एक तीव्रता भूखंड का उत्पादन करने के लिए माउस छोड़ें; साथ ही तालिका प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए पंक्ति के साथ पिक्सेल के लिए तीव्रता माप डेटा द्वारा पॉपुलेटेड किया जाएगा ।
नोट: टेबल (& #181; m) दूरी प्रदान करेगा जिस पर पिक्सेल तीव्रता लाल, हरे और नीले प्रतिदीप्ति के लिए पढ़ा है ।
इस डेटा को निर्यात करने के लिए, तालिका पर दायां क्लिक करें, & #39 का चयन करें; तालिका सहेजें & #8230; & #39; और एक. txt फ़ाइल के रूप में किसी उपयुक्त स्थान पर सहेजें ।
चयनित तीव्रता प्रोफ़ाइल छवि को सहेजने के लिए फ़ाइल मेनू का चयन करें और & #39; निर्यात & #8230; & #39;. पॉप-अप विंडो में चुनें & #39; tagged इमेज फाइल (Format) & #39; र & #39; छवि विंडो-एकल फलक (डेटा) की सामग्री & #39; इसके बाद क्लिक करके & #39; फ़ाइल नाम का चयन करें और सहेजें & #8230; & #39; कोई उपयुक्त स्थान चुनें और & #39 पर क्लिक करें; save & #39;.
दृष्टिकोण और प्रोफाइल की संख्या के खेतों पर निर्भर करता है प्रत्येक व्यक्ति की तीव्रता प्रोफ़ाइल के लिए प्रक्रिया को दोहराने का विश्लेषण ।
आयात तीव्रता प्रोफाइल डेटा बचाया (३.७ देखें) और एक सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद स्प्रेडशीट में विश्लेषण ।

< p class = "jove_title" > 4. Co-स्थानीयकरण विश्लेषण

खोलें सॉफ़्टवेयर और select & #39; इमेज प्रोसेसिंग & #39;.
करेंफ़ाइलमेनू पर जाएं और खोलें का चयन करें । संसाधन की आवश्यकता वाली छवि का चयन करें ।
के रूप में छवि स्क्रीन पर दिखाई देगा, छवि के बाएं हाथ की ओर टैब का चयन करें बला & #39; Coloc & #39;.
चुनें (टिक) द & #39; Show All & #39s; tab. यह सभी स्वरूपण विकल्पों तक पहुंच सक्षम करेगा ।
स्क्रीन के निचले आधे हिस्से में चार टैब होते हैं; & #39;D imensions & #39;, & #39;D इसपलए & #39;, & #39; ग्रा & #39; व & #39; Colocalization & #39;; चय & #39; Colocalization & #39; और टिक & #39 के लिए बॉक्स; Table & #39; व & #39; Image & #39;.
1. इस टैब के शीर्ष पर साथ तीसरे चिह्न का चयन करें (बंद Bezier पाठ दिखाई देगा जब माउस उपकरण पर मंडराता है) तो इस उपकरण का उपयोग करने के लिए एक एकल नाभिक घेरना, इस नाभिक के लिए मूल्यों फिर तालिका में दिखाई देगा ।
  नोट: के लिए प्रत्येक घेर नाभिक एक तितर बितर भूखंड लाल बनाम हरे प्रतिदीप्ति जो स्क्रीन पर बाएं हाथ पैनल में visualized है के लिए उत्पादन किया है । अक्ष तो क्रम में सीमा के आधार पर बाहर गेट कक्षों के लिए ले जाया जाता है । के रूप में ब्याज की नाभिक छवियों में मैंयुअल रूप से चयनित हैं, शूंय से ऊपर गेटिंग थ्रेसहोल्ड को समायोजित करने की आवश्यकता नहीं है । परमाणु परिधि के भीतर मनाया सभी पिक्सेल तीव्रता मूल्यों सकारात्मक संकेत के रूप में माना जाता है ।
टैब में तीसरे चिह्न का चयन करके और डेटासेट पूर्ण होने तक क्रमिक नाभिक को घेर कर इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
इस डेटा को निर्यात करने के लिए, तालिका पर दायां क्लिक करें, तालिका सहेजें का चयन करें और किसी उपयुक्त स्थान पर सहेजें ।
colocalization छवि को बचाने के लिए, फ़ाइल मेनू का चयन करें और & #39 का चयन करें; निर्यात & #8230; & #39; फिर चुनें; tagged इमेज फाइल (Format) और & #39; इमेज विंडो की सामग्री & #8211; सिंगल प्लेन (Data) & #39; इसके बाद क्लिक करके & #39; फ़ाइल नाम का चयन करें और सहेजें & #8230; & #39;, एक उपयुक्त स्थान चुनें और & #39 पर क्लिक करें; save & #39;.
प्लॉट colocalization डेटा.

Representative Results

इन डीएनए संशोधनों के लिए यकृत progenitors immunostained स्लाइड अंतर में 5hmC और 5caC के स्थानिक वितरण का निर्धारण करने के लिए एक खुर्दबीन का उपयोग कर छवि थे ।

इन oxi-mCs के स्थानिक वितरण का प्रारंभिक विश्लेषण 2.5 d तीव्रता भूखंड (आंकड़ा 1a, 1b) की पीढ़ी के माध्यम से किया गया । लाल और हरे रंग की चोटियों को अच्छी तरह से 5caC और 5hmC संकेतों के केवल एक छोटे से ओवरलैप का संकेत नारंगी चोटियों की सीमित उपस्थिति के साथ परिभाषित किया जा करने के लिए दिखाई दिया । इन परिणामों के साथ समझौते में, 5hmC और 5caC इसी सेल में तीव्रता के लिए प्रोफाइल दृढ़ता से एक दूसरे के साथ मेल नहीं खाता (चित्रा 1C) । यह दिखाता है कि 5caC और 5hmC यकृत progenitors में परमाणु वितरण के विशिष्ट पैटर्न का सुझाव है कि 5mC के Tet-निर्भर ऑक्सीकरण विशिष्ट क्रोमेटिन में इस डीएनए संशोधन के विभिंन ऑक्सीकरण डेरिवेटिव की पीढ़ी के लिए सुराग क्षेत्रों.

Daoy medulloblastoma और BXD-1425EPN ependymoma कोशिकाओं में 5caC और 5hmC के स्तरों की तुलना करना, इन immunostaining के लिए oxi-mCs को समान प्रायोगिक शर्तों के तहत दोनों नमूनों पर किया जाता था. 5caC और 5hmC संकेतों की तीव्रता फिर एक सेल लाइन (चित्रा 2a-2d) के लिए दर्ज 3-5 कोशिकाओं के पार उत्पन्न 20 प्रोफाइल में तुलना की गई । इन परिणामों के ठहराव से पता चला कि BXD-1425EPN कोशिकाओं 5caC कोशिकाओं (चित्रा 2d) की तुलना में दोनों 5hmC और immunostaining Daoy के काफी निचले स्तर का प्रदर्शन.

दो चैनलों लाल (5hmC) और हरे (5caC) जो क्रमशः आर और जी के रूप में चिह्नित जा सकता है पर विचार, पियरसन के सहसंबंध गुणांक (पीसीसी) स्थानिक ओवरलैप और r & #38 के सह-पृथक्करण की डिग्री का वर्णन करता है; जी संभालने दोनों के निशान एक रैखिक में मौजूद एक दूसरे के साथ संबंध, चिह्नित द्वारा R सांख्यिकीय^३४। Squaring पीसीसी मान, चिह्नित द्वारा R² जो लाल संकेत तीव्रता^३४से प्रभावित है हरी संकेत तीव्रता भिन्नता की माप को सक्षम करता है । यह हमारे 5caC बनाम 5hmC सह स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए अनावश्यक है ।

5caC और 5hmC के स्थानिक वितरण की जांच करने के लिए (अंतर) hiPSCs और यकृत अन्तः में प्रेरण के बाद 24 घंटे (HE24), इन डीएनए संशोधनों के colocalization विश्लेषण एक ही फोकल छवियों पर किया जाता था, आर के साथ 20 के लिए मूल्यों नाभिक प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए विश्लेषण किया (चित्र 3-3सी) ।

इन परिणामों के ठहराव दर्शाया गया है कि colocalization की डिग्री काफी उच्चतर है (P & #60; ०.०५) HE24 की तुलना में (चित्र 3सी) । यह 5caC उपस्थिति के कम परिमाण के कारण हो सकता है और इस तरह अपनी कम अंतर कोशिकाओं में संकेत तीव्रता ।

चित्रा 1: Immunohistochemical ७२ घंटे में यकृत अन्तः progenitors के धुंधला भेदभाव के बाद प्रेरण । (क) 5hmC (लाल), 5caC (हरा) और DAPI परमाणु प्रतिवाद दाग (नीला) का सह-दाग. सफेद धराशायी तीर ' बी ' नाभिक के माध्यम से नमूना की रूपरेखा की दिशा का अर्थ है, 1Cमें सचित्र । स्केल बार 5 µm. Red चैनल का प्रतिनिधित्व करता है: लाभ ८००, लेजर 1% । ग्रीन चैनल: लाभ ७५०, लेजर २.४% । DAPI चैनल: लाभ ७५०, लेजर २.६% । (ख) 5hmC, 5caC और DAPI संकेतों के 2.5 डी तीव्रता भूखंड । व्यक्तिगत चोटियों प्रत्येक पिक्सेल के निरपेक्ष संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं । मर्ज किए गए दृश्य और व्यक्तिगत चैनल दिखाए जाते हैं । (ग) ७२ घंटे में यकृत progenitors में 5hmC, 5caC और DAPI संकेतों की तीव्रता प्रोफाइल भेदभाव के बाद प्रेरण । पीक तीव्रता सफेद धराशायी तीर ' बी ' के आयामों के साथ दर्ज किया गया है और एक काला धराशायी तीर द्वारा गहनता प्रोफ़ाइल x-अक्ष के साथ संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 2:5hmC और 5caC संकेत का विश्लेषण Daoy medulloblastoma और BXD-1425EPN ependymoma सेल लाइनों में तीव्रता । (क) Daoy और BXD-1425EPN कोशिकाओं में 5hmC (लाल) और 5caC (हरा) का Immunofluorescent दाग. छवियां 63x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ कब्जा कर लिया, दोनों एक ही सेटिंग्स में थे । मर्ज किए गए दृश्य और व्यक्तिगत चैनल दिखाए जाते हैं । स्केल बार्स 10 µm. Red चैनल: लाभ ७४६, लेजर 1% का प्रतिनिधित्व करते हैं । ग्रीन चैनल: लाभ ७५०, लेजर २.४% । वैयक्तिक (ख) Daoy और (ग) BXD-1425EPN कोशिकाओं को निकटवर्ती आंकड़ों में विस्तारित किया जाता है. (B) और (C) के लिए स्केल पट्टियां 5 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (D) Daoy और BXD-1425EPN कक्षों (n = 20, SD) में 5hmC बनाम 5caC संकेतों की प्रतिदीप्ति तीव्रता का अर्थ है । एक एफ परीक्षण और दो नमूने टी परीक्षण का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था । तारांकन चिह्न का सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण p-मान निरूपित करते हैं * * के रूप में p & #60; ०.०१ और * * * के रूप में p & #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3:5hmC के Colocalization विश्लेषण और 5caC निरपेक्ष संकेतों में विभेदित hiPSCs (अंतर) यकृत अन्तः की तुलना में 24 घंटे के बाद विभेदित जनक कोशिकाओं (HE24). (क) विभेदित hiPSCs और (ख) HE24 कोशिकाओं 5hmC (लाल), 5caC (हरा) और DAPI (नीला) के लिए दाग की फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां । कोशिकाओं 63X तेल विसर्जन लेंस के साथ समान सेटिंग्स में imaged थे । 20 घेर लिया नाभिक कोशिकाओं colocalization विश्लेषण के लिए नमूना वर्णन । स्केल बार्स 20 µm. Red चैनल: लाभ ८००, लेजर 1% का प्रतिनिधित्व करते हैं । ग्रीन चैनल: लाभ ७५०, लेजर २.४% । DAPI चैनल: लाभ ७५०, लेजर २.६% । (C) Colocalization और HE24 (n = 20, SD) में 5hmC निकटता की सीमा के भीतर 5caC संकेत की उपस्थिति का विश्लेषण । F-परीक्षण और दो-नमूना t-परीक्षण का उपयोग करके माहात्म्य का मूल्यांकन किया गया था । तारांकन चिह्न का सांख्यिकीय रूप से महत् वपूर्ण p-मानों को निरूपित करते हैं * p & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल नाभिक भीतर डीएनए संशोधनों के दृश्य निरूपण पैदा करने की stepwise प्रक्रिया का वर्णन । संवेदनशील और प्रभावित Whilst, इन तकनीकों सीमाओं के एक नंबर के अधिकारी हैं ।

यह जोर देना आवश्यक है कि 2.5 डी भूखंडों से उत्पन्न डेटा, सिग्नल तीव्रता प्रोफाइल और colocalization विश्लेषण प्रकृति में अर्द्ध मात्रात्मक होते हैं. लेजर फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि अधिग्रहण के दौरान नमूना के बिंदु रोशनी से बिंदु के कारण, प्रत्येक चैनल के निरपेक्ष संकेत तीव्रता दर्ज कर रहे हैं. हालांकि, इन 5hmC और 5caC का पूर्ण परिमाण का पता लगाया जा रहा है और केवल उपस्थिति, अनुपस्थिति या इन epigenetic के निशान के पैमाने के संकेत का प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं ।

संकेत प्रवर्धन की दोहराव प्रकृति के कारण, इस संकेत को बढ़ाने के लिए लागू की गई मशीनरी के परिमाण के अनुरूप सीमाओं को अनिवार्य रूप से इन चिह्नों के सही शारीरिक जीनोमिक अधिभोग के संनिकटन^३४ इन चिह्नों के सच जीनोमिक स्थानीयकरण इन भारी प्रोटीन, जो शारीरिक रूप से 200-300 एनएम^३४के इष्टतम फोकल संकल्प सीमा पर भी अचल क्षेत्रों पर कब्जा द्वारा अस्पष्ट हो सकता है । इसके अलावा, प्रत्येक चिह्न के लिए व्यक्तिगत चैनलों के संकेत तीव्रता एंटीबॉडी संवेदनशीलता और fluorophore विकार^३४में अंतर के कारण एक दूसरे से तुलना नहीं की जा सकती । हालांकि इमेजिंग के साथ प्राप्त जानकारी जीनोमिक के निशान के स्थानिक और लौकिक संगठन पर प्रकाश डालता है ।

5hmC और 5caC संकेतों के सटीक quantitation के लिए, नाभिक को हाइलाइट किया जाता है और DAPI counterstain के खिलाफ घेर दिया जाता है, स्पष्ट रूप से इस क्षेत्र को demarcating है । इस प्रक्रिया गेटिंग थ्रेसहोल्ड के रूप में पृष्ठभूमि शोर नाभिक¹का चयन की मैनुअल प्रक्रिया के माध्यम से अवहेलना की है के रूप में जांच के लिए आवश्यकता के साथ तिरस्कृत. इस प्रक्रिया का एक स्वचालन नवीनतम सॉफ्टवेयर है जो परमाणु विभाजन के लिए अनुमति देता है में प्राप्त किया जा सकता है प्रदर्शन किया जाएगा । Whilst नि: शुल्क वैकल्पिक सॉफ्टवेयर पैकेज जैसे फिजी colocalization विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं, ऐसी आवश्यकता के रूप में कमियां द्विआधारी 8 बिट प्रारूपों के लिए छवियों को बदलने के लिए, छवियों मास्किंग और आकार अपवर्जन डेटा डालने के लिए ब्याज सीमा के क्षेत्रों का चयन करें उपयोगकर्ता-इस कार्यक्रम की पहुंच । इसके अतिरिक्त, euchromatic क्षेत्रों में अपने प्रमुख स्थान के साथ मिलकर जीनोम में 5hmC और 5caC के समग्र सीमित स्तर पर विचार और, सामांय में जीनोमिक CpG दृश्यों की कमी, नाभिक के मैनुअल घेरना उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह परिचय । इसलिए, नाभिक के हाइलाइटिंग स्वचालित रूप से सभी घटनाओं demarcated क्षेत्र के भीतर होने वाले सकारात्मक और किसी भी पृष्ठभूमि पिक्सेल जो मौजूद हो सकता है उपेक्षा करता है मानता है । इस प्रकार, पिक्सेल तीव्रता के आधार पर छवियों का विश्लेषण और अधिक सार्थक हो सकता है । इन कारकों महत्वपूर्ण है जब मांडर के colocalization गुणांक के उपयोग के लिए दो संकेतों के बीच स्थानिक ओवरलैप की डिग्री का विश्लेषण पर विचार कर रहे हैं, चाहे उनके संकेत तीव्रता के रूप में पियरसन सहसंबंध गुणांक है जो एक मान के विरोध के रूप में संकेतों के बीच रेखीय संबंध.

कुल मिलाकर, यहां उल्लिखित तकनीकों एक सहज ज्ञान युक्त प्रारूप में जैविक डेटा के दृश्य प्रतिनिधित्व के विषय ले । Whilst अर्द्ध मात्रात्मक छवि विश्लेषण जैसे जन स्पेक्ट्रोमेट्री संवेदनशीलता या एकल आधार संकल्प जीनोम व्यापक अनुक्रमण के संदर्भ में शक्तिशाली तकनीकों का स्थान नहीं कर सकते, यह पूरक प्रदान करता है निष्कर्ष और परिकल्पनाओं की अनुमति डेटा परिशुद्धता के साथ छवियों के विश्लेषण से कल्पना की ।

Disclosures

हित का कोई संभावित विरोध प्रकट नहीं किया गया ।

Acknowledgments

काम जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था [BB/N005759/1 करने के लिए A.R.] । NRFH Rosetrees यास द्वारा वित्त पोषित किया गया और Stoneygate यास [A1130/M546] । जीस Elyra PS .1 माइक्रोस्कोप, प्रसंस्करण कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर BBSRC BB/L013827/1 द्वारा वित्त पोषित किया गया (नॉटिंघम विश्वविद्यालय अनुदान पर Multidisciplinary सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी सुविधा)

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head	Zeiss	NA
Zeiss Zen Black 2012	Zeiss	NA
Zen Blue 2012	Zeiss	NA
Microsoft Excel	Microsoft	NA