Summary
5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.
Abstract
몇 십년 동안 5-methylcytosine (5mC) metazoans에 기능적 의미와 함께 유일한 DNA 수정 될 생각 되었다. 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxylcytosine (5caC)의 효소 산화 N6-methyladenine (6mA) 다세포 생물의 DNA에서의 검색의 검색의 추가 제공 후 성적인 연구를 복잡성입니다. 실험적 증거의 성장 시체에 따르면 이러한 소설 DNA 수정 다른 셀룰러 및 개발 프로세스에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. Immunochemistry에 DNA 개조의 공간 분포의 평가 허용 하는 중요 한 도구를 대표 하는 중요 한 것은, 이러한 표시 (e. g. 5hmC, 5 fC와 5caC) 전시 조직-및 척추 동물, 발달 단계-특정 발생의 일부 다른 생물학 문맥입니다. 여기 DNA 수정 immunostaining 뒤에 confocal 현미경 검사 법에 의해 시각의 계산 분석에 대 한 방법은 설명 합니다. 특히, 2.5 차원 (2.5 D)의 신호 강도 플롯, 신호 강도 프로필, 여러 셀에 신호 colocalization 계수의 강렬을 얼룩이 지기의 부 량 표시 됩니다. 샨 다, 이러한 기술 평가 수준 및 이러한 DNA 수정 elucidating metazoans에 그들의 생물학 역할에 기여 하는 핵에의 지역화에 있을 수 있습니다.
Introduction
DNA 메 틸 화, 문서화 메커니즘 transcriptional 규제와 관련 된 임무는 5'-시 토 신-인산 염-구 아닌-3 시 토 신 잔류물의 수정 ' 메 틸 그룹의 추가 통해 (CpG) 디뉴클레오티드 컨텍스트 (-CH3) 5- 5-methylcytosine (5mC)1를 시 토 신 pyrimidine 링의 탄소 원자. 포유류에서 약 70%의 cpgs 내 겠은 thymine2를 자발적으로 deaminate를 5mC 돌연변이 성향 때문이 갑자기 시퀀스의 고갈로 그들의 게놈의 1%를 창설 하 갠. 유전자 발기인 순서에 메 틸 그룹의 존재는 척추3,,45에 transcriptional 억제로 강한 상관 관계를 표시 합니다. 이 메 틸 그룹의 추가 높은 보존 DNA methyltransferase (DNMT) 효소 DNMT3a, 3b 및 3 L, 그리고 각각 드 노 보 및 유지 보수 메 틸 화 문맥에서 CpG cytosines 수정 DNMT1 촉매는6. 배아 줄기 세포와 epiblast; 개발 중 DNMT3A/B 식 상승 그러나 그것의 감소 식 만능 세포 계보 하겠다는 체세포 운명 차별화8동안 다음과 같은 관찰 됩니다. 기능 중복을 공유 하는 동안 DNMT3a와 3b 표시 조직 특정 식 패턴, 3a 마우스 배아에 균일 하 게 감지 하지만 주로 neuroectoderm와 chorionic ectoderm 조직8지역화 3b.
메 틸 화 서명 유사 분열, 감수 분열10동안 상속 될 수 있습니다. 유지 보수 메 틸 화는 이중 가닥 DNA11반의 갠 palindromes에 존재 하는 CpG 시 토 신 잔류물의 촉진 DNMT1 수정을 포함 됩니다. DNMT1 바인드 DNA 복제 포크11 하 고 따라서, 게놈 메 틸 화 세포 주기12의 S 단계 피크 레벨. DNMT1 methylates 수정된 cytosines 그로 인하여 새로 합성된 DNA 가닥을 구별, x 염색체 비활성화 홍보 및 transcriptional 억제 프로필13유지. Hemi 갠 DNA CpG 시퀀스의 인식를 통해 DNMT1 de novo 메 틸 화 예 의 억압 긴 Interspersed 핵 요소 1 (LINE1)로 구분 하는 메 틸 화의 설립된 패턴 유지 그것의 잠재적으로 발암 성 전파14를 억제 하기 위해 retrotransposon 발기인. 비록 hemi 갠 DNA 우선 바인딩 선호도 보유, DNMT1 수 methylate unmethylated CpG 섬 (CGI) 시퀀스 DNMT3a/b -/- 돌연변이 세포, 긴급 de novo 메 틸 화 역할15 이루고 . 따라서 DNA 복제16의 반 보수적인 성격으로 인하여 유지 보수 메 틸 수 충실 하 게 정리 딸 셀17부모에서 메 틸 화 서명.
그러나, 유전자에 대 한 수 동적으로 변조, 억압 적인 메 틸 화 수정 식 해야 합니다 삭제는 수동 및 활성 demethylation 메커니즘18에 의해 달성 될 수 있다. 10-11 Translocase (TET) 단백질 dioxygenase 단백질의 보존된 가족에 속하는 소비재 잔류물19에 메 틸 그룹의 반복 산화 할 수 있다. 이러한 Tet 단백질, J 자료 바인딩 단백질 (JBP) Trypanosome bruceii에서 발견 된 동종 인식 및 수정된 DNA 바인딩 예 5mC 기초 및 산소 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-이러한 잔류물 carboxylcytosine (5caC)20. 그러나 5 fC와 5caC 수정 5mC 산화21, 에서 직접 합성 수 있습니다 Tet 단백질 5mC 결과 수 산 기, 생성, 카복실산 구성, 메 틸에서 단계적 구조 변경에서의 산화 촉진 22 , 23 , 24.
그들의 규칙을 이해 TET 단백질 활동의 유익한 표시 유통 및 oxi-메 틸-시 토 신 마크의 공부입니다. CpG 가난한 발기인에서 중요 한 5mC 존재 unmethylated CpG 풍부한 지역 달리 감지, 후자 되 고 포장 소비재의 제도25. 조직, 구강 점 막 최고의 hypomethylation 전시 하는 동안 특정 메 틸 화는 뇌, 고환 및 혈액에서 관찰 하는 가장 높은 조직에 걸쳐 조직 특정 발기인26에서 발생 하는 차동 메 틸 화 패턴을 나타냅니다.
중요 한 안티-5mC 및 안티 5hmC 통해 선택적 메 틸/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), 그리고 이후의 높은 처리량 시퀀싱, Ficz 외 항 체 증명 발기인에 높은 5hmC 인 exons 및 마우스 배아에서이 위치에서 감소 5mC 수준 연관-1 retrotransposon 시퀀스 줄기 세포27. 반대로, 가장 큰 5mC 농축 5hmC 존재가 제한 된28반복적인 위성 시퀀스에서 관찰 되었다. 인간의 전 두 엽 뇌 조직에서 수행 하는 연구는 매우 중요 한 5hmC 농축, 마우스 배아 줄기 세포28보다 4 배 공개. 이전 관찰과 일치에서 5hmC 신호의 전 두 엽 조직 그림 대부분 55-59%의 높은 처리량 연속에 지역화 저밀도 포장 소비재 발기인 지구 유전자 시체와 intergenic에서 약 6% 인 35-38% 영역입니다. 반면, 5mC intergenic 지역 (25-26%)와 높은 유전자 시체 (52-55%) 내에서 농축 했다 하지만 감소 (22-24%)에 발기인 순서29. 그러나이 연구 조사 5 fC와 5caC 배포판에 제한 된다 배아 줄기 세포와 체세포 조직, 특히 뇌, 5hmC의 풍부한을 나타냅니다.
흥미롭게도, 진핵생물, 위치 6 질소 (N6)에서 아데닌 잔류물의 메 틸 화에에서 최근 발견 (6mA) 디스플레이 게놈 풍부한 프로필 5mC30에의 역. 결합 하는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석에서 관찰 얼룩말 물고기와 돼지 초기 배아의 수준 (genomic adenines의 0.003%)와 정자에 비해 초과에서 존재 6mA 절대 수준을 공개 시 수정, 꾸준히 증가 morula 발달 단계 (정자 보다 높은 33 배)에서 정점 그리고 게놈 adenines31의 0.004%의 정상 상태 체세포 수준에 도달. Immunoprecipitation 농축 6mA DNA 시퀀스의 반복적인 요소 지역과 transcriptional 시작 사이트32에이 마크의 우세 인 (약 80% 농축)을 시연 하고있다. 이 관측의 컨텍스트와 6mA demethylase null 전자의 발견을 확인mbryonic 줄기 세포 축적된 6mA 전시 wildtype 셀에 transcriptionally 활성 요소에 비해 선-1 retrotransposon 입을 중재. 이러한 데이터는 6mA33transcriptional 규제 기능을 제안합니다.
그들은 공간 배급 또는 이러한 마크34, 의 정량 정보를 얻으며 수 없습니다 후속 딥 분석을 결합 하는 활용된 생화학 태그 표시 산화 methylcytosine 파생 상품 (oxi mCs)의 유무, 하는 동안 35. 5hmC 및 5caC의 중요 한 토론 검색 프로토콜은 최근에 개발 된36. 스캐닝 레이저 confocal 현미경 검사 법을 이용 하 여 함께이 fluorophore 활용 된 이차 항 체 기반 immunostaining 방법 따라서, 제공 하는 세포 내에서 DNA 수정이의 시각적 지역화의 독특한 장점을 개별 강조 긍정적으로 또는 부정적으로이 마크의 다른 유형의 존재와 함께 해당 셀 스테인드. 5hmC 및 5caC 절대 신호 강렬으로 활용 된 항 체에 의해 증폭 활성화 heterochromatic euchromatic 지역 예: 크기 및 핵 내에서 이러한 표시의 위치에 대 한 제안에 반 정량적 해석 37 , 38. confocal 현미경 이미지의 전산 분석을 위한 기법을 설명 하는 여기. 2.5 D 공간 배급의 명백한 5hmC 표시에 대 한 플롯 그리고 픽셀 및 핵 내의 그들의 위치 당 5caC 신호 봉우리 시연. 5hmC의 히스토그램 플롯 및 5caC 신호 강도 프로필 봉우리로 이러한 표시의 풍부에 트렌드를 설명 수 골짜기 별도 비중첩 채널으로 그려집니다. 마지막으로, colocalization 함수를 구현 하 여 다른 하나의 신호의 근접의 정도 확인할 수 있습니다 그리고 이것 결과로, 그들의 각각 게놈 좌표를 확인할 수 있습니다.
Protocol
1. 공초점 이미지의 세대
- immunohistochemical 얼룩 Abakir 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 수행 시 토 신 수정 된 형태의 분석에 대 한 준비, 34.
- 밖으로 슬라이드의 영상 현미경을 사용 하 여 수행 하 고는 LSM 형식에 파일을 저장.
참고: 이미지 분석 단계에서 직접적인 비교를 허용 하는 절차를 복용 하는 이미지 전체에서 유지 되어야 때 강도 비교 프로필 샘플 사이 레이저 파워 및 각 채널에 대 한 이득에 대 한 사용 되는 값.
2. 2.5 D 강도 플롯의 세대
- 소프트웨어 (예를 들어, 선 블랙)를 열고 선택 ' 이미지 처리 '.
- 파일 메뉴로 이동 하 고 열기를 선택 합니다. 처리가 필요한 이미지를 선택 합니다.
- 클릭 ' 모두 표시 ' 모든 그래픽 컨트롤을 볼 수 있도록 이미지 아래. 화면의 아래쪽 절반에는 세 개의 탭; ' 차원 ', ' 디스플레이 ' 및 ' 그래픽 ', 선택은 ' 그래픽 ' 탭
- 선택은 ' 사각형 ' 핵/관심 영역을 선택 하려면 도구.
- 선택 ' 영역을 잘라 ' 이미지를 자르려면. 자른된 영역에 대 한 새로운 이미지를 별도 탭에 생성 됩니다
- 파일 메뉴에서 저장 다른 이름으로 주고 파일 이름을 선택 하 고 LSM 또는 CZI 파일로 저장.
- 소프트웨어 (예를 들어, 선 블루)을 열고 선택 합니다 ' 젠 데스크 '.
- 자른된 이미지에서에서 전송 선 검은 선 블루 파일을 선택 하 고 파일 메뉴에서 클릭 하 여 고 선 2012-블루 버전으로 보내기를 선택 합니다. 자른된 이미지 다음 해당 프로그램에서 열립니다.
참고: 이미지 파일은 전송 선 블랙 2012 년에서 2.5 D 강도 플롯 기능 동시에 여러 채널 이미지를 표시 하지 않습니다. - 이미지의 왼쪽에 표시 하는 탭을 선택 ' 2.5 D ', 2.5 d에서 이미지의 시각화 수 있습니다. 클릭 ' 모두 표시 ' 모든 그래픽 컨트롤을 볼 수 있도록.
- 이미지 아래 왼쪽에 위치한 4 개의 회색 막대를 사용 하 여 Alter 시각화 설정.
참고: 왼쪽 손 바, 화면 상단의 확대/축소 =. 왼쪽 손 바, 화면의 하단 축에 회전 이미지를 =. 손으로 왼쪽 화면의 하단 바 = 이미지의 회전. 화면, 오른쪽 손 바 = 확장 하 고 계약 규모 바. - 한지는 렌더링 모드를 선택 표면이 제공 하는 개별 봉우리의 최고의 시각화.
- 그리드 거리 변경 비율, 더 낮은 비율을 변경 하 여 더 정의 각 개별 피크.
- 2.5 D 이미지를 저장 하려면 먼저 2.5 D 음모 아래 회색 화살표를 클릭 하 여 파일 목록 오른쪽에는 이미지 아래의 그래픽 도구를 숨기기 (옆에 ' 모두 보기 '),이 스크린을 채우기 위해 확장 하는 이미지에 대 한 허용 그래픽 탭을 숨길 것 이다 명. 2.5 D 음모를 저장 하려면 눌러는 ' PrtSc '는 키보드의 키. 이 디스플레이의 화면을 캡처합니다. Microsoft 그림판에 화면 캡처를 붙여 하 고 저장 하기 전에 이미지 자르기.
3. 강도 프로 파일링
- 소프트웨어 (예를 들어, 선 블랙)를 열고 이미지 처리를 선택 합니다.
- 파일 메뉴로 이동 하 고 열기를 선택 합니다. 처리가 필요한 이미지를 선택 합니다.
- 로 이미지는 화면에 표시 됩니다, 이미지의 왼쪽에 표시 하는 탭 선택 ' 프로필 '.
- 에에서 화면의 선택 (틱)는 ' 모두 표시 ' 탭. 이 모든 서식 옵션에 액세스할 수 있도록 합니다.
- 스크린의 아래쪽에는 세 개의 탭; ' 차원 ', ' 디스플레이 ' 및 ' ProfileƆ 선택 ' 프로필 ' (진드기)를 선택 하 고는 ' 테이블 ' 상자. 선택은 ' 화살표 ' 버튼.
- 이미지를 사용 하 여 마우스 시작 포인트를 선택 하 고 셀의 연속 수 위로 마우스를 끕니다. 릴리스 마우스 생산 라인; 셀에 대 한 강도 음모를 또한 테이블 각 파장에 대 한 라인을 따라 픽셀에 대 한 강도 측정 데이터에 의해 채워질 것 이다.
참고: 테이블 거리 (µ m)는 픽셀에서 빨강, 녹색 및 파란색 형광에 대 한 읽기 강도 제공 합니다. - 이 데이터를 내보낼이, 마우스 오른쪽 단추로 선택 테이블 ' 테이블 저장 … '.txt 파일로 적절 한 위치에 저장 하 고.
- 선택한 강도 프로 파일 이미지를 저장 하려면 파일 메뉴를 선택 하 고 선택 ' 수출 … '. 팝업 창에서 선택 ' 태그 이미지 파일 (형식) ' 및 ' 이미지 창-단일 창 (데이터)의 내용을 ' 클릭 하 여 다음 ' 파일 이름을 선택 하 고 저장 … ' 적절 한 위치를 선택 하 고 클릭 ' 저장 '.
- 분야의 비전 및 분석 하는 프로필의 수에 따라 각 개별 강도 프로필에 대 한 과정을 반복.
- 가져오기 프로필 (3.7 참조) 저장 하는 데이터와 통계 분석 하 여 다음 스프레드시트에서 분석.
4. 공동 지역화 분석
- 소프트웨어를 열고 선택 ' 이미지 처리 '.
- 파일 메뉴로 이동 하 고 열기를 선택 합니다. 처리가 필요한 이미지를 선택 합니다.
- 로 이미지는 화면에 표시 됩니다, 이미지의 왼쪽에 표시 하는 탭 선택 ' Coloc '.
- 에에서 화면의 선택 (틱)는 ' 모두 표시 ' 탭. 이 모든 서식 옵션에 액세스할 수 있도록 합니다.
- 스크린의 아래쪽에는 4 개의 탭; ' 차원 ', ' 디스플레이 ', ' 그래픽 ' 및 ' ColocalizationƆ 선택 ' Colocalization '에 대 한 상자를 체크 하 고 ' 테이블 '와 ' 이미지 '.
- 선택이이 탭 (가까운 베 지 어 텍스트 마우스 도구를 가리키면 나타납니다)의 상단에 따라 세 번째 아이콘 다음이 도구를 사용 하 여 단일 핵을 둘러싸 자,이 핵은 대 한 값을 다음 테이블에 나타납니다.
참고: 각 원된 핵에 대 한 점도 대 화면의 왼쪽 패널에서 시각 이다 녹색 형광 레드에 대 한 생산 됩니다. 축 다음 임계값에 따라 세포 게이트 위해 이동 합니다. 관심의 핵은 이미지에서 수동으로 선택 되어, 0 보다 제어 임계값 조정 필요 하지 않습니다. 모든 픽셀의 강도 값 핵 경계 내에서 관찰 긍정적인 신호로 간주 됩니다.
- 선택이이 탭 (가까운 베 지 어 텍스트 마우스 도구를 가리키면 나타납니다)의 상단에 따라 세 번째 아이콘 다음이 도구를 사용 하 여 단일 핵을 둘러싸 자,이 핵은 대 한 값을 다음 테이블에 나타납니다.
- 탭에서 세 번째 아이콘을 선택 하 고 데이터 집합 완료 될 때까지 후속 핵 포위 망 하 여이 과정을 반복.
- 이 데이터를 내보낼 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 테이블 저장을 선택 하 고 적절 한 위치에 저장.
- Colocalization 이미지를 저장 하려면 파일 메뉴를 선택 하 고 선택 ' 수출 … ' 다음 선택; 태그 이미지 파일 (형식)와 ' 이미지 창의 내용을 – 단일 평면 (데이터) ' 클릭 하 여 다음 ' 파일 이름을 선택 하 고 저장 … ' 적절 한 위치를 선택 하 고 클릭 ' 저장 '.
- 통계 분석 하 여 다음 스프레드시트에 colocalization 데이터.
Representative Results
5hmC와 5caC 간 창시자 immunostained 슬라이드 이러한 DNA 수정에 대 한 차별화의 공간 배급 결정 했다 현미경을 사용 하 여 몇 군데.
이러한 oxi mCs의 공간 배급의 초기 분석 2.5 D 강도 플롯 (그림 1A, 1B)의 세대를 통해 수행 되었다. 빨간색과 녹색 봉우리만 작은 오버랩 5caC 및 5hmC 신호를 나타내는 주황색 봉우리의 제한 된 존재와 잘 정의 된 것 처럼 보였다. 이러한 결과와 해당 셀에 5hmC 및 5caC 농도 대 한 프로필 강하게 서로 (그림 1C)와 일치 하지 않습니다. 이것은 5caC와 5hmC 간 창시자 그 Tet 종속 산화 특정 chromatin DNA 수정이의 다른 산화 유도체의 세대 5mC 리드의 제안에 핵 배포의 명백한 본 전시 설명 영역입니다.
5caC 및 Daoy medulloblastoma BXD 1425EPN ependymoma 세포에서 5hmC의 수준을 비교, 이러한 oxi mCs에 대 한 immunostaining 동일 실험 조건 하에서 두 샘플에 수행 되었다. 5caC 및 5hmC 신호 강도 다음 각 셀 라인에 대 한 기록 3-5 셀에 걸쳐 생성 된 20 프로필에 비교 했다 (그림 2A-2D). 이러한 결과의 정량화 BXD 1425EPN 셀 5hmC와 5caC immunostaining Daoy 셀 (그림 2D)에 비해 상당히 낮은 수준의 전시 밝혔다.
두 채널 레드 (5hmC) 및 녹색 (5caC)을 고려 하면 있는 수 수 표시 R과 G으로 각각, Pearson의 상관 계수 (PCC) 공간 중복 및 R의 공동 분리의 정도 설명 합니다 & G 모두 표시 가정 선형 존재 서로, R 통계34로 표시 관계입니다. PCC 값, R2 로 표시 squaring 빨간 신호 강도34영향 인 녹색 신호 강도 변화 측정을 수 있습니다. 이것은 우리의 5caC 대 5hmC 공동 지역화 분석에 대 한 불필요 한입니다.
5caC 및 5hmC undifferentiated (Undiff) hiPSCs 및 간장 endoderm에서의 공간 배급 유도 후 24 시간 (HE24) 검사, 이러한 DNA 개조의 colocalization 분석 실시 됐다 20 R 값과 동일한 confocal 이미지에 핵 각 셀 라인 (그림 3A-3 C)에 대 한 분석.
이러한 결과의 정량화 시연 colocalization의 정도 상당히 높은 (P < 0.05) HE24 Undiff (그림 3c)에 비해 서에서. 5caC 존재의 감소 된 크기 및 따라서 Undiff 세포에 그것의 감소 된 신호 강도에 기인 수 있습니다.
그림 1: 차별화의 72 시간 게시물 유도에서 간장 endoderm 창시자의 Immunohistochemical 얼룩. (A) 5hmC (적색), 5caC (녹색), DAPI 핵 카운터 얼룩 (파란색)의 공동 얼룩. 흰색 파선된 화살표 'B' 1 C에 핵을 통해 샘플링 프로 파일링의 방향을 나타냅니다. 눈금 막대 나타냅니다 5 µ m. 빨강 채널: 800 이득, 레이저 1%. 녹색 채널: 750 이득, 레이저 2.4%. DAPI 채널: 750 이득, 2.6% 레이저. (B) 2.5 D 5hmC, 5caC 및 DAPI 신호 강도 플롯. 개별 봉우리는 각 픽셀의 절대 신호 강도를 나타냅니다. 병합 된 보기와 개별 채널 표시 됩니다. (C) 5hmC, 5caC 및 DAPI 강도 프로필 차별화의 72 시간 게시물 유도에서 간장 창시자에 신호. 피크 농도 흰색 파선된 화살표 'B'의 크기에 따라 기록 된 고 강도 프로필 x 축을 따라 검은색 파선 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 5hmC와 5caC의 분석 신호 Daoy medulloblastoma BXD 1425EPN ependymoma 셀 라인에서 농도. (A) Immunofluorescent 얼룩 (빨강) 5hmC 및 5caC (녹색) Daoy 및 1425EPN BXD 셀에. 이미지 모두 동일한 설정에서 기름 침수 렌즈, x 63으로 점령 했다. 병합 된 보기와 개별 채널 표시 됩니다. 스케일 바 대표 10 µ m. 빨강 채널: 746 이득, 레이저 1%. 녹색 채널: 750 이득, 레이저 2.4%. 개별 Daoy (B)와 (C) BXD 1425EPN 셀 인접 한 인물에 확장 됩니다. (B)에 대 한 막대 및 (C) 대표 5 µ m. (D) 비 형광의 강도 Daoy BXD 1425EPN 세포에서 5hmC 대 5caC 신호 확장 (n = 20, SD). 의미는 F-검정을 사용 하 여 평가 했다 그리고 두 표본 t-테스트 별표 표시의 통계적으로 유의 한 p-값 * * p로 < 0.01와 * * * p로 < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 5hmC 5caC 절대 신호 undifferentiated hiPSCs (Undiff)에 Colocalization 분석에 비해 간 endoderm 24 시간 후 차별화 된 조상 세포 (HE24). (A)의 confocal 현미경 이미지 undifferentiated hiPSCs 및 (B) HE24 5hmC (적색), 5caC (녹색), DAPI (블루)에 대 한 스테인드. 셀 동일한 설정에서 63 X 기름 침수 렌즈는 몇 군데 있었다. 20 원된 핵 세포를 colocalization 분석을 위한 샘플링을 보여 줍니다. 스케일 바 대표 20 µ m. 빨강 채널: 800 이득, 레이저 1%. 녹색 채널: 750 이득, 레이저 2.4%. DAPI 채널: 750 이득, 2.6% 레이저. (C) undiff 및 HE24 5hmC 근접의 범위 내에서 5caC 신호의 존재의 Colocalization 분석 (n = 20, SD). 의미는 F-검정을 사용 하 여 평가 했다 그리고 두 표본 t-테스트 별표 표시의 통계적으로 유의 한 p-값 * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜의 핵 내 DNA 수정 시각적 표현 생성의 단계적 프로세스를 설명 합니다. 과민 하 고 강렬한, 하는 동안 이러한 기술을 제한의 수를가지고 할.
그것은 2.5 D에서 생성 된 데이터 플롯, 신호 강도 프로필 및 colocalization 분석은 자연에서 반 정량적 강조 해야 합니다. 때문에 레이저 confocal 현미경 검사에 이미지 중 샘플의 지점에 의해 포인트 조명, 각 채널의 절대 신호 강렬 기록 됩니다. 그러나, 이들은 5hmC의 절대 크기 그리고 5caC 되 고 감지 하 고 유일한 존재, 부재 또는이 후 성적인 표의 규모의 대표.
신호 확대의 반복적인 특성상 필연적으로 신호를 향상에 적용 하는 기계의 크기와 제한 이러한 마크34의 진정한 물리적 게놈 점령의 근사 혼동. 이 마크의 진정한 게놈 지역화 물리적으로 200-300 nm34의 최적의 confocal 해상도 한계 에서도 해결할 수 없는 영역을 차지 하는이 부피가 큰 단백질에 의해 왜곡 될 수 있습니다. 또한, 각 마크에 대 한 개별 채널의 신호 강도 항 체 감도 및 fluorophore 활용34차이로 인해 서로에 비해 수 없습니다. 그러나 정보 영상으로 얻은 게놈 부호의 공간과 일시적인 조직에 빛이 나.
5hmC 및 5caC 신호의 정확한 정량에 대 한 핵 강조 표시 하 고 분석 영역을 명확 하 게 정해 DAPI counterstain에 둘러 쌓여. 이 절차는 배경 잡음은 핵1을 선택 하는 수동 과정 무시로 제어 임계값을 보정에 대 한 요구와 함께 dispenses. 이 프로세스의 자동화는 수행 되어야 할 핵 세분화 수 있는 최신 소프트웨어에 구현할 수 있습니다. 이미지 마스킹 및 크기 제외 데이터의 영역을 선택 하려면 입력 제한 관심 무료 대안 소프트웨어 패키지와 같은 피지 colocalization 분석, 이진 8 비트 형식으로 이미지를 변환할 필요가 같은 단점에 사용할 수 있는 하는 동안은 이 프로그램 사용자 접근 또한, 고려 전체 5hmC 및 5caC euchromatic 지구 고, 게놈 CpG 시퀀스의 고갈에 그들의 지배적인 위치를 가진 일반적으로 결합 하는 게놈에서의 레벨 제한, 사용자 바이어스 소개 핵의 수동 포위 망 합니다. 따라서, 자동으로 핵의 강조 긍정적인 demarcated 지역 내에서 발생 하는 모든 이벤트를 가정 하 고 있을 수 있는 모든 배경 픽셀을 무시 합니다. 따라서, 픽셀의 강도에 따라 이미지 분석은 더 의미 있을 수 있습니다. Mander의 colocalization 계수 피어슨의 상관 관계 계수 추측 하에 반대 그들의 신호 강도 관계 없이 2 개의 신호 사이 공간 오버랩의 정도 분석 하 고의 사용을 고려할 때 이러한 요소는 중요 한 신호 사이 선형 관계입니다.
전반적으로, 여기에 설명 된 기술을 직관적인 형태로 생물학 데이터의 시각적 표현의 테마를가지고. 반 양적 이미지 분석 감도 또는 단일 기본 해상도 게놈 질량 분석 등 강력한 기술을 대체할 수 없습니다 하는 동안 추론 및 가설 될 수 있도록 하는 무료 데이터 제공 넓은 시퀀싱 정밀도와 이미지의 분석에서 잉태.
Disclosures
관심의 잠재적인 충돌 공개 됐다.
Acknowledgments
작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 [BB/N005759/1 아칸소]에 의해 지원 되었다. NRFH Rosetrees 신뢰와 Stoneygate 신탁에 의해 투자 되었다 [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 현미경, 처리 컴퓨터와 소프트웨어에 의해 BBSRC BB/L013827/1 (종합 슈퍼 해상도 현미경에 시설 노팅엄 대학 그랜트)을 투자 했다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
References
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