Summary
Yeni 5-metilsitozin (oksi-mCs), 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) oksitlenmiş formları bulunan ve 5-carboxylcytosine (5caC) farklı DNA değişiklikleri benzersiz işlevsel roller ile temsil edebilir. Yarı nicel bir iş akışı görselleştirme oksi-mCs kayma dağıtım, sinyal şiddeti profil oluşturma ve colocalization için burada kullanılmıştır.
Abstract
Birkaç on yıl için 5-metilsitozin (5mC) tek DNA değiştirmeyi metazoans fonksiyonel bir önemi olması düşünülmektedir. 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) ve 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC enzimatik oksidasyon yanı sıra N6-methyladenine (6mA) çok hücreli organizmalar DNA tespiti keşfi ek derecelerde sağlanan epigenetik araştırmaya karmaşıklığı. Deneysel kanıt büyüyen gövdesini göre bu roman DNA değişiklikleri farklı hücresel ve gelişimsel işlemlerinde belirli rol oynayabilir. Önemlisi, bu işaretleri (e. g. 5hmC, 5fC ve 5caC) sergi doku - ve gelişimsel sahne özel olay omurgalılarda, bazıları olarak değerlendirilmesi olarak DNA değişiklikleri kayma dağılımını sağlayan önemli bir araç İmmünokimya temsil eder farklı biyolojik bağlamlarda. Burada confocal mikroskobu tarafından takip immunostaining tarafından görüntülenmiştir DNA değişiklikleri Hesaplamalı analizi için yöntemler açıklanır. Özellikle yoğunluğu araziler 2.5 Boyut (2.5 D) nesil sinyal, sinyal şiddeti profilleri, birden çok hücre ve sinyal colocalization katsayıları belirlenmesi şiddeti boyama miktar gösterilir. Toplu olarak, bu tekniklerin düzeyleri ve biyolojik rollerine metazoans içinde elucidating için katkıda bulunan çekirdek olarak bu DNA değişiklikleri yerelleştirilmesini değerlendirilmesinde çalıştırılamaz durumda olabilir.
Introduction
DNA metilasyonu, transkripsiyon yönetmelik ile ilişkili bir iyi belgelenmiş mekanizması gerektirir bir 5'-sitozin-fosfat-guanin-3 sitozin kalıntılarında modifikasyonu ' (KSY) dinükleotit bağlam metil grubu eklenmesi ile (-CH3) 5- 5-metilsitozin (5mC)1kurmaya sitozin pirimidin yüzük Karbon atomu. Memelilerde, CpGs yaklaşık % 70'i kendiliğinden deaminate 5mC mutajenik eğilimi timin2sayesinde bu palindromik sırası tükenmiş olarak sadece %1 onların genleri oluşturan metillenmiş. Gen organizatörü dizileri üzerinde metil gruplarının varlığı omurgalılar3,4,5' te transkripsiyon baskı ile güçlü korelasyon göster. Bu metil grubu eklenmesi katalize son derece korunmuş DNA Metiltransferaz (DNMT) enzim DNMT3a, 3b ve 3 L ve sırasıyla KSY cytosines de novo ve bakım metilasyonu içeriklerde değişiklik DNMT1 tarafından6. DNMT3A/B ifade embriyonik kök hücreler ve epiblast geliştirme sırasında yüksek; Ancak azalan ifadesini pluripotent hücre lineage taahhüt somatik kader farklılaşma8sırasında takip görülmektedir. Bir işlevsel artıklık paylaşmak Iken, düzgün fare embriyo tespit 3a ama ağırlıklı olarak neuroectoderm ve koryonik ektoderm doku8için yerelleştirilmiş 3b ile doku özgü ifade desenleri, DNMT3a ve 3b görüntüler.
Metilasyon imzalar mitoz ve mayoz10sırasında devralınabilir. Bakım metilasyonu hemi metillenmiş palindromları çift iplikçikli DNA11mevcut CpG sitozin kalıntılarının kolaylaştırdı DNMT1 değişiklik içerir. Sonuç olarak, genomik metilasyonu hücre döngüsü12S aşamasında en yüksek düzeyde ve DNMT1 bağlar DNA çoğaltma, Çatallar11 . DNMT1 böylece yeni sentezlenmiş DNA iplikçikleri ayırt etme, x kromozomu inactivation teşvik ve transkripsiyon baskı profilleri13sürdürmek değiştirilmediğinden cytosines methylates. Hemi metillenmiş DNA CpG dizileri tanıma programını DNMT1 kurulan desen de novo metilasyonu örneğin baskı uzun serpiştirilmiş nükleer öğesi 1 (Satır1) sinirlari metilasyon korur. retrotransposon rehberleri onun potansiyel kanserojen yayma14etkisizleştirmek için. DNA tercihli bağlama benzeşme Hemi metillenmiş sahip olsa da, DNMT1 bazlar CpG Adası (CGI) dizileri DNMT3a/b - / - mutant hücrelerdeki bir acil durum de novo metilasyonu rolünü15 uygun methylate . Böylece DNA çoğaltma16yarı muhafazakar doğası nedeniyle, bakım metilasyonu sadakatle kızı hücre17üst öğesinden metilasyonu imzalar özetlemek.
Ancak, gen için dinamik olarak ayarlanmış, baskıcı metilasyonu değişiklik olması ifade, hangi pasif ve aktif demethylation mekanizmaları18tarafından elde edilebilir silinmesi gerekir. Korunmuş dioxygenase proteinlerin ailesine ait on-Eleven translokaz (TET) proteinler CpG artıkları19metil gruplarının yinelemeli oksidasyon yeteneğine sahiptirler. Bu Tet proteinler, J-temel proteinler Trypanosome bruceiiiçinde keşfetti (JBP) için homolog tanımak ve değiştirilmiş DNA bind örneğin 5mC üsleri ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5 - bu kalıntıları oksijen carboxylcytosine (5caC)20. Ancak 5 fC ve 5caC değişiklikleri doğrudan 5mC oksidasyon21, sentez Tet protein oksidasyon kademeli conformation değişikliğinden metil yapılandırmaları, hidroksil, karbonil ve karboksilat 5mC sonuçlarının kolaylaştırdı 22 , 23 , 24.
TET protein etkinliği onların yönetmelik anlamada bilgilendirici belirtisi dağıtım ve bereket oksi-metil-sitozin işaretlerinin okuyor. KSY zavallı rehberleri önemli 5mC varlığı aksine bazlar CpG zengin bölgeleri tespit, ikinci varlık CpG karakteristik25Adaları. Dokular arasında oral mukoza sergi iken en büyük hypomethylation, beyin, testis ve kan belirli metilasyonu görülmektedir en yüksek doku doku belirli rehberleri26, meydana gelen bir değişiklik metilasyonu desen gösteren.
Duyarlı anti-5mC ve anti-5hmC kullanarak aracılığıyla antikorlar seçici metil/hydroxymethyl DNA'sı immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) ve sonraki yüksek işlem hacmi sıralama, Ficz vd. , yüksek 5hmC doluluk rehberleri, gösterdi, kök hücreleri27ekzonlar ve düşük 5mC seviyeleri, bu yerlerdeki fare embriyonik ile ilişkili hat-1 retrotransposon dizileri. Ters, en büyük 5mC zenginleştirme 5hmC varlığı sınırlı28neredeydi tekrarlayan uydu dizileri görülmüştür. İnsan ön lobunda beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar son derece önemli 5hmC zenginleştirme, dört kat daha yüksek fare embriyonik kök hücre28ortaya koyuyor. Önceki gözlemleri ile uyum içinde yüksek işlem hacmi sıralama frontal lob resimli doku çoğunluğu 55-%59 5hmC sinyal CpG organizatörü bölgeler, gen organları ve yaklaşık % 6 doluluk intergenic, % 35-38'lik düşük yoğunluklu yerelleştirilmiş bölgeler. Buna ek olarak, 5mC intergenic bölgeler (% 25-26) ve daha yüksek gen organları (52-%55) içinde zenginleştirilmiş ama organizatörü, azaltılmış (22-%24)29dizileri. 5 fC ve 5caC dağıtımları üzerine araştırmalar sınırlıdır ancak bu çalışmalar embriyonik kök hücreler ve somatik doku, özellikle beyin, 5hmC zenginliği gösteriyor.
İlginçtir ki, son zamanlarda Ökaryotlar, metilasyon pozisyon 6 azot (N6), adenin kalıntılarının keşfetti (6mA) ekran genomik bereket profil ters 5mC30. Sıvı Kromatografi birleştiğinde tandem kütle spektrometresi gözlemler ortaya 6mA mutlak düzeyleri fazla zebra balığı ve domuz erken embriyolar sperm onun düzeyleri (% 0,003 genomik adenines) ile karşılaştırıldığında var döllenme giderek artan morula gelişimsel sahne (33 kat sperm yüksek) girmeyi başaran ve %0,004 genomik adenines31somatik düzeyde kararlı duruma ulaştı. Immunoprecipitation zenginleştirilmiş 6mA DNA dizilerinin baskın doluluk (yaklaşık % 80'i Zenginleştirme) bu işareti yinelenen öğe bölgeleri ve transkripsiyon başlangıç siteleri32olarak göstermiştir. Bu gözlemler contextualize ve 6mA demethylase boş e keşfi doğrulamakmbryonic kök hücre birikmiş 6mA sergilenmesi hat-1 retrotransposon susturmak wildtype hücrelerdeki transcriptionally etkin öğelere göre aracılık. Bu veriler bir transkripsiyon düzenleyici fonksiyonu 6mA33için öneririz.
Varlığı ya da yokluğu oksitlenmiş metilsitozin türevleri (oksi-mCs) sonraki DIP deneyleri için birleştiğinde konjuge biyokimyasal etiketleri gösterir iken onlar kayma dağıtım veya bu işaretleri34, ölçülebilir bilgi vermek olamaz 35. son zamanlarda gelişmiş365hmC ve 5caC hassas immunochemical tespiti için bir protokol yapıldı. Tarama lazer confocal mikroskobu kullanan ile birleştiğinde bu Birleşik fluorophore ikincil immunostaining antikor tabanlı yöntem böylece hücrelerin içindeki bu DNA değişiklikleri görsel yerelleştirme sağlayan benzersiz avantajı sahip olur, bireysel vurgulayan olumlu veya olumsuz yönde bu işaretleri türdeş olmayan varlığı ile karşılık gelen hücreler lekeli. 5hmC ve 5caC mutlak sinyal yoğunluklarını konjuge antikorlar tarafından güçlendirilmiş pozisyonları bu izlerini çekirdek içinde ve büyüklüğü hakkında örneğin heterochromatic ve euchromatic bölgelerinde önerilecek yarı kantitatif Yorumları etkinleştirmek 37 , 38. burada bir teknik confocal mikroskobu görüntüleri Hesaplamalı analizi için kod sayfası kullanılmıştır. Farklı 5hmC görüntülemek için 2.5D kayma dağıtım nesil çizer ve 5caC sinyal doruklarına başına piksel ve konumlarına çekirdekleri içinde gösterdi. Çubuk grafik 5hmC araziler ve 5caC sinyal şiddeti profilleri bu işaretleri bolca tepeler olarak eğilimleri göstermek ve tekneler ayrı üst üste kanal olarak çizilir. Son olarak, colocalization işlevini uygulayarak, bir sinyal yakınlık derecesi belirlenebilir ve bunun sonucu olarak, onların anılan sıraya göre genomik koordinatları tespit edilebilir.
Protocol
1. nesil Confocal görüntüleri
- Abakir vd tarafından açıklandığı gibi boyama immunohistokimyasal sitozin değiştirilmiş formları analizi için hazırlık olarak, gerçekleştirmek 34.
- bir mikroskop kullanarak slayt görüntüleme gerçekleştirmek ve dosyaları bir LSM biçiminde kaydettiğinizde.
Not: Otelde yoğunluğu karşılaştırma örnekleri arasında lazer güç ve her kanal için kazanç için kullanılan değerleri profilleri yordamı doğrudan karşılaştırma için görüntü analiz aşamasında izin alarak görüntü boyunca sürdürülmelidir.
2. Yoğunluk 2.5D Arsalar nesil
- yazılım (örneğin, Zen siyah) açın ve seçin ' görüntü işleme '.
- Dosya menüsüne gidin ve Aç'ý seçin. İşlem gerektirdiği resmi seçin.
- Tıklayın ' tümünü göster ' tüm grafik denetimleri görünür hale getirmek için resmi aşağıda. Ekranın alt yarısında üç sekme vardır; ' Boyutları ', ' ekran ' ve ' grafik ', select ' grafik ' sekmesini
- Seç ' dikdörtgen ' çekirdeği/ilgi alanı seçmek için aracı.
- Select ' bölge kesmek ' Görüntüyü kırpmak için. Bu, ayrı sekme içinde kırpılmış bölge için yeni bir resim oluşturur
- Dosya menüsüne gidin ve Save As ver dosyayı bir ad seçin ve bir LSM veya CHİ dosyası kaydedin.
- Yazılım (örneğin, Zen mavi) açıp seçin ' Zen Resepsiyon '.
- Zen siyah kırpılmış görüntü dosyayı seçerek ve Dosya menüsünde Zen mavi için göndermek ve Zen 2012-mavi baskı için Gönder seçeneðini belirleyin. Kırpılmış görüntü daha sonra ilgili programda açabilirsiniz.
Not: 2.5 D yoğunluk arsa özelliği Zen siyah 2012 yılında aynı anda birden fazla kanal görüntü görüntü yok çünkü görüntü dosya aktarılır. - Görüntünün sol tarafta etiketli sekmesini seçin ' 2.5D ', bu resim 2.5 d görselleştirme sağlar. ' I tıklatın ' tümünü göster ' tüm grafik denetimleri görünür kılmak için.
- Solunda ve görüntüsünün altında yer alan dört gri çubuk kullanarak Alter görselleştirme ayarlarını.
Not: sol el çubuğu, ekranın üst yakınlaştırma =. Sol el bar, ekranın alt kısmında ekseninde dönüş görüntü =. Sol el ekranın alt çubuk rotasyon görüntüsünün =. Ekranın sağ el bar = genişletin ve sözleşme ölçek çubukları alt. - Bu render modu seçili olduğundan yüzey bu bireysel zirvesinin en iyi görselleştirme verir gibi olun.
- Alter kılavuz uzaklığı yüzde yüzde, alt değiştirerek daha fazla tanımlanan her bireysel zirve.
- 2.5 D görüntü kaydetmek için ilk 2.5 D arsa altındaki gri oku tıklayarak sağ tarafta ve grafik araçları görüntü aşağıdaki dosya listesinde gizle (yanında ' göstermek tüm '), bu dağ eteğindeki taş yığını doldurmak için görüntüyü genişletmek izin grafik sekmeleri gizler n. 2.5 D arsa kaydetmek için tuşuna basın ' PrtSc ' anahtar üstünde belgili tanımlık klavye. Bu bir ekran görüntüsünün yakalayacaktır. Microsoft Paint'te ekran yapıştırmak ve kaydetmeden önce görüntü kırpma.
3. Yoğunluk Profiling
- yazılım (örneğin, Zen siyah) açın ve görüntü işleme seçin.
- Dosya menüsüne gidin ve Aç'ý seçin. İşlem gerektirdiği resmi seçin.
- Görüntü ekranda göründüğü şekilde görüntünün sol tarafta etiketli sekmesini seçin ' profil '.
- Alt ekranın yarısını seçme (tıkırtı) ' tümünü göster ' sekme. Bu tüm biçimlendirme seçeneklerine erişim sağlayacaktır.
- Ekranın alt yarısında üç sekme; vardır ' boyutları ', ' ekran ' ve ' ProfileƆ seçin ' profil ' ve seçme (tıkırtı) ' tablo ' kutusu. Seçin ' ok ' düğmesini.
- Görüntü üzerinde bir başlangıç noktasını seçin ve hücreler sürekli bir sayı üzerinde fareyi sürükleyin için fareyi kullanın. Bir yoğunluk arsa hattı boyunca hücreler için üretmek için fare düğmesini bırakın; Ayrıca tablo yoğunluk ölçüm verileri için her dalga boyu için hattı boyunca piksel tarafından doldurulur.
Not: Tablo hangi piksel yoğunluğu okumak için kırmızı, yeşil ve mavi Floresans mesafe (µm) sağlayacaktır. - Bu verileri dışa aktarmak için sağ tablo, select tıklayın ' Tablo Kaydet … ' ve uygun bir konuma bir .txt dosyası olarak kaydedin.
- Seçili yoğunluğu profil görüntü kaydetmek için Dosya menüsünden seçin ve seçin ' ihracat … '. Açılan pencerede seçin ' etiketli görüntü dosyası (biçimi) ' ve ' içeriği görüntü penceresinde - tek bölme (veri) ' tıklatarak takip ' dosya adı seçin ve Kaydet … ' uygun bir konum seçin ve'ı tıklatın ' kurtarmak '.
- Her bireysel şiddeti profil alanları görme ve analiz etmek için profil sayısı bağlı olarak için işlemi tekrarlayın.
- Alma yoğunluğu (bkz: 3.7) kaydedilen veriler profilleri ve istatistiksel analiz tarafından takip bir elektronik tablo içinde analiz.
4. Co yerelleştirme analizi
- yazılım açın ve seçin ' görüntü işleme '.
- Dosya menüsüne gidin ve Aç'ý seçin. İşlem gerektirdiği resmi seçin.
- Görüntü ekranda göründüğü şekilde görüntünün sol tarafta etiketli sekmesini seçin ' Coloc '.
- Alt ekranın yarısını seçme (tıkırtı) ' tümünü göster ' sekme. Bu tüm biçimlendirme seçeneklerine erişim sağlayacaktır.
- Ekranın alt yarısında dört sekme; vardır ' boyutları ', ' ekran ', ' grafik ' ve ' ColocalizationƆ seçin ' Colocalization ' ve tıkırtı belgili tanımlık kutu için ' tablo ' ve ' görüntü '.
- Üst kısmında bu sekmeyi (yakın metin fare aracın üzerine geldiğinde görünecek Bezier) boyunca simgesi üçüncü sonra tek bir hücre çekirdeği sarmak için bu aracı kullanın değerleri bu çekirdeklerin will için sonra tabloda görünür seçin.
Not: kırmızı ekranın sol panelinde görüntülenir yeşil Floresans karşı bir dağılım çizim deklanşörü her çekirdek için üretilmektedir. Eksen sonra hücreleri eşik bağlı olarak dışarı kapı için taşınır. Faiz çekirdekleri görüntüleri el ile seçtiğinizde, sıfır yukarıda gating Eşikleri ayarlama gerekli değildir. Tüm piksel yoğunluğu değerleri nükleer parametreleri içinde gözlenen olumlu sinyal olarak kabul edilir.
- Üst kısmında bu sekmeyi (yakın metin fare aracın üzerine geldiğinde görünecek Bezier) boyunca simgesi üçüncü sonra tek bir hücre çekirdeği sarmak için bu aracı kullanın değerleri bu çekirdeklerin will için sonra tabloda görünür seçin.
- Üçüncü simgeyi seçme belgili tanımlık etiket ve veri kümesi tamamlanıncaya kadar sonraki çekirdeği çevreleyen bu işlemi yineleyin.
- Bu verileri vermek için tabloyu sağ tıklatın, tabloyu seçin ve uygun bir konuma kaydedin.
- Colocalization görüntü kaydetmek için Dosya menüsünden seçin ve seçin ' ihracat … ' sonra seçin; Etiketli görüntü dosyası (biçimi) ve ' Görüntü penceresinin içeriğini – tek uçak (veri) ' tıklayarak takip ' dosya adı seçin ve Kaydet … ', uygun bir konum seçin ve'ı tıklatın ' kurtarmak '.
- Arsa istatistiksel analiz tarafından takip bir elektronik tablodaki verilerde colocalization.
Representative Results
5hmC ve 5caC bu DNA değişiklikler hepatik ataları immunostained slaytlarını ayırt içinde kayma dağılımını belirlemek için bir mikroskop kullanarak görüntüsü.
Bu oksi-mCs mekansal dağılımının ilk analizi 2.5 D yoğunluk araziler (şekil 1A, 1B) üretimi gerçekleştirilmiştir. Kırmızı ve yeşil tepeler turuncu doruklarına 5caC ve 5hmC sinyalleri sadece küçük bir çakışma gösteren sınırlı varlığı ile iyi tanımlanmış olduğu ortaya çıktı. Bu sonuçlar ile anlaşma, 5hmC ve 5caC yoğunluklarını karşılık gelen hücre profilleri şiddetle birbirleri ile (şekil 1 c) örtüşüp. Bu sadece o Tet-bağımlı oksidasyon 5mC yol açar bu DNA değişiklik belirli Kromatin içinde farklı oksitlenmiş türevleri nesil düşündüren hepatik ataları nükleer dağıtım farklı desenler sergi 5caC ve 5hmC biri bölgeler.
Düzeyde 5caC ve 5hmC Daoy medulloblastoma ve BXD-1425EPN olduğunu gösteriyor hücreleri karşılaştırmak için immunostaining için bu oksi-mCs aynı deneysel koşullar altında her iki örnekleri gerçekleştirilmiştir. Yoğunluklarını 5caC ve 5hmC sinyallerin sonra 20 profilleri her hücre satırı için kaydedilen 3-5 hücreler boyunca oluşturulan karşılaştırıldığında (şekil 2A-2D). Bu sonuçlar miktar BXD-1425EPN hücreleri 5hmC ve 5caC immunostaining (şekil 2B) Daoy hücrelere kıyasla daha düşük düzeyde sergi saptandı.
İki kanal kırmızı (5hmC) ve yeşil (5caC) göz önüne alındığında hangi ile belirtilen R ve G sırasıyla, Pearson korelasyon katsayısı (PCC) açıklar kayma örtüşme ve R co ayrılığı derecesini & her iki işaretleri varsayarak G mevcut bir doğrusal birbirleriyle ilişkileri, R Hayatinizda34tarafından gösterilir. R2 tarafından belirtilen PCC değer kare alma kırmızı sinyal şiddeti34tarafından etkilenir yeşil sinyal şiddeti varyasyon ölçüm sağlar. Bu bizim 5caC vs 5hmC co yerelleştirme analiz için yersiz olur.
Kayma dağıtım indüksiyon sonraki 24 saat (HE24) 5caC ve 5hmC farklılaşmamış (Undiff) hiPSCs ve hepatik endoderm incelemek için bu DNA değişiklikleri analizini colocalization R değerleri 20 ile aynı confocal görüntüleri gerçekleştirilmiştir çekirdeklerin her hücre satırı (şekil 3A-3 C) için analiz.
Bu sonuçlar miktar colocalization derecesi önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir (P < 0,05) Undiff (şekil 3 c) göre HE24 içinde. Bu 5caC varlığı azaltılmış büyüklüğü ve bu nedenle düşük sinyal şiddeti Undiff hücrelerdeki atfedilebilecek olabilir.
Şekil 1: 72 saat sonrası indüksiyon farklılaşma, hepatik endoderm ataları ve immunohistokimyasal boyama. (A)5hmC (kırmızı), 5caC (yeşil) ve DAPI nükleer sayaç leke (mavi) Co boyama. Beyaz Kesikli ok 'B' 1 Cresimli çekirdeği ile örneklenen profil oluşturma yönünde gösterir. Ölçek çubuğu temsil eder 5 µm. kırmızı kanalı: 800 kazanç, lazer % 1. Yeşil kanal: 750 kazanç, lazer % 2.4. DAPI kanal: 750 kazanç, lazer % 2.6. (B) 2.5 D yoğunluk arsa 5hmC, 5caC ve DAPI sinyalleri. Bireysel doruklarına mutlak sinyal yoğunluklarda her pikselin temsil eder. Birleştirilmiş gösterim ve ayrı kanallar gösterilir. (C) yoğunluğu profilleri, 5hmC, 5caC ve hepatik ataları 72 saat sonrası indüksiyon farklılaşma, DAPI sinyalleri. En yüksek yoğunluklarda beyaz Kesikli ok 'B' boyut üzerinde kaydedildi ve yoğunluk profil x-ekseni boyunca siyah bir kesik okla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: 5hmC ve 5caC analizi sinyal yoğunluklarını Daoy medulloblastoma ve BXD-1425EPN olduğunu gösteriyor hücre satırlarını. (A)immünfloresan 5hmC (kırmızı) ve 5caC Daoy ve BXD-1425EPN hücrelerinde (yeşil) boyama. Görüntüleri 63 x yağı daldırma objektif lens, her ikisi de aynı ayarları ile ele geçirildi. Birleştirilmiş gösterim ve ayrı kanallar gösterilir. Ölçek çubukları temsil 10 µm. kırmızı kanalı: 746 kazanç, lazer % 1. Yeşil kanal: 750 kazanç, lazer % 2.4. (B) Daoy ve (C) BXD-1425EPN tek tek hücreler bitişik resimler genişletilir. Ölçek çubukları (B) ve (C) temsil 5 µm. (D) ortalama Floresans yoğunluğunu 5hmC vs 5caC sinyalleri Daoy ve BXD-1425EPN hücrelerdeki (n = 20, SD). Önemi değerlendirildi kullanarak bir F-test ve iki örnek t-test yıldız istatistiksel olarak anlamlı p değerleri belirtmek ** p olarak < 0,01 ve *** p olarak < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: farklılaşmamış hiPSCs (Undiff) 5hmC ve 5caC mutlak sinyalleri analizini Colocalization karşılaştırıldığında hepatik endoderm için 24 saat sonrası farklılaştırılmış progenitör hücre (HE24). Confocal mikroskobu görüntüler(a)hiPSCs ve (B) HE24 hücre 5hmC (kırmızı), 5caC (yeşil) ve DAPI (mavi) için lekeli farklılaşmamış. Hücreleri 63 X yağı daldırma lens aynı ayarları ile görüntüsü. 20 deklanşörü çekirdeği colocalization analiz için örnek hücreleri göstermek. Ölçek çubukları temsil 20 µm. kırmızı kanalı: 800 kazanç, lazer % 1. Yeşil kanal: 750 kazanç, lazer % 2.4. DAPI kanal: 750 kazanç, lazer % 2.6. (C) 5caC sinyal 5hmC yakınlık undiff ve HE24 aralığında varlığı Colocalization analizi (n = 20, SD). Önemi değerlendirildi kullanarak bir F-test ve iki örnek t-test yıldız istatistiksel olarak anlamlı p değerleri belirtmek * p < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu iletişim kuralı DNA değişiklikler hücre çekirdeği içinde görsel gösterimleri üreten kademeli işlemini açıklar. Hassas ve etkili iken, bu tekniklerin sınırlamalar bir dizi sahip.
2.5 D oluşturulan verilerin grafiğini çizer, sinyal şiddeti profilleri ve colocalization analiz doğada yarı kantitatif vurgulamak gereklidir. Noktasına aydınlatma örnek sayesinde confocal mikroskobu tarama lazer üzerinde resim alma sırasında mutlak sinyal yoğunluklarda her kanal kaydedilir. Ancak, mutlak büyüklükleri 5hmC, bunlar değil ve 5caC olmanın algılanan ve tek varlığı, yokluğu veya ölçek bu epigenetik izlerini belirtileri temsil eder.
Sinyal Arttırımlar tekrarlayan yapısı nedeniyle, makine kaçınılmaz olarak sinyal artırmak için uygulanan sınırlamaları büyüklüğü ile tutarlı yaklaşımları bu işaretleri34gerçek fiziksel genomik İskan izni yıkmak. Bu işaretleri doğru genomik lokalizasyonu fiziksel olarak işgal alanlarda bile en iyi confocal çözünürlük limitlerde 200-300 nm34çözülemeyen bu hantal proteinler tarafından görünmeyebilir. Ayrıca, her işareti bireysel kanallarda sinyal yoğunluklarda birbirine antikor duyarlılık ve fluorophore konjugasyon34farklılıklar nedeniyle karşılaştırılamaz. Ancak elde edilen bilgiler ile görüntülemede genomik işaretleri zamansal ve mekansal organizasyonu ışık tutuyor.
İçin doğru Nefelometri 5hmC ve 5caC sinyallerin çekirdeği vurgulanmış ve açıkça çözümlenmesi için bölge tirelemeye DAPI counterstain karşı çevrili. Arka plan gürültü çekirdeği1seçerek el ile işleminde göz ardı sıra gating Eşikleri ayarlama için şartı ile bu yordamı dağıtır. Bir otomasyon, bu işlemin yapılması nükleer segmentasyon sağlayan en son yazılım elde edilebilir. FIJI gibi colocalization analizi, görüntüleri ikili 8 bit biçimlerine dönüştürmek için ihtiyaç gibi sakıncaları için kullanılabilir ücretsiz alternatif yazılım paketleri iken görüntü maskeleme ve boyutu dışlama veri bölgelerinde seçmek için giren sınırı faiz Bu programın kullanıcı erişilebilirlik. Ayrıca, genel düzeyde 5hmC ve 5caC genel olarak euchromatic bölgeler ve genomik CpG dizileri tükenmesi onların hakim konumda birleştiğinde genom içinde sınırlı göz önüne alındığında, el ile çekirdekleri çevreleyen kullanıcı-önyargı tanıtır. Bu nedenle, otomatik olarak çekirdekleri vurgulayarak pozitif olarak belirlenmis bölge içinde gerçekleşen tüm olayların varsayar ve mevcut olabilir herhangi bir artalan pikselleri yoksayar. Böylece, piksel yoğunluğu üzerinde göre görüntü analiz daha anlamlı olabilir. Bu faktörler dikkate alınarak Mander'ın colocalization katsayısı Pearson korelasyon katsayısı için varsayan oppose gibi onların sinyal yoğunluklarda bakılmaksızın iki sinyal arasında kayma örtüşme derecesine analiz kullanımı önemli bir sinyalleri arasında doğrusal ilişki.
Genel olarak, burada özetlenen teknikleri biyolojik veri görsel temsilini Tema sezgisel bir biçimde taşımak. Yarı kantitatif görüntü analizi açısından hassasiyeti veya tek temel çözünürlük genom kütle spektrometresi gibi güçlü teknikleri yerini değil iken geniş sıralama, bu çıkarımlar ve hipotezler olmak izin tamamlayıcı veri sağlamak analiz hassas görüntülerin gebe.
Disclosures
Hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları açıklanması.
Acknowledgments
İş Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi [BB/N005759/1'e A.R.] tarafından desteklenmiştir. NRFH finanse Rosetrees güven ve Stoneygate güven [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskop, işleme bilgisayar ve yazılım tarafından BBSRC BB L013827 1 / / (multidisipliner süper çözünürlük mikroskobu tesisinde Nottingham Üniversitesi grant) finanse edilmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
References
- Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).
- Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).
- Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
- Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).
- Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).
- Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).
- Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).
- Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).
- Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
- Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71 (5), 865-873 (1992).
- Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20 (1), 85-93 (1980).
- DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).
- Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).
- Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).
- Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).
- Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).
- Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).
- Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).
- Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17 (1), 141 (2016).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).
- He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).
- Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).
- Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).
- Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).
- Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
- Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5 (12), e15367 (2010).
- Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , Springer. 125-137 (2016).
- Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).
- Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
- Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).
