Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56319
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

يصف لنا طريقة سهلة وسريعة وغير مكلفة نسبيا لتوليد الجينات تعطل العقدية mutans سلالات؛ قد يكون هذا الأسلوب تكييف لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.

Abstract

أساليب نموذجية لتوضيح وظيفة الجينات خاصة تشمل التحليلات المقارنة المظهرية من سلالة البرية من نوع وسلالة التي تعطلت في الجينات للفائدة. بنية الحمض النووي تعطيل جينات التي تحتوي على جينات مقاومة للمضادات الحيوية مناسبة علامة مفيد لتوليد سلالات تعطلت الجين في البكتيريا. ومع ذلك، أساليب البناء التقليدية، التي تتطلب خطوات استنساخ الجينات، تنطوي على بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، يتم وصف طريقة سهلة نسبيا وسريعة، وفعالة من حيث التكلفة لتعطيل الجينات المستهدفة في mutans العقدية . ويستخدم الأسلوب انصهار 2-الخطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتوليد بنية التعطيل وانهانسر للتحول الوراثي. هذا الأسلوب لا يتطلب فعل الانزيمية، عدا بكر، بالإضافة إلى ذلك يوفر مرونة أكبر فيما يتعلق بتصميم بنية التعطيل. توظيف انهانسر يسهل إعداد الخلايا المختصة ويحسن كفاءة التحويل. الأسلوب الحالي قد تكون مناسبة لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.

Introduction

عادة ما ينطوي على تحليل وظيفة الجينات مقارنة المظهرية بين سلالة البرية من نوع وسلالة قد تعطلت فيها جين معين للفائدة. وقد استخدمت هذا الأسلوب تعطيل الجينات لتحليلات وظيفة الجينات في مجموعة واسعة من الأصناف، من البكتيريا إلى الثدييات. بناء جينات تعطل ضروري لتوليد سلالة تعطل الجينات؛ هذا بنية الحمض الخلوي الصبغي (DNA) يتكون من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية علامة تنصهر إلى المنبع والمصب المرافقة مناطق الجينات المستهدفة، وأدمجت في الجينوم عن طريق جزئ مثلى. قد يكون سلالة تعطل الجينات المعزولة باستخدام وسائل الإعلام الانتقائي التي تحتوي على المضادات الحيوية. الطريقة التقليدية المستخدمة في تشييد سلالة الجينات تعطل يتطلب خطوات معقدة، مثل تضخيم الجينات المستهدفة بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ربط الجين في بلازميد مناسبة، الهضم مع تقييد الإنزيمات، وريليجيشن لإدراج الجين علامة مقاومة المضادات الحيوية. هذه العملية مضيعة للوقت، أخذ عدة أيام إلى عدة أسابيع، اعتماداً على نجاح كل خطوة. وبالإضافة إلى ذلك، تصميم بنيات تعطيل اعتماداً على مواقع إنزيم التقييد للجينات المستهدفة. لحل هذه المشكلات، أبلغ عن الحمض النووي القائم على بكر الربط أساليب1،2 لتصميم طفرات الجينات تعطل ديسكويديوم ديكتيوستيليوم3 وسينيتشوسيستيس sp. PCC68034 . في هذه الدراسة، تم تطوير أسلوب لتوليد سلالة العقدية تعطل الجينات بطريقة سريعة، وسهلة، وغير مكلفة نسبيا، استخدام أسلوب المستندة إلى بكر معدلة (عين 2-الخطوة الانصهار PCR) لتشييد تعطل بناء وانهانسر للتحول الوراثي.

2-الخطوة الانصهار يتطلب PCR الحمض النووي والجينات المقاومة للمضادات الحيوية علامة كقالب PCR، وأربعة أزواج من الأنسب المصممة اليغنوكليوتيد كبسولة تفجير. في الخطوة الأولى (1st PCR)، منطقة ترافقه المنبع 1 كيلوبايت من الجينات المستهدفة، منطقة ترافقه المصب كيلو بايت-1 الهدف تتضخم الجينات، والجين علامة مقاومة المضادات الحيوية ببكر. المناطق 5 ' عكس التمهيدي والتمهيدي إلى الأمام، للتضخيم من المنبع والمصب المرافقة المناطق، على التوالي، تشمل 15 قواعد مكملة لنهايات الجين ماركر. وبالمثل تتضمن 5 ' مناطق الإشعال على حد سواء إلى الأمام أو عكس للتضخيم الجيني علامة 15 قواعد مكملة للنهاية السفلي لمنطقة ترافقه المنبع الجينات المستهدفة والحد الأعلى لمنطقة ترافقه المصب من الجينات المستهدفة، على التوالي. ولذلك تتضمن ثلاث شظايا تضخيم متراكبتين زوج 30-قاعدة في موقع الانصهار. في الخطوة الثانية (2nd PCR)، يتم إجراء PCR مع الإشعال PCR متداخلة باستخدام الأجزاء الثلاثة تضخيمه قبل 1st PCR كقوالب. بالإضافة إلى ذلك ترتبط المناطق مكملة للقوالب ببعضهما البعض عبر 2nd PCR. وأخيراً، البناء جزئ مثلى هو عرض لسلالة البرية من نوع انهانسر. من الممكن التحقق من اضطراب الجينات الناجحة PCR باستخدام كبسولة تفجير محددة. على الرغم من أن يتم تضخيمه في بناء تعطيل استخدام عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي، التفاعلات الانزيمية إضافية، مثل ربط الحمض النووي أو الهضم الحمض النووي، وليست ضرورية لتوليد بنية. وبالإضافة إلى ذلك، قد اختار منطقة المحذوفة أو المحافظة على الجينوم مرونة وفقا للتصميم التمهيدي.

في هذا العمل، أجرى الحذف للمنطقة بأسرها ترميز الجينات جتفك ، الذي يقوم بترميز جلوكوسيلترانسفيراسي في mutans العقدية، لإظهار طريقة تعطيل الجينات سريعة وسهلة في أنواع العقدية. بالإضافة إلى ذلك، جتفب-ولدت ضغطاً تعطلت بنفس الطريقة. تسهم جلوكوسيلترانسفيراسيس المشفرة بواسطة جتفك و جتفب كاريوجينيك بيوفيلم الأسنان التنمية5،6. قدرات تشكيل بيوفيلم البرية-النوع سلالة (S. mutans WT)، جتفك-عطلت السلالة (ΔS. mutans جتفك)، وجتفب-قيمت سلالة تعطل (S. mutans Δجتفب) لتحليل مقارن المظهرية. هذا البروتوكول يمتد تطبيق أسلوب خطوتين لتعطيل الجينات أنواع إضافية ويمكن تعديله للدراسات المتعلقة بوظيفة الجينات في مجموعة واسعة من الأصناف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-"التصميم التمهيدي"

  1. إعداد كبسولة تفجير للانصهار 2-الخطوة بكر والتحقق من اضطراب الجينات.
    ملاحظة: يبين الجدول 1 في تسلسل التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول. ويبين الشكل 1 مثالاً تخطيطي أسلوب PCR الانصهار الخطوة 2 تستخدم لتوليد S. mutans Δ جتفك.
    1. كبسولة تفجير تصميم للاستعاضة عن المنطقة المستهدفة في الجينوم مع الجينات (توافق آراء ساو باولو r) المقاومة بالسبيكتينوميسين 7. يستبدل هذا البروتوكول ترميز المنطقة بأسرها من الجينات جتفك توافق آراء ساو باولو r-
    2. وتشمل 15 قواعد مكملة لتحقيق الغايات العليا والسفلي من توافق آراء ساو باولو r 5 ' مناطق عكس أعلى وأسفل إلى الأمام الإشعال، على التوالي. وبالمثل، تشمل 15 قواعد مكملة للنهاية السفلي لمناطق ترافقه المنبع جتفك ونهاية العلوي من مناطق المصب ترافقه جتفك 5 ' المناطق من توافق آراء ساو باولو r-إلى الأمام و توافق آراء ساو باولو r --عكس الإشعال، على التوالي ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تسلسل لعكس أعلى، لأسفل إلى الأمام، توافق آراء ساو باولو r-إلى الأمام، و توافق آراء ساو باولو r-عكس كبسولة تفجير تتحدد تلقائياً تبعاً للموقع التأسيس بناء تعطل.
    3. تصميم الإشعال يصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس تشمل > كيلو بايت-1 المنبع والمصب المرافقة مناطق الجينات جتفك، على التوالي. ضبط درجة حرارة ذوبان (T m) لتصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس الإشعال وفقا لدرجة حرارة ذوبان الإشعال عكس أعلى وأسفل إلى الأمام، على التوالي ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تشير إلى الصيغة التالية لتحديد ر م: تي م (درجة مئوية) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * نغ)--5، حيث * تمثل N عدد النيوكليوتيدات التمهيدي مع هوية المحدد (A, T، ج أو G).
    4. تصميم كبسولة تفجير المتداخلة (N_up إلى الأمام وعكس N_up) ل 2 nd بكر ( الشكل 1B).
      ملاحظة: على الرغم من أن زوج الأبعد التمهيدي (تصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس) قد تستعمل ككبسولة تفجير 2 nd بكر، صممت الإشعال المتداخلة (N_up إلى الأمام وعكس N_up) في هذا البروتوكول. كبسولة تفجير متداخلة مطلوبة كثيرا ل 2 nd بكر، كما هو مفصل في نتائج الممثل.
    5. كبسولة تفجير تصميم محددة توافق آراء ساو باولو r. وتستخدم كبسولة تفجير مستعمرة بكر على الشاشة لتعطيل جتفك.
      6. اضطراب
    6. كبسولة تفجير تصميم للتحقق من جتفك.
      ملاحظة: المنتجات بكر تضخيم استخدام كبسولة تفجير هذه على جانبي الحدود بين جتفك أو توافق آراء ساو باولو r والمنبع أو المصب المرافقة مناطق جتفك. مجموعات التمهيدي ' جتفك يصل إلى الأمام و جتفك عكس حتى ' و ' جتفك لأسفل إلى الأمام و جتفك لأسفل--عكس ' محددة جتفك، و ' جتفك يصل إلى الأمام و توافق آراء ساو باولو r 2 -عكس ' و ' توافق آراء ساو باولو r 2 إلى الأمام و جتفك لأسفل--عكس ' محددة توافق آراء ساو باولو r-

2. استخراج الحمض النووي الجينومي من S. mutans

s
  1. متواصلة الأسهم ماتان س. UA159 على طبق أجار تسريب (بهي) قلب المخ. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  2. تلتقط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وتطعيم أنه في 5 مل مرق بهي. احتضان الثقافة ماتان S. s بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  3. ثقافة الخلية البكتيرية من أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,000 × زاي ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
  4. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,000 × زاي ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  5. استخراج الحمض النووي من تعليق استخدام الحمض النووي جينومي حبة-ضرب قاعدة استخراج عدة وفقا للإرشادات المتوفرة من قبل الشركة المصنعة.
    1. نقل التعليق لنموذج 2.0 مل أنبوب يحتوي على الزجاج الخرز (المدرجة في هذه المجموعة). إضافة 750 ميليلتر من حل تحلل (ضمن الطقم) إلى تعليق خلية.
    2. كاب محكم ووضع الأنابيب شكل متناظر في حامل أنبوب الجهاز تعطل حبة-الضرب. العملية في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق. نقل عينات أجهزة الطرد المركزي الضرب حبة لمدة 1 دقيقة في 10,000 × زاي المادة طافية إلى تصفية زيادة ونقصان (ضمن الطقم) في أنبوب جمع 2.0 مل والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 7,000 × ز .
    3. ميليلتر 1,200 إضافة للحمض النووي ملزم العازلة (المضمنة في مجموعة أدوات) فيلتراتي. نقل 800 ميليلتر من الخليط لعمود الدوران (ضمن الطقم) إلى أنبوب جمع 2.0 مل والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 × زاي
    4. تجاهل التدفق عبر، إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسل المسبق (ضمن الطقم) إلى العمود تدور ليغسل مصفوفة العمود، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في زاي 10,000 × تجاهل التدفق من خلال، بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (ضمن الطقم) تدور عمود يغسل مصفوفة العمود، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 × زاي
    5. ضع عمود الدوران في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة وإضافة 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (ضمن الطقم) إلى مصفوفة العمود.
    6. الطرد المركزي لمدة 30 ق في 10,000 × ز الوت الحمض النووي. تقدير تركيز الحمض النووي والنقاء عن طريق قياس امتصاص في 260 nm و 280 نموسينج جهاز المطياف الضوئي والتأكد من أن نسبة 280 &/A 260 ألف أكبر من 1.8.

3. [بكر] تضخيم

  1. إجراء 1 st PCR استخدام الجينوم s WT ماتان س. والجينات الاصطناعية توافق آراء ساو باولو r كقوالب بكر (انظر الجدول 1). تضخيم المنطقة ترافقه المنبع الجينات جتفك، منطقة ترافقه المصب من الجينات جتفك، و توافق آراء ساو باولو r الجينات باستخدام ثلاث مجموعات من الإشعال الموصوفة أعلاه ( الشكل 1A)، ككل الجدول 2 و الجدول 3-
    ملاحظة: بكر الإشعال، الكواشف، ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
  2. يجزئ كل منتج بكر على 1% [اغروس] هلام والمكوس العصابات المقابلة باستخدام قاطع هلام فرقة-
  3. تنقية كل منتج تضخيم الحمض النووي من الجل استخدام عدة تدور استخراج غشاء مطاطي هلام السليكا والعمود--
    1. نقل جل الشرائح إلى ميكروسينتريفوجي نظيفة أنبوب وتخلط مع 500 ميليلتر ملزم المخزن المؤقت (المدرجة في هذه المجموعة). احتضان هذا الخليط في 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى يتم تماما يذوب شرائح جل.
    2. ضع عمود الدوران (ضمن الطقم) إلى أنبوب جمع (المدرجة في المجموعة)، وتحميل العينة على عمود الدوران، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 11,000 × ز. تجاهل في التدفق من خلال، إضافة 600 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" (ضمن الطقم) إلى "العمود تدور" ليغسل الغشاء والسليكا، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 11,000 × ز.
    3. تجاهل من خلال التدفق والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في × 11,000 ز لتجفيف الغشاء والسليكا.
    4. ضع عمود الدوران في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة، وإضافة 50 ميليلتر "شطف المخزن المؤقت" (المدرجة في المجموعة)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2
    5. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة مبلغ 000 11 × ز الوت تضخيم الحمض النووي. تقدير تركيز الحمض النووي والنقاء عن طريق قياس امتصاص في 260 nm و 280 نموسينج جهاز المطياف الضوئي والتأكد من أن نسبة 280 &/A 260 ألف أكبر من 1.8.
  4. إجراء 2 nd بكر 2-الخطوة الانصهار PCR باستخدام شظايا اكويمولار حوالي ثلاثة كقوالب PCR، وفقا الجدول 2 < المنبوذةرونغ > و الجدول 3-
    ملاحظة: هذه الشظايا تم تضخيمها وتقسم باستخدام كبسولة تفجير متداخلة ' N_up إلى الأمام وعكس N_down ' أو كبسولة تفجير الأبعد ' يصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس ' ( الشكل 1B). [بكر] كبسولة تفجير، والكاشفات ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
  5. تحميل عشر الخليط تفاعل PCR (5 ميليلتر) على 0.8% [اغروس] هلام وقارن حجم الفرقة تضخيم حجم الفرقة المتوقعة لتأكيد توليد amplicon المناسبة ( الشكل 1).
  6. تركيز المنتج بكر النهائية المتبقية من الإيثانول هطول الأمطار دون تنقية.
    1. 55 إضافة ميليلتر من نقية جداً المياه إلى خليط بكر المتبقية لضبط الحجم الإجمالي إلى 100 µL.Add وحدة تخزين واحدة-العاشر من م 3 خلات الصوديوم (10 ميليلتر)، الرقم الهيدروجيني 5.2، متبوعاً بحجم 2.5 من 100% إيثانول (250 ميليلتر). خلط وتجميد لمدة 30 دقيقة في-80 درجة مئوية.
    2. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 15,000 × ز في 4 درجات مئوية، تحقق بيليه على الجزء السفلي من الأنبوب، وتجاهل المادة طافية. أغسل بيليه مع 1 مل إيثانول 70 ٪، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15,000 × ز في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية. أيردري بيليه لما يقرب من 30 دقيقة، وحل مع 10 ميليلتر من الماء النقي جداً-

4. إعداد الخلية المختصة وتحول الخلايا

s
  1. متواصلة الأسهم ماتان س. UA159 على طبق أجار بهي. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  2. تلتقط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وتطعيم أنه في 5 مل مرق بهي. احتضان الثقافة ماتان S. s بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  3. نقل 2 مل ثقافة s س ماتان إلى 50 مل مرق بهي واحتضانها ح 6-8 في 37 درجة مئوية كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD 600) 0.2-0.4 الظروف اللاهوائية.
  4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 15 دقيقة في 2,000 × ز في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية وتغسل الخلايا مرتين مع 40 مل الماء المثلج تليها 40 مل من 10% والغليسيرول.
    ملاحظة: يؤثر على المواد المتبقية انهانسر اللاحقة-
  5. نضح المادة طافية بعناية مع ماصة باستور انخفاض انضمام بيليه الخلية في والغليسيرول 10%. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من جديد 10% والغليسيرول والاستغناء عن 50 ميليلتر من التعليق إلى كل أنبوبة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى قبل استخدام.
  6. ميكس 50 ميليلتر قاسمة من الخلايا المختصة المثلج مع 5 ميليلتر للتعطيل بناء الوارد وصفها أعلاه في المقطع 3. إضافة الخليط إلى الترعة انهانسر (مع مسافة 0.2 سم بين أقطاب). تستخدم طريقة المكوّرات العنقودية الذهبية (1.8 كيلو فولت، 10 µF نبض 1، 600 Ω) جهاز انهانسر إلى اليكتروبوراتي.
    7. تعليق الخلايا في 500 ميليلتر من مرق بهي فور انهانسر
  7. وإضافة 50 ميليلتر من التعليق لوحات أجار بهي المحتوية على بالسبيكتينوميسين-
    ملاحظة: وقت حضانة إضافية بعد انهانسر غير مطلوب. إلا أن الحضانة ح 1-2 بعد انهانسر تحسين كفاءة التحويل.
  8. احتضان اللوحة 2-6 أيام في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
    ملاحظة: يتم إنشاء mutans س. Δ جتفب كما هو موضح أعلاه. يتم استبدال المنطقة بأسرها ترميز الجينات جتفب مع الجينات المقاومة الاريثروميسين 8 في mutans س. Δ جتفب. هو مثقف كل سلالة S. mutans في مرق بهي في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.

5. التحقق من اختلال الجينات والتخزين

  1. بيك مستعمرات عشوائية وتطعيم منهم إلى الخليط PCR لأداء مستعمرة [بكر] وفقا الجدول 2 و الجدول 3. [بكر] كبسولة تفجير، والكاشفات ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
  2. تحميل الخليط رد فعل بكر على 1% [اغروس] هلام للتأكد من توافق آراء ساو باولو r-محدد الحمض النووي الفرقة-
  3. بيك مرق مستعمرة إيجابية باستخدام مسواك معقمة وخلايا فرعية في 10 مل بهي المحتوية على بالسبيكتينوميسين لمدة يومين في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  4. التحقق من توليد Δ S. mutans جتفك.
    1. تقسيم تعليق خلية على قدم المساواة. استخراج الحمض النووي من الخلايا المذكورة أعلاه (خطوات 2.3. إلى 2.5.5.). إجراء PCR مع الحمض النووي كقالب بكر، استخدام كبسولة تفجير لتحقق اضطراب جتفك (الجدول 1) وفقا الجدول 2 و الجدول 3-
      ملاحظة: كبسولة تفجير بكر والكاشفات ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
    2. تحميل الخليط بكر على 2% [اغروس] هلام وقارن حجم الفرقة تضخيم حجم الفرقة المتوقعة لتأكيد توليد amplicon المناسبة .
    3. الطرد المركزي بتعليق الخلية المتبقية لمدة 15 دقيقة في 2,000 × ز 4 ° C. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,000 × ز 4 ° "جيم ريسوسبيند" الخلية بيليه في 1.5 مل مرق بهي المحتوية على الجلسرين 25% وتخزينها في-80 ° Cor-20 درجة مئوية.

6. تحليل المظهرية

  1. متواصلة كل ماتان S. s ضغطاً على طبق أجار بهي. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  2. تلتقط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وتطعيم ذلك إلى 2 مل مرق بهي مع أو بدون المضادات الحيوية مناسبة. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  3. تلقيح 20 ميليلتر من تعليق الثقافة بين عشية وضحاها إلى 2 مل مرق بهي تحتوي على السكروز 1% أو 5% دون المضادات الحيوية في أنبوب اختبار زجاج؛ وثقافة الخلايا مع أنبوبة الاختبار في وضع يميل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
  4. دوامة الزجاج أنابيب الاختبار لمدة 10 ق وصب المعلقات الثقافة. تغسل أنابيب الاختبار ثلاث مرات بماء مقطر. أضف 1 مل 0.25% أخذ بريليانت الأزرق (مصرف البحرين المركزي) وصمة عار في الأغشية الحيوية على جدار الأنبوبة، وثم احتضانها للحد الأدنى 1
  5. صب الحل المصبوغة وتغسل أنابيب الاختبار ثلاث مرات بماء مقطر وجاف في أنابيب الاختبار.
  6. تقييم كثافة اللون والتمديد لمصرف البحرين المركزي الملون-بيوفيلم بصريا لتحديد إمكانية تشكيل بيوفيلم في تحليل المظهرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 أن حجم كل منتج من 1st بكر، كما لوحظ في 1% [اغروس] هلام، كان في اتفاق جيد مع الحجم المتوقع لحوالي 1 كيلو بايت. ويبين الشكل 3 التحليل الكهربي جل من منتجات 2nd PCR. ويبين الشكل 4 مستعمرات S. mutans تتحول مع بنية التعطيل، وتحليل التفريد جل لمستعمرة [بكر] منتوجات. وكان أمبليكونس من جميع المستعمرات من الحجم المتوقع. ويبين الشكل 5 مواقع الربط التمهيدي لتحقق التفريد جتفك التعطيل وجل من منتجات PCR. منتجات PCR التي حصل عليها التضخيم باستخدام مجموعة محددة من التمهيدي جتفك-تأكدت في S. mutans بالوزن، ولكن ليس في S. mutans Δجتفك، بينما بكر المنتجات المتحصل عليها باستخدام توافق آراء ساو باولوr-محددة تأكدت مجموعة التمهيدي في S. mutans Δجتفك، ولكن ليس في S. mutans بالوزن الرقم 6 يبين قدرة تشكيل بيوفيلم السكروز المستمدة من كل سلالة mutans س. . شكلت بيوفيلم ملتصقة واسطة S. mutans WT حضور السكروز؛ قدرة تشكيل بيوفيلم ملتصقة S. mutans Δجتفب كانت أقل من أن mutans س. Δجتفك معارضها من S. mutans بالوزن تشكيل بيوفيلم ملتصقة منخفضة جداً حضور السكروز.

Figure 1
الشكل 1:Strategy للانصهار 2-الخطوة PCR. على توضيح تخطيطي S. ويرد mutans Δجتفك البناء. أطوال الجينات ليست بمقياس. (أ) المنبع والمصب المرافقة مناطق جتفك و توافق آراء ساو باولوr تم تضخيمه المكاني عن طريق PCR. يتم الإشارة إلى مواقع الربط التمهيدي في القالب من النقوش مماثلة. (ب) أجرى بكر والخطوة الثانية باستخدام (كقوالب) 3 الشظايا التي تم تضخيمه في أول خطوة PCR مع الإشعال متداخلة. (ج) تم الحصول على بنية التعطيل جزئ مثلى في السلالات البكتيرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: جل الممثل التفريد من المنتجات من 1st PCR. وترد أمبليكونس منطقة جتفك ترافقه المنبع والمصب المنطقة ترافقه جتفك و توافق آراء ساو باولوr . م: الواسمات الجزيئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التفريد جل الممثل من المنتجات من 2nd PCR. منتجات تفصيل مع الإشعال المتداخلة، وتظهر كبسولة تفجير الأبعد. يشير السهم الصلبة إلى توقع حجم بنية التعطيل. م: الواسمات الجزيئية.

Figure 4
4 الرقم: الكشف عن اضطراب جتفك بمستعمرة [بكر] (A). المستعمرات S. mutans على لوحة أجار بهي المحتوية على بالسبيكتينوميسين؛ ويشير كل عدد تحليقا إلى مستعمرة معرف. (ب) جل الممثل التفريد مستعمرة PCR المنتجات؛ يشير الرقم لين تحليقا كل معرف مستعمرة المطابق في الشكل 4A. م: الجزيئية ماركر، WT: يستخدم كقالب البرية من نوع الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: تحقق اضطراب جتفك قبل PCR. مواقع ربط التمهيدي (A) ؛ طول الجينات ليس بمقياس. تم إجراء PCR باستخدام الحمض النووي mutans س. كقالب. مجموعات التمهيدي: جتفك يصل إلى الأمام و جتفك حتى عكس (محددة على جتفك)؛ جتفك أسفل إلى الأمام و جتفك لأسفل--عكس (محددة على جتفك)؛ جتفك يصل إلى الأمام و توافق آراء ساو باولوr2-الاتجاه المعاكس (محددة توافق آراء ساو باولوr)؛ جتفك لأسفل--عكس (محددة توافق آراء ساو باولوr) و توافق آراء ساو باولوr2 إلى الأمام. (ب) ممثل جل التفريد المنتجات بكر؛ كل رقم لين تحليقا يشير إلى الدليل المطابق في الشكل 5A. صورة الغرواني الكهربي واحدة تنقسم إلى تسمية النطاقات ماركر. م: علامة الجزيئية (100-قاعدة زوج سلم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: تحليل المظهرية تستند التنمية بيوفيلم- الأغشية الحيوية المستمدة من السكروز يتكون من كل سلالة mutans س. كانت ملطخة بأخذ الزرقاء الرائعة. WT: S. mutans WT، Δجتفب: S. mutans Δجتفب، Δجتفك: S. mutans Δجتفك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

جاتكاجاجتجاجاجتجاكتاااككااتاج
كاجككاكتجكاتتكككجكاتاتكتتتجتاتج

الجدول 1: الإشعال المستخدمة في هذا البروتوكول- تسلسل المسطرة 'عكس أعلى و توافق آراء ساو باولوr-إلى الأمام' و 'توافق آراء ساو باولوr-عكس وأسفل إلى الأمام' يكملان بعضهما البعض. تسلسل كتابة جريئة 'عكس أعلى و توافق آراء ساو باولوr-إلى الأمام' و 'توافق آراء ساو باولوr-r وأسفل إلى الأمام' متكاملان.

زوج التمهيدي تسلسل (5 'إلى 3') حجم الفرقة المتوقعة (bp)
2-الخطوة PCR لتعطل جتفك
بكر الأولى
يصل إلى الأمام
متابعة-عكس		 آجاتاتتتجاتاجكاتكتججاكاتجتاتك
كجاكجاااتكجا تاتتككتككاااات أجتتا		 1,036
توافق آراء ساو باولوr-إلى الأمام
توافق آراء ساو باولوr-عكس		 أتتتتجاجااتا تكجاتتتكجتكج تجات
كتكتاجاتاجتا كاتاتجكاججتت أتتجت		 1,188
أسفل إلى الأمام
أسفل--عكس		 آآكككتجكاتاتج تاكتاتكتاجاج آتاج
تاجاجكاجتتاجاتاجاكاتجتاكتكاك		 1,059
بكر 2
N_up إلى الأمام
عكس N_down		 تتتاتجاااكجاجاجتااتجكتجتاتك
جككاتاكتاجاجااتتكتتجكتااتكتج		 3,132
تحقق توقف جتفك
مستعمرة [بكر] للفحص
S_توافق آراء ساو باولوr-إلى الأمام
S_توافق آراء ساو باولوr-عكس		 535
التحقق النهائية
جتفك يصل إلى الأمام
جتفك أعلى-عكس		 تاكجككجتاتكاجتاتاكجاتجكتاكتكتج
جتجتجاجاتجتجكتجاجتجكتجتاكتج		 498
جتفك أسفل إلى الأمام
جتفك لأسفل--عكس		 جككتاتجتجكاتجتجتجاجاجاكج
تجتككاكتتتجاجتكاكجتكتجكاجكاتج		 557
جتفك يصل إلى الأمام
2-عكس من توافق آراء ساو باولوr		 المذكورة أعلاه
ككاكتكتكاكتككتجاتككااكاتجتاجتاكك		 641
توافق آراء ساو باولوr2 إلى الأمام
جتفك لأسفل--عكس		 جتجكتجاتكتكتككاتاجاكاتاججاجاج
المذكورة أعلاه		 623
كاشف تركيز المحاليل الأسهم وحدة التخزين التركيز النهائي
مواده بوليميراز الدنا 2 × 25 ميكروليتر 1 ×
التمهيدي إلى الأمام 5 ميكرومتر 2 ميكروليتر 0.2 ميكرون
عكس التمهيدي 5 ميكرومتر 2 ميكروليتر 0.2 ميكرون
قالب الحمض النووي متغير متغير متغير * * * * * *
المياه. - ما يصل إلى 50 ميكروليتر -

الجدول 2: الكواشف PCR. * للخطوة 1st بكر؛ 100 نانوغرام. * * ل 2nd بكر؛ كل 30-50 نانوغرام من 1st خطوة بكر أمبليكون. لمستعمرة [بكر]؛ إضافة الخلايا البكتيرية إلى خليط رد فعل مباشرة.

دورة خطوة درجة الحرارة الوقت عدد الدورات
تمسخ الأولى 98 درجة مئوية 2 دقيقة 1
تمسخ
الصلب
ملحق		 98 درجة مئوية
55 درجة مئوية
72 درجة مئوية		 10 s
5 s
أمبليكون يعتمد
(1 دقيقة/1 kbp)		 35
التمديد النهائي 72 درجة مئوية أمبليكون يعتمد
(1 دقيقة/1 kbp)		 1

الجدول 3: دورات التضخيم PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، يجب أن تصمم الإشعال ل 1st PCR لتضخيم حوالي 1 كيلوبايت من المنبع والمصب المرافقة مناطق المنطقة المستهدفة في الجينوم. تسلسلات طويلة ترافقه هذه ضرورية لتحسين كفاءة جزئ مثلى.

تسلسل الإشعال (عكس أعلى، لأسفل إلى الأمام، توافق آراء ساو باولوr-إلى الأمام، و توافق آراء ساو باولوr-عكس) في هذا البروتوكول تحددت تلقائياً استناداً إلى الموقع التأسيس بناء التعطيل. ويشمل كل التمهيدي 15 قواعد مكملة لنهاية القالب بكر 2nd في المنطقة 5 '. موقع ربط أطول يتيح إنتاج أكثر كفاءة من بنية التعطيل. هو أوصى بإدراج قواعد تكميلية على الأقل 10 في المنطقة 5 ' من كل التمهيدي9.

استخدمت كبسولة تفجير المتداخلة (N_up إلى الأمام وعكس N_up) 2nd بكر، بدلاً من الإشعال الأبعد (تصل إلى الأمام وعكس لأسفل). استخدام كبسولة تفجير الأبعد 2nd PCR مفيد في بعض الحالات؛ وتحقق التضخيم الناجحة بناء التعطيل ل mutans س. Δجتفب استخدام كبسولة تفجير الأبعد (البيانات لا تظهر). ومع ذلك، استخدام كبسولة تفجير الأبعد للخطوةالثانية 2 على بكر كثيرا ما يؤدي التضخيم PCR غير كافية، كما هو مبين في الشكل 3. تم العثور على استخدام أجهزة الإشعال المتداخلة لحل هذه المشكلة9. عندما يتم بناء تعطل لا تضخيمه كثيرا حتى باستخدام كبسولة تفجير متداخلة، ومع ذلك، إعادة تصميم أجهزة الإشعال المستخدمة في PCR الأولى قد يلزم.

مستعمرة [بكر] يتيح فحص مريحة من سلالة تعطل الجينات. ويمكن تطبيق كبسولة تفجير لتسلسل معروف لجيل سلالة الجينات تعطل استخدام توافق آراء ساو باولوr. استخدمت انهانسر لإدخال ثوابت الاضطراب في S. mutans WT، ككفاءة التحويل يتحقق باستخدام انهانسر أعلى عموما من الإجراءات الأخرى التي يوفرها. التحويل باستخدام مصل الحصان، أو مصل الحصان مع الببتيدات محفزة للاختصاص، مقبول على نطاق واسع في العقدية10،،من1112. على الرغم من أن جهاز انهانسر مطلوب، الإجراءات التي تنطوي عليها، مثل إعداد الخلية المختصة، أبسط بكثير من تلك الموجودة في الأساليب البديلة10،11. وباﻹضافة إلى ذلك، ينصح انهانسر من وجهة نظر للرفق بالحيوان.

ينطبق هذا البروتوكول إلى تعطيل الجينات متعددة، اعتماداً على عدد من علامات أوفانتيبيوتيك. لتوليد جتفك--و جتفب-عطلت سلالات S. mutans ، على سبيل المثال، في بناء الحمض النووي جتفك-التعطيل التي شيدت قبل بكر 2-خطوة قد تتحول إلى S. mutans Δجتفب. نظراً جتفك و جتفب المتاخمة لها في هذه الحالة، S. mutans Δجتفك والجينومجتفب Δ S. mutans يجب أن تستخدم كقوالب لبكر 2-خطوة للحفاظ على تسلسل مثلى لمثلي جزئ. في الواقع، نقراً مزدوجاً تعطيل الجينات S. mutans سلالة شيد سابقا بواسطة هذا البروتوكول9.

قد تكيف هذا البروتوكول لتعطيل الجينات في S. mutans لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع. لا يتطلب هذا البروتوكول خطوة استنساخ الجينات المشتركة في البروتوكولات التقليدية. وباﻹضافة إلى ذلك، [بكر] رد فعل الأنزيمي المطلوب فقط؛ ولذلك، ناقلات بلازميد، الإشريكيّة القولونية، ليجاسى، وانزيمات التقييد ليست ضرورية. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مرونة أكبر فيما يتعلق بتصميم بناء الاضطراب، كما تصميم بنية مستقلة عن مواقع إنزيم التقييد للجينات المستهدفة. يجوز للباحثين تحديد المناطق التي يتم حذفها أو الحفاظ عليها في الجينوم لتصميم التمهيدي عكس لتضخيم المناطق ترافقه المنبع والتمهيدي إلى الأمام لتضخيم المناطق ترافقه المتلقين للمعلومات. هذه المرافقة المناطق مباشرة من المنبع والمصب فورا من المنطقة في الحمض النووي المطلوب للحذف، على التوالي. يمكن استخدام هذه المرونة لتقليل التأثيرات الخارجية، مثل التأثيرات القطبية، على التعبير عن الجينات قريبة من بعضها البعض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم" [أرقام المنح 16 ك 15860 على الخرائط و 15 ك 15777 إلى N.H.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptococus mutans Stock strain in the lab. Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit Zymo Research D6005
Bead-beating disruption apparatus Taitec GM-01
Synthetic genes Eurofins Genomics Custom-ordered Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler Astec PC-708
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered 35 bases in length
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800
Electroporator Bio-rad 1652100
Electroporation cuvette Bio-rad 1652086 0.2-cm gap
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture media
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics
Erythromycin Wako 057-07151 Antibiotics
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  3. Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
  4. Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
  5. Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
  9. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
  10. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
  11. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  12. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).

Tags

علم الوراثة، 128 مسألة، تعطيل الجينات، وبنية الحمض النووي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل، التصميم التمهيدي، الجينات المقاومة للمضادات الحيوية ماركر، العقدية mutans، انهانسر، وممارسو مثلى
جيل تعطيل الجينات <em>العقدية mutans</em> سلالة دون الجيني الاستنساخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murata, T., Okada, A., Matin, K.,… More

Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning. J. Vis. Exp. (128), e56319, doi:10.3791/56319 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter