Summary
חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.
Abstract
במשך כמה עשורים, 5-methylcytosine (5mC) כבר חשבה להיות השינוי DNA היחיד עם משמעות תפקודית ב- metazoans. הגילוי של חמצון אנזימטי של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC), כמו גם זיהוי של N6-methyladenine (6mA) ב- DNA של אורגניזמים רב תאיים סיפק דרגות נוספות המורכבות למחקר epigenetic. על פי גוף גדל והולך של ראיות, לבצע שינויים אלה DNA הרומן עשוי לשחק תפקידים ספציפיים הסלולר תהליכים התפתחותיים שונים. חשוב, כמו של אלה סימני (אי ג'י 5hmC, 5fC ו 5caC) בנספח רקמות - מופע ספציפי בשלב התפתחותי גולגולת, נוגדנים מייצג כלי חשוב לאפשר הערכה של התפוצה המרחבית של שינוי ה-DNA הקשרים ביולוגיים שונים. כאן השיטות לניתוח חישובית של שינויים DNA דמיינו ידי immunostaining ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית מתוארים. באופן ספציפי, הדור של ממד 2.5 (2.5 D) אות בעוצמה חלקות, אות בעוצמה פרופילים, כימות של צביעת בעוצמה בתוך תאים מרובים והנחישות של האות colocalization מקדמים מוצגים. באופן קולקטיבי, טכניקות אלו עשויים להיות מבצעית בהערכת רמות, לוקליזציה של לבצע שינויים אלה הדנ א בגרעין, לתרום שחקרתי את התפקיד הביולוגי שלהם ב- metazoans.
Introduction
מתילציה DNA, מנגנון מתועדת היטב המשויך תקנה תעתיק מצריכה שינוי של ציטוזין שאריות 5'-ציטוזין-פוספט-גואנין-3' (CpG) ההקשר dinucleotide באמצעות הוספת קבוצת מתיל (-CH3) 5- אטום פחמן של הטבעת פירימידין ציטוזין לטופס 5-methylcytosine (5mC)1. אצל יונקים, כ- 70% של סחורות ארוזות לצרכן הם מפוגל המהווה 1% בלבד של הגנום שלהם כפי שהם דלה של רצף palindromic זה בשל נטיה מוטגניות 5mC כדי deaminate באופן ספונטני תימין2. נוכחות של קבוצות מתיל ג'ין יזם ברצפי מראים מתאם חזק עם דיכוי גנים ברמת השעתוק חולייתנים3,4,5. תוספת של קבוצות מתיל אלה הוא מזורז על ידי מאוד שנשמרת DNA אנזימים methyltransferase (DNMT) DNMT3a, 3b, 3 L DNMT1 המשנים את CpG cytosines בהקשרים מתילציה ותחזוקה של דה נובו בהתאמה6. הביטוי DNMT3A/B הוא גבוה במהלך התפתחות תאי גזע עובריים, epiblast; אולם הביטוי מופחתת שלה הוא ציין בעקבות pluripotent תא שושלת היוחסין מחויבות הגורלות סומאטית במהלך התמיינות8. תוך שיתוף יתירות פונקציונלית, DNMT3a ו- 3b להציג דפוסי ביטוי רקמות ספציפיות, עם 3a זוהה בצורה אחידה עוברי העכבר אבל 3b בעיקר מקומית neuroectoderm ו האאקטודרם שליה רקמות8.
יכול להיות תורשתית מתילציה חתימות במהלך מיטוזה, מיוזה10. מתילציה תחזוקה כוללת שינוי DNMT1 הקל של שאריות ציטוזין CpG הקיימים הפלינדרומים מפוגל חמי כפולה גדילי הדנ א11. איגודים DNMT1 DNA-שכפול מזלגות11 , כתוצאה מכך, מתילציה גנומית רמות שיא במהלך שלב S של מחזור התא12. DNMT1 methylates cytosines שלא שונתה ובכך הבחנה גדילי DNA מסונתז לאחרונה, קידום שמושרש איון, שמירה על דיכוי גנים ברמת השעתוק פרופילים13. דרך זיהוי של רצפי DNA CpG מפוגל חמי, DNMT1 שומר על דפוסי הוקמה מתילציה התחום בין דה נובו מתילציה למשל הדיכוי של זמן וביניהם גרעיני רכיב 1 (LINE1) היזמים רטרוטרנספוזון כדי לעכב את הפצת קרצינוגני14. למרות בעלי זיקה מחייבת מועדף של ה-DNA מפוגל חמי, DNMT1 יכול methylate unmethylated איילנד (CGI) CpG רצפים בתאים DNMT3a/b - / - מוטציה, במילוי תפקיד מתילציה חירום דה נובו 15 . לפיכך בשל אופייה השמרני למחצה של שכפול הדנ א16, תחזוקה מתילציה יכול בנאמנות מסכם את הדברים חתימות מתילציה מהאב תא בת17.
עם זאת, עבור ג'ין הביטוי יהיה שינוי מתילציה מאופנן באופן דינמי, הדיכוי חייב להימחק, אשר יכולה להיות מושגת על ידי מנגנוני פסיביים ואקטיביים demethylation18. החלבונים Translocase (ט) 10-11 השייכים למשפחת dioxygenase חלבונים שנשמרת מסוגלים חמצון איטרטיביים של קבוצות מתיל-CpG שאריות19. חלבונים אלו ט, הומולוגי ל J-בסיס מחייב חלבונים (JBP) התגלו Trypanosome bruceii, מזהה ואיגוד ששונה DNA בסיסים כגון 5mC ו חמצן אלה שאריות 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC), 5 - carboxylcytosine (5caC)20. ט חלבון הקל חמצון של 5mC תוצאות שינוי קונפורמציה stepwise ממתיל תצורות הידרוקסיל, קרבוניל, carboxylate, אולם שינויים 5fC ו 5caC יכול להיות מסונתז ישירות מ- 5mC חמצון21, 22 , 23 , 24.
אינדיקציה מקיף ט פעילות החלבון בהבנת רגולציה שלהם הוא לומד את התפוצה והשפע של סימני oxi-מתיל-ציטוזין. נוכחות משמעותית 5mC היזמים המסכן CpG לזיהוי בניגוד unmethylated CpG אזורים עשירים, הישות השנייה האופייניים CpG איי25. מעבר רקמות, רקמות הגבוהה מתילציה מסוימת הוא ציין המוח, testis ודם בזמן האוראלית התערוכה הגדולה ביותר hypomethylation, המציין תבנית מתילציה דיפרנציאלית המתרחשים בגיל מסוים היזמים רקמות26.
באמצעות ניצול רגיש anti-5mC אנטי-5hmC נוגדנים במתיל סלקטיבית/hydroxymethyl דנ א immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), ורצף תפוקה גבוהה עוקבות, Ficz. et al. הפגינו תפוסה גבוהה 5hmC על היזמים, exons ורצפים רטרוטרנספוזון של קו-1 אשר בקורלציה עם רמות 5mC מופחת במקומות אלה עכבר עובריים גזע תאים27. הפוך, העשרה 5mC הגדול ביותר נצפתה ב לווין חוזרות רצפים היכן נוכחות 5hmC היה מוגבל28. מחקרים שבוצעו על רקמת המוח האנושי האונה המצחית לחשוף 5hmC משמעותית ביותר העשרה, גבוה יותר מאשר בתאי גזע עובריים בעכבר28ארבע קיפול. אברו עם תצפיות הקודם, תפוקה גבוהה רצף של האונה הקדמית רקמות מאויר הרוב 55-59% 5hmC אות מקומי על צפיפות נמוכה CpG יזם אזורים, 35-38% בתוך הגן וגופי כ 6% תפוסה-intergenic אזורים. לעומת זאת, 5mC היה מועשר ב אזורים intergenic (25-26%) ומעלה בתוך הגן גופים (52-55%) אך מופחת (22-24%)-יזם רצף29. מחקרים אלה מצביעים על שפע של 5hmC של תאי גזע עובריים ורקמות הסומטית, במיוחד במוח, אולם חקירות על הפצות 5fC ו- 5caC הן מוגבלות.
מעניין, לאחרונה התגלו פרוקריוטים, מתילציה של אדנין שאריות-החנקן בעמדה 6 (N6) (6mA) התצוגה שפע גנומית פרופיל ההפוכה לזו של 5mC30. תצפיות כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים טנדם ספקטרומטר מסה לחשוף את 6mA ברמות המוחלטות להתקיים עודף דג זברה, חזירי עוברי מוקדם לעומת זרע עם רמות שלה (0.003% adenines גנומית) גדל בהתמדה על הפריה, לשיא בשלב התפתחותי morula (33 קיפול גבוה יותר מאשר הזרע) ופנייה רמות סומאטית מצב יציב של 0.004% adenines גנומית31. Immunoprecipitation של רצפי DNA 6mA מועשר הוכיחה תפוסת הדומיננטית (כ 80% העשרה) של הסימן הזה אזורים יסוד החוזרות על עצמן, התחל תעתיק אתרי32. תצפיות אלה contextualize ולאמת גילוי 6mA demethylase null eתאי גזע mbryonic מפגין 6mA שהצטברו מתווכת להשתיק רטרוטרנספוזון קו-1 בהשוואה ליסודות transcriptionally פעילים בתאים wildtype. נתונים אלו מראים פונקציה רגולטוריות תעתיק עבור 6mA33.
בעוד מצומדת תגיות הביוכימי מצמידים מבחני מח ש הבאים מצביעים על נוכחות או היעדרות של נגזרות methylcytosine מחמצנים (oxi-mCs), הם לא יכולים להקנות מתפרוסת מרחבית או מידע הניתנת לכימות של אלה סימני34, 35. פרוטוקול לגילוי immunochemical רגיש של 5hmC, 5caC היה שפותחו לאחרונה36. בשיטה זו immunostaining נוגדן מבוססי משני fluorophore מצומדת בשילוב עם ניצול סריקה מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר בעל היתרון הייחודי של מתן חזותיים לוקליזציה של לבצע שינויים אלה דנ א בתוך התאים, לפיכך, שימת דגש על הפרט באופן חיובי או שלילי מוכתם תאים המתאימים עם נוכחות הטרוגנית של הסימנים האלו. עוצמות האות מוחלטת 5hmC ו- 5caC כפי מוגבר על ידי נוגדנים מצומדת מאפשרות פרשנויות למחצה כמותיים להיות הציע על הגודל ועל עמדות של הסימנים האלו בתוך הגרעין למשל heterochromatic ואזורים תהיה 37 , 38. כאן מתוארת שיטה לניתוח חישובית של מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות. הדור של התפוצה המרחבית של 2.5D מתווה להצגת 5hmC ברורים והפגינו 5caC פיקס האות לכל פיקסל ואת מיקומיהם בתוך גרעין האטום. היסטוגרמה מתווה של 5hmC 5caC פרופילים עוצמת האות יכול להמחיש מגמות בשפע של הסימנים האלו כמו הפסגות, שקתות מותוות כמו ערוצים נפרדים שאינם חופפים. לבסוף על-ידי יישום הפונקציה colocalization, ניתן לקבוע את מידת הקרבה של אות אחת לאחרת, כתוצאה מכך, ניתן לזהות קואורדינטות גנומית המתאימים שלהם.
Protocol
1. דור של תמונות קונאפוקלית
- לקראת הניתוח של צורות ששונה של ציטוזין, לבצע immunohistochemical מכתים כפי שתואר על ידי. Abakir et al. 34.
- לבצע הדמיה של שקופיות החוצה באמצעות מיקרוסקופ ולשמור קבצים בתבנית LSM.
הערה: כאשר משווה עוצמת פרופילי בין דוגמאות את הערכים ששימשו עבור עוצמת הלייזר ורווח לכל ערוץ חייבת להישמר בכל התמונה לוקח את ההליך כדי לאפשר השוואה ישירה במהלך ניתוח התמונה.
2. דור 2.5D בעוצמה מתווה
- פתח את התוכנה (למשל, זן שחור) ובחר ' עיבוד תמונה '.
- ללכת בתפריט ' קובץ ' ובחרו פתוח. בחר את התמונה הדורשת עיבוד.
- לחץ על ' הצג הכל ' מתחת לתמונה להפוך כל הפקדים גרפי לגלויה. בחלק התחתון של המסך יש שלוש לשוניות; ' מידות ', ' תצוגה ', ' גרפיקה ', בחר ' גרפיקה ' בכרטיסיית
- בחר ' מלבן ' כלי לבחירת גרעינים/תחום התעניינות.
- בחר ' חתך אזור ' כדי לחתוך את התמונה. פעולה זו תיצור תמונה חדשה עבור האזור החתוך בתוך טאב נפרד
- ללכת תפריט קובץ, בחר שמור בשם לתת את הקובץ שם ולשמור אותו כקובץ LSM או CZI.
- פתח את התוכנה (למשל, זן כחול) ובחר ' זן דלפק '.
- שלח התמונה החתוכה משחור זן זן כחול על-ידי בחירת הקובץ ולחיצה בתפריט קובץ, בחר באפשרות שלח מהדורת 2012 זן-כחול. התמונה החתוכה ואז ייפתח בתוכנית הרלוונטית.
הערה: קובץ התמונה מועברת כי התכונה מגרש בעוצמה 2.5D ב- 2012 שחור זן לא יציג מספר תמונות ערוץ בו זמנית. - בצד שמאל של התמונה לבחור הלשונית ' 2.5D ', דבר זה מאפשר הדמיה של התמונה ב- 2.5 D. לחץ על ' הצג הכל ' כדי להפוך כל הפקדים גרפי לגלויה.
- אלתר ויזואליזציה הגדרות באמצעות ארבעה ברים אפור ממוקם משמאל ומתחת התמונה.
הערה: בר היד השמאלית העליונה של המסך = מרחק מתצוגה. בר יד שמאל, בתחתית המסך = image סיבוב על ציר. התחתון של המסך, יד שמאל בר = סיבוב של התמונה. התחתון של המסך, נכון = בר יד להתרחב ולהתכווץ סרגלי קנה מידה- - לוודא את מצב רינדור שנבחר הוא משטח כמו זה נותן את הפריט החזותי הטוב ביותר של הפסגות בודדים.
- לשנות את מרחק רשת על-ידי שינוי האחוז, התחתונה האחוז יותר מוגדרים כל שיא בודדים.
- לשמור את התמונה 2.5D, להסתיר תחילה את רשימת הקבצים על צד ימין, כלים גרפיים מתחת התמונה על ידי לחיצה על החץ אפור מתחת העלילה 2.5D (ליד ' הצג הכל '), זה יהיה להסתיר את הכרטיסיות גרפי המאפשר התמונה להרחיב כדי למלא את המסך (ש ע) כדי לשמור את העלילה 2.5D, הקש ' PrtSc ' מקשים במקלדת. זה ללכוד מסך התצוגה. להדביק את צילום המסך בצייר של Microsoft ולחתוך את התמונה לפני השמירה.
3. עוצמת פרופיל
- פתח את התוכנה (למשל, זן שחור) ובחר עיבוד תמונה-
- ללכת בתפריט ' קובץ ' ובחרו פתוח. בחר את התמונה הדורשת עיבוד.
- כמו התמונה תופיע על המסך, בצד שמאל של התמונה בחר הלשונית ' פרופיל '.
- התחתון של המסך בחר (tick) ' הצג הכל ' טאב. זה יאפשר גישה לאפשרויות עיצוב כל.
- בחלק התחתון של המסך יש שלוש לשוניות; ' מידות ', ' תצוגה ' ו ' ProfileƆ בחר ' פרופיל ' ובחר (tick) ' טבלה ' תיבת. בחר ' חץ ' כפתור.
- על התמונה להשתמש בעכבר כדי לבחור נקודת התחלה וגרור את העכבר מעל מספר רציף של תאים. שחרר את לחצן העכבר כדי לייצר של מגרש העוצמה עבור התאים לאורך הקו; בנוסף בטבלה יאוכלסו על ידי עוצמת נתוני המדידה של הפיקסלים לאורך הקו עבור כל אורך גל-
הערה: בטבלה תספק את המרחק (מיקרומטר)-איזה פיקסל עוצמה שנקראה עבור זריחה אדום, ירוק וכחול - - כדי לייצא את הנתונים, לחץ לחיצה ימנית על הטבלה, בחר ' שמור טבלה … ' ולשמור המקום המתאים כקובץ. txt.
- לשמור את התמונה של הפרופיל שנבחר בעוצמה בחר בתפריט ' קובץ ', בחר ' ייצוא … '. בחלון המוקפץ לבחור ' מתויג קובץ תמונה (תבנית) ' ו- ' התוכן של התמונה חלון - חלונית יחיד (נתונים) ' ולאחריה לחיצה על ' בחר שם קובץ ולשמור … ' לבחור את המקום המתאים ולחץ על ' להציל '.
- חזור על התהליך עבור כל פרופיל בעוצמה בודדים בהתאם שדות הראייה מספר פרופילי לנתח.
- עוצמת ייבוא פרופילי נתונים שנשמרו (ראה 3.7) וניתוח בגיליון ואחריו ניתוח סטטיסטי.
4. ניתוח לוקאליזציה שיתוף
- פתח את התוכנה ובחר ' עיבוד תמונה '.
- ללכת בתפריט ' קובץ ' ובחרו פתוח. בחר את התמונה הדורשת עיבוד.
- כמו התמונה תופיע על המסך, בצד שמאל של התמונה בחר הלשונית ' Coloc '.
- התחתון של המסך בחר (tick) ' הצג הכל ' טאב. זה יאפשר גישה לאפשרויות עיצוב כל.
- בחלק התחתון של המסך יש ארבע כרטיסיות; ' מידות ', ' תצוגה ', ' גרפיקה ' ו ' בחר ColocalizationƆ ' Colocalization ' נסמן את תיבת ' טבלה ' ו ' התמונה '.
- בחר בסמל השלישי לאורך בחלק העליון של כרטיסיה זו (קרוב עקומות טקסט יופיע כאשר העכבר מרחף מעל הכלי) לאחר מכן להשתמש בכלי זה כדי להקיף גרעינים יחיד, ערכים עבור זה יכלול גרעינים ואז מופיעים בטבלה.
הערה: עבור כל הגרעינים שהינכם מטיילים מגרש פיזור מופק אדום נגד קרינה פלואורסצנטית ירוק אשר הוא מדמיין בחלונית השמאלית במסך. הציר לאחר מכן מועבר על מנת שער החוצה תאים בהתאם הסף. כמו גרעינים עניין נבחרו ידנית של תמונות, התאמת את סף חסימה מעל האפס אינה נדרשת. כל ערכי העוצמה של פיקסל, נצפתה בתוך ההיקפים גרעיני נחשבים איתות חיובי.
- בחר בסמל השלישי לאורך בחלק העליון של כרטיסיה זו (קרוב עקומות טקסט יופיע כאשר העכבר מרחף מעל הכלי) לאחר מכן להשתמש בכלי זה כדי להקיף גרעינים יחיד, ערכים עבור זה יכלול גרעינים ואז מופיעים בטבלה.
- חזור על תהליך זה על-ידי בחירה בסמל השלישי בכרטיסיה המקיפות גרעין עוקבות עד ערכת הנתונים הושלמה.
- כדי לייצא את הנתונים, לחץ לחיצה ימנית על הטבלה, בחר שמור טבלה, לשמור המקום המתאים.
- לשמור את התמונה colocalization, בחר בתפריט ' קובץ ', בחר ' ייצוא … ' מכן בחר; מתויג קובץ תמונה (תבנית), ' התוכן של התמונה חלון – מטוס יחיד (נתונים) ' ולאחריה לחיצה על ' בחר שם קובץ ולשמור … ', לבחור את המקום המתאים ולחץ ' להציל '.
- מגרש colocalization נתונים בגיליון ואחריו ניתוח סטטיסטי.
Representative Results
כדי לקבוע את התפוצה המרחבית של 5hmC ו 5caC ב המבדילים שקופיות immunostained אבות הכבד לבצע שינויים אלה דנ א היו עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ.
מבדיקה ראשונית של התפוצה המרחבית של אלה oxi-mCs התבצע באמצעות הדור של 2.5D בעוצמה חלקות (איור 1A, 1B). הפסגות אדום וירוק הופיע להיות מוגדרת היטב עם נוכחות מוגבלת של פסגות כתום המציין רק של חפיפה קטנה של האותות 5caC ו- 5hmC. מסכים עם תוצאות אלה, הפרופילים עבור 5hmC ו- 5caC עוצמות בתא המתאים אינם בתוקף מתנגשים אחד עם השני (איור 1C). זה ממחיש כי 5caC ו- 5hmC שהפגינו דפוסים ברורים של הפצה גרעינית באבות הכבד מציע את חמצון תלויי-ט 5mC מוביל לדור של נגזרות מחמצנים שונים של זה שינוי ה-DNA בכרומטין ספציפי אזורים.
כדי להשוות את הרמות של 5caC ו 5hmC Daoy medulloblastoma, BXD-1425EPN ependymoma תאים, immunostaining עבור אלה oxi-mCs התבצע על שתי דגימות בתנאים זהים ניסיוני. עוצמות של אותות 5caC ו- 5hmC הושוו בפרופילי 20 שנוצר על-פני תאים 3-5 נרשם עבור כל קו תא (איור 2 א-2D). כימות של תוצאות אלו חשפו תאים BXD-1425EPN שהפגינו רמות נמוכות משמעותית של immunostaining הן 5hmC והן 5caC לעומת תאים Daoy (איור דו-ממדי).
בהתחשב בשני ערוצים אדום (5hmC) וירוק (5caC) אשר יכול להיות מסומן בתור R ו- G בהתאמה, מקדם המתאם של פירסון (PCC) מתאר את מידת החפיפה המרחבי, הפרדה ושיתוף של R & G בהנחה בשני סימני קיימת פונקציה קווית קשר אחד עם השני, מסומן על ידי R הסטטיסטי34. תרבוע הערך PCC, מסומן על ידי R2 מאפשר מדידת עוצמת אות ירוק וריאציה אשר מושפע על ידי עוצמת האות האדום34. . זה מיותר לניתוח לוקליזציה ושיתוף 5hmC שלנו 5caC vs.
כדי לבחון את התפוצה המרחבית של 5caC, 5hmC hiPSCs (Undiff) מובחן, הכבד האנדודרם 24 שעות (HE24) לאחר אינדוקציה, ניתוח colocalization של אלה שינויים DNA בוצעה על אותן תמונות וידאו, עם ערכי R 20 הגרעינים מנותח עבור כל קו תא (איור 3 אג-3).
כימות של תוצאות אלו הראו כי מידת colocalization הוא גבוה באופן משמעותי (P < 0.05) ב HE24 בהשוואה Undiff (איור 3 c). זאת ניתן לייחס את גודל מופחתת של נוכחות 5caC ובכך בעוצמתה אות מופחתת בתאים Undiff.
איור 1: נוגדן של אבות האנדודרם הכבד ב- 72 שעות אינדוקציה פוסט של בידול. (א) צביעת משותפת של 5hmC (אדום), 5caC (ירוק), הכתם מונה הגרעין דאפי (כחול). חץ מקווקו לבן 'B' מציין את הכיוון של פרופיל שנדגם דרך לגרעין, מאויר בשפת 1 C. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. הערוץ האדום: להשיג 800, לייזר 1%. ערוץ ירוק: להרוויח 750, לייזר בכ-2.4%. דאפי ערוץ: להרוויח 750, לייזר 2.6%. (B) 2.5 D מגרש בעוצמה של 5hmC, 5caC, דאפי אותות. פסגות בודדים מייצגים עוצמות האות מוחלטת של כל פיקסל. נוף הממוזג ערוצים נפרדים מוצגים. (ג) הפרופילים בעוצמה של 5hmC, 5caC, דאפי אותות בבית אבות הכבד ב- 72 שעות אינדוקציה פוסט של בידול. בעוצמות שיא נרשמו לאורך הממדים של חץ מקווקו לבן 'B', מצוינים לאורך ציר x פרופיל בעוצמה באמצעות חץ מקווקו שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח של 5hmC ושל 5caC אות עוצמות Daoy medulloblastoma, שורות תאים ependymoma BXD-1425EPN. (א) Immunofluorescent מכתים של 5hmC (אדום), 5caC (ירוק) בתאים Daoy ו- BXD-1425EPN. תמונות נלכדו עם 63 x עדשה המטרה של טבילה שמן, הן ברמה באותן ההגדרות. נוף הממוזג ערוצים נפרדים מוצגים. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. הערוץ האדום: להשיג 746, לייזר 1%. ערוץ ירוק: להרוויח 750, לייזר בכ-2.4%. תאים בודדים Daoy (B) ו- (ג) BXD-1425EPN מורחבות במספרים סמוכים. גודל ברים עבור (B) ועוצמה (C) מייצגים 5 מיקרומטר. (D) זריחה מרושע של 5hmC לעומת 5caC אותות בתאים Daoy ו- BXD-1425EPN (n = 20, SD). משמעות הוערכה באמצעות מבחן-F ו Two-sample t-כשהילדים הכוכביות מציינות סטטיסטית p-ערכי של * * כמו p < 0.01 ו * * * כמו p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח Colocalization של 5hmC ו- 5caC אותות מוחלטת במובחן hiPSCs (Undiff) בהשוואה להאנדודרם הכבד 24 שעות שלאחר הבדיל ובתאים (HE24). מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של (A) מובחן hiPSCs ותאים HE24 (B) צבעונית 5hmC (אדום), 5caC (ירוק), דאפי (כחול). התאים היו עם תמונה עם עדשה טבילה שמן X 63 הגדרות זהות. 20 גרעינים שהינכם מטיילים ממחישים את התאים שנדגם לצורך ניתוח colocalization. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. הערוץ האדום: להשיג 800, לייזר 1%. ערוץ ירוק: להרוויח 750, לייזר בכ-2.4%. דאפי ערוץ: להרוויח 750, לייזר 2.6%. (ג) Colocalization ניתוח של הנוכחות של האות 5caC בטווח של קירבה 5hmC undiff, HE24 (n = 20, SD). משמעות הוערכה באמצעות מבחן-F ו Two-sample t-כשהילדים הכוכביות מציינות סטטיסטית p-ערכי של * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את התהליך stepwise של לייצר ייצוגים חזותיים של ה-DNA השינויים בתוך גרעין האטום. בזמן רגיש ו מאריכות, טכניקות אלו בעלי מספר מגבלות.
יש צורך להדגיש כי הנתונים המופקים 2.5D מגרשים, פרופילים עוצמת האות וניתוח colocalization הם כמותיים למחצה בטבע. בשל נקודה אחרי נקודה תאורה המדגם במהלך ייבוא תמונות על לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי סורק, עוצמות האות מוחלטת של כל ערוץ נרשמים. עם זאת, אלו אינם מגניטודות המוחלט של 5hmC, 5caC להיות שזוהו ורק מייצגים סימנים של נוכחות, היעדרות או קנה המידה של הסימנים האלו epigenetic.
בשל אופיו חוזרות של אות amplifications, מגבלות תואמים סדר הגודל של מכונות שהוחל להגביר את האות באופן בלתי נמנע וחיסול הערכות של תפוסת גנומית הפיזי האמיתי של אלה סימני34. לוקליזציה גנומית האמיתי של סימנים אלה ייתכן יהיו מטושטשים על ידי אלה חלבונים מגושם, אשר פיזית לכבוש שטחים ונלכדים בכלל גבולות רזולוציה מיטבית קונאפוקלית של 200-300 ננומטר34. יתר על כן, עוצמות האות והערוצים עבור כל סימן אין מה להשוות אחד לשני בשל הבדלי רגישות נוגדן, fluorophore ההטיה34. עם זאת המידע שהושג עם הדמיה שופך אור על הארגון יכולות של הסימנים גנומית.
עבור כימות מדויק של אותות 5hmC ו- 5caC, גרעינים מודגש, כיתרו נגד counterstain דאפי, בבירור התוחם את האזור כדי להיות מנותח. הליך זה dispenses עם הדרישה לכיול סף חסימה כמו רעש רקע זה התעלמו בתהליך ידני של בחירת גרעינים1. אוטומציה של תהליך זה ניתן להשיג את התוכנה העדכנית ביותר, אשר מאפשר פילוח הגרעיני שיש לבצע. בעוד תוכנה חלופית חופשית חבילות כגון פיג'י זמינים עבור ניתוח colocalization, חסרונות כגון הדרישה כדי להמיר תמונות בפורמטים בינאריים 8 סיביות, מיסוך תמונות, הזנת נתונים אי-הכללה של גודל לבחירת מחוזות לעניין הגבלת משתמש-נגישות של תוכנית זו. בנוסף, בהתחשב שהכולל מוגבל רמות של 5hmC ו 5caC הגנום בשילוב עם מיקומם הדומיננטית תהיה אזורים ו, דלדול של רצפי CpG גנומית באופן כללי, המקיפות ידנית של גרעינים מציג למשתמש-הטיה. לכן, סימון של גרעינים באופן אוטומטי מבוסס על ההנחה כל האירועים המתרחשים בתוך אזור במתחם להיות חיובי, תוך התעלמות פיקסלים רקע אשר עשוי להיות נוכח. לפיכך, ניתוח תמונות בהתבסס על עוצמת פיקסל עשויים להיות משמעותיים יותר. גורמים אלה חשובים כאשר שוקלים את השימוש של Mander מקדם colocalization לנתח את מידת החפיפה המרחבי בין שני אותות, ללא התחשבות עוצמות האות שלהם בתקופה מקדם המתאם של פירסון המניחה הקשר הליניארי בין אותות.
בסך הכל, הטכניקות המתוארות כאן נושאים את הנושא של ייצוג חזותי של נתונים ביולוגיים בתבנית אינטואיטיבי. בזמן ניתוח תמונות למחצה כמותיים לא יכולה להחליף. טכניקות עוצמתיות כמו ספקטרומטר מסה מבחינת רגישות או גנום יחיד רזולוציה בסיס רחב רצף, הוא מספק נתונים משלימים ומאפשר מסקנות, השערות. הגה מניתוח של תמונות עם דיוק.
Disclosures
אין פוטנציאל ניגודי עניינים פורסמו.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה [BB/N005759/1 ל ע. ר]. NRFH מומן על ידי הקרן Rosetrees, הקרן Stoneygate [A1130 / M546]. המיקרוסקופ Zeiss Elyra PS.1, עיבוד מחשבים ותוכנות היו ממומן על-ידי BBSRC BB/L013827/1 / (רב תחומיים סופר רזולוציה מיקרוסקופ מתקן אוניברסיטת נוטינגהאם גרנט)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
References
- Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).
- Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).
- Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
- Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).
- Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).
- Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).
- Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).
- Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).
- Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
- Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71 (5), 865-873 (1992).
- Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20 (1), 85-93 (1980).
- DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).
- Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).
- Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).
- Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).
- Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).
- Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).
- Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).
- Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17 (1), 141 (2016).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).
- He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).
- Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).
- Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).
- Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).
- Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
- Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5 (12), e15367 (2010).
- Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , Springer. 125-137 (2016).
- Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).
- Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
- Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).
