Summary
Streptococcus mutans çoğunlukla gen kesintiye üretimi için facile, hızlı ve nispeten ucuz bir yöntem tarif suşları; Bu teknik gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.
Abstract
Tipik yöntemleri için belirli bir gen işlevini aydınlatma vahşi tipi zorlanma ve faiz gen getirilmiş bir yük karşılaştırmalı fenotipik analizlerini içerir. Uygun antibiyotik direnci marker gen içeren bir gen-bozulma DNA yapısı gen kesintiye suşları bakterilerde nesil için yararlıdır. Ancak, Gen Klonlama adımlar gerektirir, geleneksel inşaat yöntemleri karmaşık ve zaman alıcı protokolleri içerir. Burada, Streptococcus mutans çoğunlukla hedeflenen gene bozulma için nispeten facile, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem 2-adım füzyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) bozulma yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm oluşturmak için kullanır. Bu yöntem does değil istemek dışında PCR, enzimatik reaksiyon ve ayrıca bozulma yapı tasarım açısından daha büyük esneklik sağlar. Elektroporasyon istihdam yetkili hücreleri hazırlanması kolaylaştırır ve dönüşüm verimliliği artırır. Mevcut yöntem gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.
Introduction
Gene işlev analiz genellikle bir vahşi tipi yük ve ilgi belirli bir gen getirilmiş bir yük arasında fenotipik bir karşılaştırma içerir. Bu gen-bozulma teknik gen işlevi analizleri takson, memeliler için bakterilerden geniş bir alanda kullanılmıştır. Gen alt üst baskı üretimi için gerekli bir gen-bozulma yapıdır; Bu deoksiribonükleik asit (DNA) yapı akış yukarı ve aşağı akım hedef gen bölgelerinde kanat erimiş antibiyotik direnci marker gen oluşur ve homolog rekombinasyon ile genom içine dahil edilmiştir. Gen kesintiye zorlanma antibiyotik içeren seçmeli medya kullanarak izole olabilir. Gen kesintiye zorlanma yapımı için kullanılan geleneksel yöntem Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), gen ligasyonu içine uygun bir plazmid, hazım ile sınırlama tarafından hedef gen amplifikasyon gibi karmaşık adımlar gerektirir enzimler ve antibiyotik direnç marker gen eklemek için religation. Her adım başarısını bağlı olarak birkaç hafta için birkaç gün alarak zaman alıcı bir süreçtir. Buna ek olarak, tasarım kesintileri yapıları, hedef gen restriksiyon enzimi sitelerinde bağlıdır. Bu sorunları gidermek için DNA PCR tabanlı yapıştırma yöntemleri1,2 tasarım Dictyostelium discoideum3 ve Synechocystis sp. PCC68034 mutant gen bozulduğu için bildirilmiştir. Bu da çalışmanın, kesintiye uğraması yapımı için (2-adım füzyon PCR belirlenmiş) değiştirilmiş bir PCR tabanlı yöntemi kullanan bir nispeten hızlı, facile ve ucuz şekilde bir gen kesintiye streptokok yük oluşturmak için bir yöntem geliştirildi yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm.
PCR genomik DNA, antibiyotik direnci marker gen PCR şablon olarak ve dört çift uygun şekilde gerektirir 2-adım füzyon Oligonükleotid astar tasarlanmış. İlk adım (1st PCR), hedef gen, hedef 1-kb aşağı akım kanat bölge 1-kb ters yönde kanat bölge gen ve antibiyotik direnç marker gen PCR ile güçlendirilmiş. 5' bölgeleri ters astar ve amplifikasyon upstream ve downstream için ileri astar bölgeler, sırasıyla, kanat 15 üsleri marker gen sonuna kadar tamamlayıcı içerir. İleriye ve geriye doğru astar marker gen amplifikasyon için 5' bölgeleri aynı şekilde 15 üsleri hedef gen ters yönde kanat bölgesinin alt sonuna ve akış aşağı kanat hedef gen bölgesinin üst sonu için tamamlayıcı dahil, anılan sıraya göre. Bu nedenle, üç güçlendirilmiş parçaları üst üste gelen 30-baz çifti bölgesini fusion sitesinde içerir. İkinci adımda (2nd PCR), PCR 1st PCR Şablonlar olarak tarafından güçlendirilmiş üç parçaları kullanarak iç içe geçmiş PCR astar ile gerçekleştirilir. Şablonlar tamamlayıcı bölgelerinde Ayrıca 2nd PCR birbirine bağlıdır. Son olarak, yapı homolog rekombinasyon için vahşi tipi zorlanma için elektroporasyon tarafından tanıtıldı. Başarılı gene bozulma belirli primerler kullanılarak PCR tarafından doğrulanmadı. Yüksek sadakat DNA polimeraz kullanarak bozulma yapısı güçlendirilmiş, DNA ligasyonu veya DNA sindirim, gibi ek enzimatik reaksiyonları yapı oluşturmak gerekli değildir. Buna ek olarak, genom bir silinmiş veya korunmuş bölge esnek astar tasarım göre seçmiş olabilirsiniz.
Mevcut çalışma, Streptococcus mutans çoğunluklaglucosyltransferase kodlar, gtfC gen tüm kodlayıcı bölge silme hızlı, kolay gen bozulma yönteminde bir streptokok türleri göstermek için gerçekleştirildi. Ayrıca, bir gtfB-kesintiye zorlanma aynı şekilde oluşturulur. GtfC ve gtfB tarafından kodlanmış glucosyltransferases katkıda bulunmak için cariogenic diş biyofilm geliştirme5,6. Vahşi türü biyofilm oluşturmayan yetenekler (S. mutans çoğunlukla WT), gtfCsoy-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfC) ve gtfB-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfB) değerlendirildi fenotipik karşılaştırmalı analizler için. Bu iletişim kuralı gene bozulma için ek bir tür için bir iki adım yöntemi uygulanması genişletir ve çalışmalar gen fonksiyonunu kullanabilirsiniz takson daha geniş bir yelpazesi için değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Astar tasarım
- 2-adım fusion PCR ve gene bozulma doğrulanması için astar hazırlayın.
Not: Tablo 1 bu protokol için kullanılan astar dizileri gösterir. şekil 1 bir şematik S. mutans çoğunlukla Δ gtfC oluşturmak için kullanılan 2-adım füzyon PCR yöntemi gösterir.- Tasarım astar genom Spektinomisin-direnç gen (spc r) 7 ile hedef bölgede değiştirilmesi için. Bu iletişim kuralı gtfC gen tüm kodlayıcı bölge spc r ile yerini alır.
- Dahil 15 üsleri spc r alt ve üst ucuna tamamlayıcı saat 5'te ' up-ters bölgelerinde ve astarlar, sırasıyla aşağı-ileri. Benzer şekilde, dahil 15 üsleri tamamlayıcı gtfC ters yönde kanat bölgelerinde alt sonuna ve gtfC akış aşağı kanat bölgelerinde üst sonu saat 5'te ' bölgelerinde spc r-ileri ve spc r -astar, sırasıyla ters ( şekil 1A).
Not: Up-geri, aşağı-ileri, spc r - ileri ve spc r - dizilerini ters astar bozulma yapı birleşme siteye bağlı olarak otomatik olarak belirlenir. - Tasarım oluşturan için yukarı-ileri ve aşağı-geri astar > 1 kb upstream ve downstream sırasıyla gtfC gene, bölgelerinde kanat. Yukarı-ileri erime sıcaklık (T m) ayarlayın ve astar astar, up-ters ve aşağı-ileri erime sıcaklığı uygun olarak sırasıyla aşağı-ters ( şekil 1A).
Not: T m belirlemek için aşağıdaki formül bakın: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, nerede * N temsil eder (A, T, C veya G) belirtilen kimlikle astar nükleotit sayısı. - Tasarım 2 nd PCR ( şekil 1B) için iç içe geçmiş astar (N_up-ileri ve N_up-geri).
Not: her ne kadar en dıştaki astar çifti (yukarı-ileri ve aşağı-geri) 2 nd için PCR astar kullanılabilir, iç içe geçmiş astar (N_up-ileri ve N_up-geri) Bu protokol için dizayn edilmiştir. İç içe geçmiş astar için 2 nd PCR, Temsilcisi sonuçları ayrıntılı olarak sık sık gerekli. - Tasarım astar spc r için belirli. Astar koloni PCR için ekran gtfC bozulma için kullanılır.
- Tasarım astar gtfC doğrulanması için kesinti.
Not: Bu primerler kullanılarak güçlendirilmiş PCR ürünleri gtfC veya spc r ve yukarı veya aşağı gtfC bölgelerinde kanat arasındaki sınır apışıp kalmak. Astar kümeleri ' gtfC yukarı-ileri ve gtfC yukarı-ters ' ve ' gtfC aşağı-ileri ve gtfC aşağı-ters ' gtfC için özel ve ' gtfC yukarı-ileri ve spc r 2 -geriye doğru ' ve ' spc r 2-ileri ve gtfC aşağı-ters ' spc r için özel.
2. S. mutans çoğunlukla genomik DNA çıkarma
- çizgi stok S. mutan s UA159 bir beyin kalp infüzyon (BHI) agar plaka üzerine. Gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda plaka kuluçkaya.
- Steril bir kürdan kullanarak bir koloni up pick ve BHI suyu 5 mL aşılamak. S. mutan s kültür gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda kuluçkaya.
- Santrifüj bakteriyel hücre kültürü, 2.000 × g. 15 dakika Resuspend hücre Pelet fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 mL.
- , 2.000 × g. 15 dakika santrifüj Resuspend hücre Pelet PBS 200 µL içinde.
- Üretici tarafından sağlanan yönergelere göre bir boncuk-dayak-temel genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak süspansiyon gelen genomik DNA ayıklamak.
- 2.0 mL örnek süspansiyon aktarmak tüp cam boncuk (kit ile birlikte) içeren. Hücre süspansiyon lizis çözüm (kit ile birlikte) 750 µL ekleyin.
- Sıkıca kap ve tüpler simetrik boncuk atan bozulma aparatı tüp sahibi yerleştirin. 5 min için maksimum hızda işlem. Santrifüj boncuk dayak örnekleri 10,000 × g., 1 dk. için Transfer süpernatant (kit ile birlikte) spin filtresi 2.0 mL toplama tüp ve 7.000 × g ., 1 dk santrifüj
- Ekle 1200 µL DNA bağlayıcı arabelleğe filtrate (kit ile birlikte). 2.0 mL toplama tüp ve 10.000 × g., 1 dk santrifüj (kit ile birlikte) spin sütun karışıma 800 µL transfer
- Akış-üzerinden atma spin sütun sütun matris yıkayın ve 10.000 × g. atma akışı aracılığıyla, 1 dk santrifüj kapasitesi, yıkama arabelleği (kit ile birlikte) 500 µL spin için eklemek için 200 µL ön yıkama arabelleği (kit ile birlikte) eklemek sütun sütun matris yıkayın ve 10.000 × g., 1 dk santrifüj kapasitesi
- Spin sütun yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin ve 100 µL (kit ile birlikte) elüsyon arabelleği sütun matris ekleyin. Genomik DNA elute için 10.000 × g
- santrifüj 30 s. Saflık ve DNA toplama 260 Absorbans ölçerek tahmin etmeye nm ve 280 nmusing bir Spektrofotometre ve A 260 /A 280 oranı 1.8 büyük olduğundan emin olun.
3. PCR güçlendirme
- 1 st S. mutan s WT genom ve sentetik spc r gen (bkz. Tablo 1) PCR şablon olarak kullanarak PCR gerçekleştir. Yükseltmek ters yönde kanat gtfC gen bölgesinin, gtfC gen ve astar olarak başına ( şekil 1A yukarıda), açıklanan üç kümesi kullanarak spc r gen aşağı akım kanat bölgesi Tablo 2 ve Tablo 3.
Not: PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla özetlenir. - % 1'özel jel her PCR ürünü fractionate ve jel bant kesici kullanarak karşılık gelen grup tüketim.
- Her bir spin sütun ve silika jel zar bazlı ayıklama kit kullanarak jelleri güçlendirilmiş DNA üründen arındırmak.
- Transfer temiz bir microcentrifuge jel dilimlere tüp ve arabellek (kit ile birlikte) bağlama 500 µL ile karıştırın. Jel dilimleri tamamen çözünene kadar 55 ° C 15 dakika karisimin kuluçkaya.
- (Kit ile birlikte) spin sütun (kit ile birlikte) bir koleksiyon tüp içine koyun, spin sütuna örnek yüklemek ve santrifüj kapasitesi 30 için 11.000 × g s. Akış-üzerinden atmak, Silis membran yıkama ve 30 için santrifüj kapasitesi için Spin sütun yıkama (kit ile birlikte) arabelleği 600 µL eklemek 11.000 × g s.
- Akışı aracılığıyla ve silis membran kurumaya 11.000 × g de 2 dk santrifüj atın.
- Spin sütun yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin, 50 µL ekleyin elüsyon arabellek (kit ile birlikte) ve 2 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya Güçlendirilmiş DNA elute için
- 11.000, 2 dk santrifüj × g. Saflık ve DNA toplama 260 Absorbans ölçerek tahmin etmeye nm ve 280 nmusing bir Spektrofotometre ve A 260 /A 280 oranı 1.8 büyük olduğundan emin olun.
- Gerçekleştir 2 nd 2-adım füzyon Tablo 2 başına PCR Şablonlar olarak üç yaklaşık ekimolar parçaları kullanarak PCR PCR < /stRong > ve Tablo 3.
Not: Bu parçaları AMPLİFİKATÖRLÜ ve iç içe geçmiş primerler kullanılarak spliced ' N_up-ileri ve N_down geri ' veya en dıştaki astar ' yukarı-ileri ve aşağı-geri ' ( şekil 1B). PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri özetlenir Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla. - Yük-onda % 0,8 özel jel PCR reaksiyon karışımı (5 µL) ve uygun amplicon ( şekil 1 c) nesil onaylamak için beklenen Grup boyutu ile güçlendirilmiş grup boyutunu karşılaştırın.
- Etanol yağış arıtma olmadan tarafından kalan son PCR ürünü konsantre.
- Ekleyin 55 µL ultra saf su 100 µL.Add için toplam ses seviyesini ayarlamak için kalan PCR karışımı için % 100 etanol (250 µL) 2.5 birimler tarafından takip 3 M sodyum asetat (10 µL), pH 5.2, onda biri hacmi. Mix ve 30 dk-80 az için donma ° C.
- , 15.000 × g 4 ° C'de 20 dk santrifüj tüp alt Pelet denetlemek ve süpernatant atın. Pelet % 70 etanol, santrifüj, 15.000 × g 4 ° C'de 5 min için 1 mL ile yıkayın ve süpernatant atın. Pelet için yaklaşık 30 dakika kuruması ve ultra saf su 10 µL ile çözülür.
4. Yetkili hücre hazırlık ve hücre dönüşüm
- çizgi stok S. mutan s UA159 BHI agar plaka üzerine. Gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda plaka kuluçkaya.
- Steril bir kürdan kullanarak bir koloni up pick ve BHI suyu 5 mL aşılamak. S. mutan s kültür gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda kuluçkaya.
- BHI suyu 50 mL 2 mL mutan S. s kültür aktarmak ve 6-8 h 37 ° c ile 600 optik bir yoğunluk için kuluçkaya nm 0,2-0,4 anaerobik koşullarda (OD 600).
- Hücreleri 2.000 × g 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve hücreleri iki kez 40 mL % 10 gliserol 40 mL tarafından takip buz gibi su ile yıka.
Not: Sonraki adım kalan maddeler etkiler.
Hücre Pelet % 10 gliserol içinde bağlılık azalır gibi - süpernatant dikkatle Pasteur pipet ile Aspire edin. 1 mL taze % 10 gliserol hücrelerde resuspend, süspansiyon 50 µL her 1.5 mL microcentrifuge tüp içine dağıtmak ve depolamak kullanmadan sadece kadar-80 ° C'de.
- Buz gibi yetkili hücreleri 50 µL aliquot madde 3 te yukarıda bozulma yapı 5 µL ile karıştırın. Elektroporasyon cuvettes (0.2 cm mesafe elektrot arasındaki ile) karışımı ekleyin. Staphylococcus aureus modu istihdam (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF, 1 darbe) elektroporasyon cihazları için electroporate.
- BHI suyu 500 µL hücrelerde hemen elektroporasyon sonra askıya alma ve süspansiyon 50 µL Spektinomisin içeren BHI agar plakaları ekleyin.
Not: Ekstra kuluçka süresi sonra adım gerekli değildir. Ancak, 1-2 h için kuluçka elektroporasyon sonra dönüşüm verimliliği artırabilir. - 2-6 gün anaerobik koşullarda 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
Not: S. mutans çoğunlukla Δ gtfB yukarıda açıklandığı gibi inşa edilmiştir. Tüm kodlayıcı bölge gtfB gen eritromisin direnç gene 8 S. mutans çoğunlukla Δ'yerine olur gtfB. Her S. mutans çoğunlukla zorlanma BHI suyu anaerobik koşullarda 37 ° C'de içinde kültürlü.
5. Gene bozulma ve depolama doğrulama
- Pick rastgele kolonileri ve onları koloni PCR Tablo 2 ve Tablo 3 göre gerçekleştirmek için PCR karışımı içine aşılamak. PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri özetlenir Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla.
- PCR reaksiyon karışımı spc r onaylamak için % 1'özel jel üzerinde yük-belirli DNA band.
- Steril bir kürdan ve alt kültür hücreleri BHI Spektinomisin içeren 10 ml kullanarak pozitif koloni anaerobik koşullarda 37 ° C'de 2 gün suyu alın.
- S. mutans çoğunlukla Δ nesil doğrulamak gtfC.
- Hücre süspansiyon eşit bölün. Yukarıda açıklanan hücreleri genomik DNA ayıklamak (2.3 adımlar. için 2.5.5.). GtfC bozulma (Tablo 1) Tablo 2 ve Tablo 3 başına doğrulanması için primerler kullanılarak PCR şablon olarak PCR genomik DNA ile gerçekleştirmek.
Not: PCR astar, reaktifler ve amplifikasyon döngüleri Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla özetlenir. - PCR karışımı bir % 2 özel jel üzerinde yük ve uygun amplicon . nesil onaylamak için beklenen Grup boyutu ile güçlendirilmiş grup boyutunu karşılaştırın
- 4'te kalan hücre süspansiyon için 2.000 × g de 15 dk santrifüj kapasitesi ° C. Resuspend hücre Pelet PBS 5 mL.
- 2.000 × g 4 de 15 dakika santrifüj ° C. hücre cips 1,5 mL % 25 gliserol içeren BHI suyu ve mağaza-80 ° Cor -20 ° c Resuspend
- Hücre süspansiyon eşit bölün. Yukarıda açıklanan hücreleri genomik DNA ayıklamak (2.3 adımlar. için 2.5.5.). GtfC bozulma (Tablo 1) Tablo 2 ve Tablo 3 başına doğrulanması için primerler kullanılarak PCR şablon olarak PCR genomik DNA ile gerçekleştirmek.
6. Fenotipik analizi
- çizgi her S. mutan s zorlanma BHI agar plaka üzerine. Gecede 37 ° C'de anaerobik koşullarda plaka kuluçkaya.
- Steril bir kürdan kullanarak bir koloni kadar almak ve 2 mL BHI suyu ile veya olmadan uygun antibiyotik içine aşılamak. Gecede anaerobik koşullarda 37 ° C'de kuluçkaya.
- 2 mL cam tüp bebek antibiyotik olmadan %1 veya % 5 Sükroz içeren BHI suyu içine gecede kültür süspansiyon 20 µL aşılamak; 37 ° C anaerobik koşullarda eğimli bir konumda bir gecede test tüpünde hücrelerle kültür.
- Girdap cam test tüpleri için 10 s ve kültür süspansiyonlar dikkatle boşaltmak. Test tüpleri üç kez distile su ile yıkayın. 1 mL % Coomassie parlak mavi (CBB biyofilmler leke) tüp duvara ve 1 dk. için kuluçkaya 0,25 ekleyin
- Boyama çözüm dikkatle boşaltmak test tüpleri üç kez distile su ile yıkayıp kurulayın test tüpleri.
- Renk yoğunluğu ve uzantısı CBB lekeli-görsel olarak fenotipik analizde biyofilm şekillendirme yeteneği belirlemek için biyofilm değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1st PCR, her ürün boyutunu gösteren Şekil 2 üzerinde % 1'özel jel gözlemlediği gibi yaklaşık 1 kb tahmini boyutu ile iyi anlaşma içinde yapıldı. Şekil 3 2nd PCR ürünlerinin Jel Elektroforez analizini gösterir. Şekil 4 S. mutans çoğunlukla kolonileri bozulma yapý ve koloni PCR ürünleri bir Jel Elektroforez analizi ile dönüştürülmüş gösterir. Amplicons bütün kolonilerden tahmini boyutu vardı. Şekil 5 gtfC bozulma ve Jel Elektroforez PCR ürünlerin doğrulanması için astar bağlayıcı siteleri gösterir. GtfC -özel astar kümesini kullanarak amplifikasyon tarafından elde edilen PCR ürünler doğruladı S. mutans çoğunlukla WT ama S. mutans çoğunlukla ΔgtfC, PCR ürünleri spcrkullanılarak elde ise-belirli astar kümesi içinde S. mutans çoğunlukla ΔgtfC, teyit ama S. mutans çoğunlukla içinde WT 6 rakam Sükroz kaynaklı biyofilm şekillendirme yeteneği her S. mutans çoğunlukla baskı gösterir değil. Yapisan bir biyofilm S. mutans çoğunlukla WT Sükroz huzurunda tarafından kuruldu; S. mutans çoğunlukla ΔgtfB yapisan biyofilm şekillendirme yeteneği daha düşük S. mutans çoğunlukla WT çok düşük yapisan biyofilm oluşumu Sükroz varlığında S. mutans çoğunlukla ΔgtfC sergiledi.
Bir yolunu 1:Strategy 2-adım fusion PCR için. Sşematik gösterimi. mutans çoğunlukla ΔgtfC inşaat gösterilir. Gen uzunlukları değildir ölçek. (A) Upstream ve downstream kanat gtfC ve spcr bölgelerinde loci PCR tarafından güçlendirilmiş. Astar bağlayıcı siteleri şablonu tarafından aynı modelleri belirtilir. (B) ikinci PCR adım (şablon olarak) ilk PCR adım iç içe astar ile güçlendirilmiş 3 parçaları kullanılarak gerçekleştirildi. (C) bozulma yapı içinde bakteri suşları homolog rekombinasyon için elde edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Temsilcisi Jel Elektroforez 1st PCR ürünlerinin. Amplicons gtfC ters yönde kanat bölge ve akış aşağı kanat bölge gtfC ve spcr gösterilir. M: moleküler işaretçisi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi Jel Elektroforez gelen 2nd PCR ürünleri. Ürünler iç içe astar ile güçlendirilmiş ve en dıştaki astar gösterilir. Katı ok bozulma yapı tahmini boyutunu gösterir. M: moleküler işaretçisi.
Şekil 4: Koloni PCR (A). tarafından gtfC bozulma için eleme S. mutans çoğunlukla kolonileri Spektinomisin içeren BHI agar plaka üzerinde; Her daire içinde koloni kimliği gösterir (B) temsilcisi Jel Elektroforez koloni PCR ürünlerinin; Her daire içinde lane şekil 4Akarşılık gelen koloni kimliği gösterir. M: moleküler marker, WT: Wild-türü genomik DNA şablon olarak kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Doğrulama PCR tarafından gtfC bozulma. (A) astar bağlayıcı siteleri; Gen uzunluğu değil ölçek. PCR S. mutans çoğunlukla genomik DNA şablon olarak kullanıp gerçekleştirildi. Astar kümeleri: gtfC yukarı-ileri ve gtfC yukarı-ters ( gtfCözel); gtfC aşağı-ileri ve gtfC aşağı-ters ( gtfCözel); gtfC yukarı-ileri ve spcr2-ters ( spcriçin özel); spcr2-ileri ve gtfC aşağı-ters ( spcriçin özel). (B) temsilcisi Jel Elektroforez PCR ürünlerin; her daire içinde lane şekil 5A' ayarlamak karşılık gelen astar gösterir. Tek bir elektroforetik görüntü işaretçisi bantları etiketlemek için ayrılmıştır. M: moleküler işaretleyici (100-baz çifti merdiven). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: fenotipik analizi dayalı biyofilm Development'da. Sükroz kaynaklı biyofilmler her S. mutans çoğunlukla zorlanma tarafından kurulan ile Coomassie parlak mavi lekeli. WT: S. mutans çoğunlukla WT, ΔgtfB: S. mutans çoğunlukla ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans çoğunlukla ΔgtfC. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Astar çifti | Sıra (5'-3') | Beklenen Grup boyutu (bp) | |
| 2-adım PCR gtfC bozulma için | |||
| 1 PCR | |||
| yukarı-ileri yukarı geri çevir |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1,036 | |
| SPCr-ileri SPCr-ters |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1,188 | |
| aşağı-ileri aşağı-ters |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1,059 | |
| 2 PCR | |||
| N_up ileri N_down-ters |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| Doğrulama gtfC bozulma | |||
| Colony PCR tarama için | |||
| S_spcr-ileri S_spcr-ters |
GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG | 535 | |
| Son doğrulama | |||
| gtfC yukarı-ileri gtfC up-ters |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC aşağı-ileri gtfC aşağı-ters |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC yukarı-ileri spcr2-ters |
Yukarıda açıklanan CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2-ileri gtfC aşağı-ters |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Yukarıda açıklanan |
623 | |
| Reaktif | Konsantrasyon hisse senedi çözümleri | Birim | Son konsantrasyonu |
| DNA polimeraz Premiks | 2 × | 25 μL | 1 × |
| İleri astar | 5 MİKRON | 2 μL | 0.2 ΜM |
| Ters astar | 5 MİKRON | 2 μL | 0.2 ΜM |
| Şablon DNA | Değişken | Değişken | Değişken * ** *** |
| Deiyonize su | - | En fazla 50 μL | - |
Tablo 2: PCR reaktifler. * 1st için adım PCR; 100 ng. ** 2nd için PCR; 1st adım PCR amplicon her 30-50 ng. Koloni için PCR; reaksiyon karışıma bakteri hücreleri doğrudan eklenmesi.
| Döngüsü adım | Sıcaklık | Zaman | Döngü sayısı |
| İlk denatürasyon | 98 ° C | 2 dk | 1 |
| Denatürasyon Tavlama Uzantısı |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplicon bağımlı (1 dk/1 kbp) |
35 |
| Son uzantısı | 72 ° C | Amplicon bağımlı (1 dk/1 kbp) |
1 |
Tablo 3: PCR güçlendirme döngüleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokolünde astar 1st PCR için yaklaşık 1 kb upstream ve downstream genom hedef bölgede bölgelerinde kanat yükseltmek için tasarlanmış olmalıdır. Homolog rekombinasyon verimliliğini artırmak gerekli uzun kanat böyle dizileridir.
Astar dizisi (up-geri, aşağı-ileri, spcr-ileri ve spcr-ters) Bu protokol için otomatik olarak bozulma yapı birleşme ücreti göre belirlenmiştir. Her astar 15 üsleri tamamlayıcı 2nd PCR şablon bölge 5' adlı sonuna içerir. Daha uzun bir bağlama site daha verimli üretim kesintileri yapı sağlar. Bölge 5' her astar en az 10 tamamlayıcı üslerini dahil9tavsiye edilir.
İç içe geçmiş astar (N_up-ileri ve N_up-geri) en dıştaki astar (yukarı-ileri ve aşağı-geri) yerine 2nd PCR için kullanılmıştır. 2nd PCR için en dıştaki astar kullanılması bazı durumlarda faydalıdır; S. mutans çoğunlukla ΔgtfB bozulma yapı başarılı amplifikasyon (veri gösterilmez) en dıştaki primerler kullanılarak sağlanır. Ancak, en dıştaki astar kullanımı 2nd PCR adım için sık sık şekil 3' te gösterildiği gibi yetersiz PCR güçlendirme olmaktadır. İç içe geçmiş astar kullanılması bu sorunu9gidermek için bulundu. Bozulma yapı önemli ölçüde bile iç içe primerler kullanılarak güçlendirilmiş değil, ancak, yeniden tasarımı 1 PCR kullanılan astar gerekli olabilir.
Koloni PCR gen alt üst baskı uygun tarama sağlar. Astar bilinen sıralarının spcrkullanarak gen alt üst soy nesil için uygulanabilir. Elektroporasyon kullanılarak elde dönüşüm verimliliği genellikle diğer yordamlar tarafından etkin daha yüksek olduğu gibi elektroporasyon S. mutans çoğunlukla WT, bozulma yapıları, giriş için kullanıldı. At serum veya at serum yetkinlik uyarıcı peptidler ile kullanarak dönüştürme streptokok10,11,12' yaygın olarak kabul edilir. Bir elektroporasyon aparat gerekli olmasına rağmen yetkili hücre hazırlık gibi dahil daha basit daha fazla alternatif yöntemler10,11olan işlemlerdir. Buna ek olarak, elektroporasyon açısından hayvan refah önerilir.
Mevcut iletişim kuralı numarası ofantibiotic işaretçileri bağlı olarak birden çok gen bozulma için geçerlidir. GtfC- ve gtfBoluşturmak için- S. mutans çoğunlukla suşları, örneğin, DNA yapısı gtfCiçin kesintiye-2-adım PCR tarafından inşa bozulma S. mutans çoğunlukla Δ dönüştürülmüşgtfB. GtfC ve gtfB bu durumda bitişik olduğundan, S. mutans çoğunlukla ΔgtfC ve S. mutans çoğunlukla ΔgtfB genleri 2-adım PCR için şablonlar olarak için homolog sıralarını korumak için kullanılması gerekir homolog Rekombinasyon. Hatta, gen kesintiye S. mutans çoğunlukla iki katına zorlanma daha önce bu protokolü9tarafından inşa.
S. mutans çoğunlukla gene bozulma için mevcut iletişim kuralı gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte. Bu iletişim kuralı geleneksel iletişim kuralları'nda ilgili Gen Klonlama adım gerekli değildir. Buna ek olarak, PCR tek gerekli enzimatik reaksiyon olduğunu; Bu nedenle, plazmid vektörel çizimler, Escherichia coli, ligaz ve enzimleri gerekli değildir. Ayrıca, yapı tasarım restriksiyon enzimi hedef gen sitelerin bağımsız olarak mevcut Protokolü bozulma yapı tasarım açısından daha fazla esneklik sunar. Araştırmacılar silinmiş veya ters yönde kanat bölgeleri amplifikasyon için ters astar ve akış aşağı kanat bölgeleri amplifikasyon için ileri astar tasarlamak için genom korunmuş bölgelerde tespit edebilir. Bu bölgeler kanat hemen ters yönde ve DNA bölgesinin hemen aşağı akım silinmek üzere sırasıyla istenen. Gibi esneklik yakın genlerin ifade üzerinde kutup etkileri gibi dış etkilerden azaltmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser bilim promosyon [Grant sayıları 16 K 15860-m. ve 15 K 15777 N.H. için] Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
Tags
Genetik sorunu 128 Gene bozulma DNA yapısı Polimeraz zincir reaksiyonu astar tasarım antibiyotik direnci marker gen Streptococcus mutans çoğunlukla çoğalmasıyla homolog rekombinasyon View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
