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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56319
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Abstract

Typische Methoden für die Aufklärung der Funktion eines bestimmten Gens beinhalten vergleichende phänotypische Analysen der Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem das gen des Interesses gestört wurde. Ein Gen-Störung DNA-Konstrukt mit einer geeigneten Antibiotika-Resistenz-Markergen eignet sich für die Erzeugung von gen gestört Stämme in Bakterien. Jedoch mit herkömmlichen Bauweisen, die Gene Klonen Schritte erfordern, komplexe und zeitraubende Protokolle verbunden. Hier ist eine relativ einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur gezielten gen Störung in Streptococcus Mutans beschrieben. Die Methode nutzt eine 2-stufige Fusion Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Störung Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation zu generieren. Diese Methode erfordert keine enzymatische Reaktion als PCR, und bietet zudem mehr Flexibilität hinsichtlich der Gestaltung des Konstrukts Störung. Beschäftigung von Electroporation erleichtert die Vorbereitung der kompetenten Zellen und verbessert die Transformationseffizienz. Das vorliegende Verfahren kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Introduction

Gen Funktionsanalyse umfasst in der Regel einen phänotypische Vergleich zwischen einem Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem ein bestimmtes Gen des Interesses gestört wurde. Diese gen-Störung-Technik ist für die Funktion von Genanalysen in einer Vielzahl von Taxa, von Bakterien bis zu den Säugetieren verwendet worden. Ein Gen-Störung-Konstrukt ist notwendig für die Generation des Stammes gen gestört; Dieses Konstrukt der Desoxyribonukleinsäure (DNA) besteht aus der Antibiotikaresistenz-Marker-gen mit den vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen des Zielgens verschmolzen und ist integriert in das Genom durch homologe Rekombination. Die gen-gestört Belastung kann mithilfe von Selektivmedien mit dem Antibiotikum isoliert sein. Die konventionelle Methode verwendet für den Bau des Stammes gen gestört erfordert komplexe Arbeitsschritte, wie die Verstärkung des Zielgens durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Unterbindung des Gens in eine geeignete Plasmid, Verdauung mit Einschränkung Enzyme und Religation Antibiotikaresistenz-Marker-gen eingefügt. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, die mehrere Tage bis zu mehreren Wochen, je nach Erfolg der einzelnen Schritte. Darüber hinaus ist das Design der Störung Konstrukte der Beschränkungsenzymsites des Zielgens abhängig. Um diese Probleme zu beheben, wurden DNA-PCR-basierter Spleißen Methoden1,2 für die Gestaltung von gen gestört Mutanten von Dictyostelium Discoideum3 und Synechocystis SP. PCC68034 gemeldet. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode entwickelt, um ein Gen gestört Streptokokken Stamm in eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Art und Weise, unter Verwendung einer modifizierten PCR-basierten Methode (2-stufige Fusion PCR bezeichnet) für den Bau der Störung zu erzeugen Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation.

Die 2-stufige Fusion benötigten PCR genomischer DNA, die Antibiotikaresistenz-Marker-gen als Kopiervorlage PCR und vier Paare von angemessen entworfen Oligonukleotid-Primer. Im ersten Schritt (1St PCR), ein 1-kb upstream flankierenden Region des Zielgens, ein 1-kb downstream flankierenden Region des Ziels werden gen und Antibiotikaresistenz-Marker-gen mittels PCR amplifiziert. Die 5' Regionen der rückwärts-Primer und die forward Primer für Verstärkung von den vorgelagerten und nachgelagerten flankierenden Regionen, bzw. gehören 15 Basen komplementär zu den Enden des Markergens. Die 5' Regionen von forward und reverse Primer für Marker-gen-Amplifikation gehören ebenso 15 Basen komplementär zu der unteren Ende der vorgelagerten flankierenden Region des Zielgens und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Region des Zielgens, bzw.. Daher enthalten die drei amplifizierten Fragmente überlappende 30 Basenpaare Regionen auf dem Fusion-Gelände. Im zweiten Schritt (2Nd PCR) ist die PCR mit verschachtelten PCR Primer verwenden die drei Fragmente, die durch die 1St PCR als Vorlagen verstärkt durchgeführt. Die komplementäre Regionen der Vorlagen sind zusätzlich über 2Nd PCR miteinander verbunden. Zu guter Letzt wird das Konstrukt für homologe Rekombination der Wildtyp Stamm durch Elektroporation vorgestellt. Erfolgreiche gen Störung kann durch PCR mit spezifischen Primern verifiziert werden. Obwohl die Störung Konstrukt mit High-Fidelity-DNA-Polymerase verstärkt ist, sind zusätzliche enzymatische Reaktionen, wie DNA-Ligatur oder DNA-Verdauung, nicht notwendig, um das Konstrukt zu erzeugen. Darüber hinaus kann eine gelöschte oder erhaltene Region über das Genom nach besser gekleideteres Design flexibel gewählt werden.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte Löschung der gesamten kodierenden Region des Gens GtfC , die Glucosyltransferase in Streptococcus Mutanskodiert, um die schnelle, einfache gen Störung Methode in einer Streptokokken-Spezies zu demonstrieren. Darüber hinaus eine GtfB-gestörten Belastung wurde auf die gleiche Weise erzeugt. Die Glucosyltransferases von GtfC und GtfB kodiert tragen zur kariogenen dentale Biofilm Entwicklung5,6. Die Bildung von Biofilm Fähigkeiten der Wildtyp-Stamm (S. Mutans WT), GtfC-Dehnung (S. Mutans ΔGtfC) und GtfBgestört-gestörten Belastung (S. Mutans ΔGtfB) wurden ausgewertet für vergleichende phänotypische Analysen. Dieses Protokoll erweitert die Anwendung eines zweistufigen Verfahrens zur gen Störung einer zusätzlichen Arten und für Studien der Genfunktion in einem breiteren Spektrum von Taxa geändert werden kann.

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Protocol

1. besser gekleideteres Design

  1. Primer für 2-stufige Fusion PCR und Überprüfung der gen Störung vorzubereiten.
    Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt der Primer-Sequenzen, die in diesem Protokoll verwendeten. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der 2-stufigen Fusion PCR Methode zur Erzeugung von S. Mutans Δ GtfC.
    1. Design Primer für den Ersatz der Zielregion im Genom mit Spectinomycin-Resistenz-Gen (Spc R) 7. Dieses Protokoll ersetzt die gesamte kodierende Region des Gens GtfC mit Spc R.
    2. Gehören Komplementär zu den oberen und unteren Enden der Spc R 15 Stützpunkte an der 5 ' Regionen des Up-Reverse und Down-Forward Primer, beziehungsweise. Einfügen, ergänzen das untere Ende der vorgelagerten flankierenden Regionen GtfC und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Regionen GtfC 15 Stützpunkte an der 5 ' Regionen des Spc R-vorwärts und Spc r -Primer, bzw. rückgängig zu machen ( Abbildung 1A).
      Hinweis: Sequenzen von Up-Reverse, Down-Forward, Spc R - vorwärts und Spc R - reverse Primer werden automatisch in Abhängigkeit vom Ort der Gründung des Konstrukts Störung ermittelt.
    3. Design die bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer umfassen > 1-kb upstream und downstream flankierenden Regionen des Gens GtfC bzw.. Legen Sie die Schmelztemperatur (T m) bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer im Einklang mit der Schmelztemperatur des Up-Reverse und Down-Forward Primer, bzw. ( Abbildung 1A).
      Hinweis: Finden Sie die folgende Formel zur Bestimmung von T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, wo * N entspricht der Anzahl der Grundierung Nukleotide mit der angegebenen Identität (A, T, C oder G).
    4. Design verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) für die 2 Nd PCR ( Abbildung 1 b).
      Hinweis: Obwohl die äußerste Primerpaar (bis nach vorne und nach unten-Reverse) als Primer für die 2 Nd PCR verwendet werden können, wurden verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) in diesem Protokoll entworfen. Verschachtelte Primer sind häufig erforderlich für die 2 Nd PCR, wie beschrieben in den Vertreter Ergebnisse.
    5. Design Primer spezifisch für Spc R. Die Primer dienen zur Kolonie PCR zum Bildschirm für GtfC Störung.
    6. Design-Primer für die Überprüfung der GtfC Störung.
      Hinweis: Die PCR-Produkte verstärkt mit diesen Primer überspannen die Grenze zwischen GtfC oder Spc R und stromaufwärts oder stromabwärts flankierenden Regionen GtfC. Die Primer-Sets ' GtfC bis nach vorne und GtfC Up-Reverse ' und ' GtfC Down-Forward und GtfC Down-Reverse ' sind spezifisch für GtfC und ' GtfC bis nach vorne und Spc R 2 -umgekehrte ' und ' Spc R 2-vorwärts und GtfC Down-Reverse ' sind spezifisch für Spc R.

2. Genomische DNA-Extraktion von S. Mutans

  1. Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte Gehirn Herz Infusion (BHI). Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  2. Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  3. Zentrifuge die bakterielle Zellkultur für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  4. Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS.
  5. Genomischen DNA aus der Suspension mit einem Wulst-Prügel-Base genomische DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
    1. Übertragung der Aussetzung zu einer Probe 2,0 mL Röhrchen mit Glasperlen (im Kit enthalten). Die Zellsuspension 750 µL Lyse-Lösung (im Kit enthalten) hinzufügen.
    2. Kappe fest und setzen die Rohre symmetrisch in den Schlauchhalter der Wulst-schlagende Störung Vorrichtung. Prozess mit der maximalen Geschwindigkeit für 5 Minuten. Zentrifuge die Wulst geschlagen Proben 1 min auf 10.000 × g. übertragen den Überstand zum Spin Filter (im Kit enthalten) in einem 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 7.000 × g .
    3. Fügen Sie 1.200 µL DNA-Bindung Puffer (im Kit enthalten), das Filtrat. Transfer 800 µL der Mischung auf die Spin-Spalte (im Kit enthalten) zu einer 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 10.000 × g.
    4. Verwerfen die Durchströmung der Spin Spalte Waschen die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g. verwerfen der durchströmten sowie 500 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) auf den Spin 200 µL Vorwäsche Puffer (im Kit enthalten) hinzufügen. Spalte, waschen Sie die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g.
    5. Setzen Sie die Spin-Säule zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Hinzufügen der Spalte Matrix 100 µL der Elution Buffer (im Kit enthalten).
    6. Zentrifuge für 30 s bei 10.000 × g, die genomische DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.

3. PCR-Amplifikation

  1. Perform 1 St PCR mit S. Tetris s WT Genom und das synthetische Spc R gen als PCR-Vorlagen (siehe Tabelle 1). Verstärken der vorgelagerten flankierenden Region des Gens GtfC, der nachgeschalteten flankierenden Region GtfC gen und das Spc-R-gen mit den drei Sätzen von Primer beschrieben ( Abbildung 1A), als pro Tabelle 2 und Tabelle 3.
    Hinweis: PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..
  2. Jeder PCR-Produkt auf einem 1 % Agarose-Gel Fraktionieren und Verbrauchsteuern die entsprechenden Bänder mit einem Gel Band Cutter.
  3. Reinigen jedes amplifizierten DNA-Produkt aus die Gele mit einem Spin Spalte und Silica Gel Membran-basierte Extraktion Kit.
    1. Übertragung Gel Scheiben zu einer sauberen Microcentrifuge Rohr und mischen mit 500 µL Puffer (im Kit enthalten) zu binden. Die Mischung bei 55 ° C für 15 min inkubieren, bis die Gel Scheiben vollständig gelöst sind.
    2. Setzen Sie die Spin-Säule (im Kit enthalten) in ein Sammelrohr (im Kit enthalten), laden Sie die Probe auf die Spin-Säule und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g. Verwerfen der durchströmten, fügen Sie die 600 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) der Spin Spalte Waschen die Kieselsäure-Membran und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g.
    3. Verwerfen die Durchströmung und Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g Kieselsäure Membran trocknen.
    4. Legen die Spin-Spalte zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, 50 µL Elution Buffer (im Kit enthalten) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 min.
    5. Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g, die amplifizierte DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.
  4. Perform 2 Nd PCR der 2-stufigen Fusion PCR mit den drei etwa äquimolaren Fragmente als PCR-Vorlagen, gem. Tabelle 2 < RichtlinienintervallRong > und Tabelle 3.
    Hinweis: Diese Fragmente wurden verstärkt und gespleißt mit verschachtelten Primer ' N_up vorwärts- und N_down-Reverse ' oder die äußerste Primer ' bis nach vorne und nach unten-Reverse ' ( Abbildung 1 b). PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.
  5. Laden ein Zehntel der PCR Reaktionsmischung (5 µL) auf einem 0,8 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate ( Abbildung 1).
  6. Konzentrieren, das verbleibende Endprodukt PCR durch Ethanol Fällung ohne Reinigung.
    1. Hinzufügen 55 µL ultrareines Wasser zu den restlichen PCR Mischung die gesamte Lautstärke zu 100 µL.Add ein Zehntel-Volumen von 3 M Natriumacetat (10 µL), pH 5,2, gefolgt von 2,5 Bände von 100 % Ethanol (250 µL). Mischen und Einfrieren für 30 min bei-80 ° c
    2. Zentrifuge für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C, überprüfen Sie, ob die Kugel auf der Unterseite des Schlauches und den Überstand verwerfen. Das Pellet mit 1 mL 70 % Ethanol, Zentrifuge für 5 min bei 15.000 × g bei 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands. Das Pellet für etwa 30 min an der Luft trocknen und mit 10 µL ultrareines Wasser auflösen.

4. Kompetente Zellen Vorbereitung und Zelle Transformation

  1. Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  2. Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  3. Kultur der S. Tetris 2 mL auf 50 mL BHI-Bouillon übertragen und inkubieren Sie für 6-8 h bei 37 ° C zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,2-0,4 unter anaeroben Bedingungen.
  4. Die Zellen für 15 min bei 2.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert, überstand verwerfen und waschen die Zellen zweimal mit 40 mL eiskaltes Wasser, gefolgt von 40 mL 10 % Glycerin.
    Hinweis: Reststoffe Einfluss auf nachfolgende Elektroporation.
  5. Aspirieren den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette, wie die Einhaltung des Pellet-Zelle in 10 % Glycerin reduziert wird. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL frisch 10 % Glycerin, 50 µL der Suspension in jeder 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu verzichten und bei-80 ° C bis kurz vor der Verwendung zu speichern.
  6. Mix der 50 µL Aliquote des eiskalten kompetente Zellen mit 5 µL der Störung Konstrukt oben in Abschnitt 3 beschrieben. Fügen Sie die Mischung zur Elektroporation Küvetten (mit einem 0,2 cm Abstand zwischen den Elektroden). Den Staphylococcus Aureus-Modus beschäftigen (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF 1 Impuls) der Elektroporation Vorrichtung, Electroporate.
  7. Unterbrechen die Zellen in 500 µL der BHI-Bouillon unmittelbar nach Electroporation und Spectinomycin-haltigen BHI-Agarplatten 50 µL der Suspension hinzu.
    Hinweis: Zusätzliche Inkubation Zeit nach Elektroporation nicht erforderlich ist. Jedoch kann die Inkubation für 1-2 h nach Electroporation Transformationseffizienz verbessern.
  8. 2-6 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen die Platte inkubieren.
    Hinweis: S. Mutans Δ GtfB ist aufgebaut wie oben beschrieben. Die gesamte kodierende Region des Gens GtfB wird ersetzt mit dem Erythromycin Widerstand gen 8 in S. Mutans Δ GtfB. Jeder Stamm S. Mutans in BHI Brühe bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.

5. Überprüfung der Gene Störung und Lagerung

  1. Wählen Sie zufällige Kolonien und in die PCR Mischung Kolonie PCR gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3 durchführen zu impfen. PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.
  2. Laden die PCR Reaktionsmischung auf einem 1 % Agarosegel, die Spc R zu bestätigen-spezifischen DNA-Band.
  3. Wählen Sie die positiven Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und Subkultur Zellen in 10 mL Spectinomycin-haltigen BHI Brühe für 2 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.
  4. Überprüfen die Generation von S. Mutans Δ GtfC.
    1. Teilen die Zellsuspension gleichermaßen. Genomischen DNA aus den Zellen, die oben beschriebenen zu extrahieren (Schritte 2,3., 2.5.5.). Führen Sie PCR mit genomischer DNA als Vorlage für die PCR, mit Primer für die Überprüfung der GtfC Störungen (Tabelle 1) gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3.
      Hinweis: Die PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..
    2. Laden die PCR-Mischung auf einem 2 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate .
    3. Zentrifugieren verbleibende Zellsuspension für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° c Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL PBS.
    4. Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° C. Aufschwemmen die Zelle pellet in 1,5 mL BHI-Bouillon mit 25 % Glycerin und speichern in-80 ° ADR-20 ° C.

6. Phänotypische Analyse

  1. Streifen jedes S. Tetris s Belastung auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  2. Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 2 mL BHI-Bouillon mit oder ohne entsprechenden Antibiotikum zu impfen. Inkubation über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.
  3. 20 µL der Nacht Kultur Suspension in 2 mL BHI-Bouillon mit 1 % oder 5 % Saccharose ohne Antibiotika in ein Reagenzglas zu impfen; mit dem Reagenzglas in eine Schräglage über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen Kulturzellen.
  4. Vortex das Glas Reagenzgläser für 10 s und dekantieren Kultur Suspensionen. Die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Coomassie Brilliant blau (CBB) um die Biofilme Fleck auf der Rohrwand und inkubieren dann 1 min.
  5. Der Färbelösung zu dekantieren, die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen und trocknen die Reagenzgläser.
  6. Farbdichte und Erweiterung des CBB gebeizt-Biofilms visuell zu bestimmen, die Bildung von Biofilm Fähigkeit in eine phänotypische Analyse bewerten.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt, dass die Größe der einzelnen Produkte von der 1St PCR, war wie auf dem 1 % Agarosegel beobachtet, in guter Übereinstimmung mit der prognostizierten Größe von ca. 1 kb. Abbildung 3 zeigt die Gel-Elektrophorese Analyse der Produkte der 2Nd PCR. Abbildung 4 zeigt S. Mutans Kolonien mit der Störung-Konstrukt und ein Gel-Elektrophorese Analyse der Kolonie-PCR-Produkte verwandelt. Der Amplifikate aus allen Kolonien waren die prognostizierten Größe. Abbildung 5 zeigt die Primer-Bindungsstellen für die Überprüfung der GtfC Störungen und Gel-Elektrophorese der PCR-Produkte. PCR-Produkte durch die Amplifikation mit dem GtfC -spezifischen Primer Set wurden in S. Mutans WT, aber nicht in S. Mutans ΔGtfC, bestätigt, während PCR Produkte erhalten mit dem SpcR-spezifischen Grundierung Satz bestätigten sich in S. Mutans ΔGtfC, aber nicht in S. Mutans WT Abbildung 6 zeigt die Saccharose abgeleitet Biofilm bilden Fähigkeit von jedem Stamm S. Mutans . Eine anhaftende Biofilm wurde von S. Mutans WT in Anwesenheit von Saccharose gebildet; die anhaftende Biofilm bilden Fähigkeit von S. Mutans ΔGtfB wurde unterhalb von S. Mutans WT S. Mutans ΔGtfC sehr niedrigen anhaftende Biofilmbildung im Beisein von Saccharose ausgestellt.

Figure 1
Figur für die 2-stufige Fusion PCR 1:Strategy. Eine schematische Darstellung der S. Mutans ΔGtfC Bau wird angezeigt. Die gen-Längen sind nicht maßstabsgetreu. (A) vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen GtfC und SpcR wurden Loci mittels PCR verstärkt. Die Grundierung Bindungsstellen in der Vorlage werden durch identische Muster angezeigt. (B) der zweite PCR Schritt erfolgte mittels (als Vorlage) die 3 Fragmente, die in einem ersten Schritt der PCR mit verschachtelten Primer verstärkt wurden. (C) die Unterbrechung-Konstrukt wurde für homologe Rekombination in der Bakterienstämme erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Gelelektrophorese von Produkten aus der 1St PCR. Amplifikate der vorgelagerten flankierenden Region von GtfC und nachgelagerten flankierenden Region GtfC und SpcR werden angezeigt. M: molekulare Marker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: repräsentative Gelelektrophorese von Produkten aus den 2Nd PCR. Produkte mit verschachtelten Primer verstärkt und die Regionen in äußerster Primer werden angezeigt. Der solide Pfeil zeigt die prognostizierte Größe des Konstrukts Störung. M: molekulare Marker.

Figure 4
Abbildung 4: Screening für GtfC Störung von Colony PCR (A). S. Mutans Kolonien auf der Spectinomycin-haltigen BHI-Agar-Platte; Jede Eingekreiste Zahl zeigt Kolonie-ID. (B) repräsentative Gelelektrophorese der Kolonie-PCR-Produkte; Jede eingekreisten Lane-Zahl gibt die entsprechenden Kolonie ID in Abbildung 4A. M: molekulare Marker, WT: Wildtyp genomische DNA als Vorlage verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Überprüfung der GtfC Störung durch PCR. (A) Primer-Bindungsstellen; gen-Länge ist nicht maßstabsgetreu. PCR erfolgte mittels S. Mutans genomischen DNA als Vorlage. Primer-Sets: GtfC bis nach vorne und GtfC Up-Reverse (spezifisch für GtfC); GtfC Down-Forward und GtfC Down-Reverse (spezifisch für GtfC); GtfC Up-Forward und SpcR2-Rückseite (spezifisch für SpcR); Spc-R2-vorwärts und GtfC Down-Reverse (spezifisch für Spc-R). (B) repräsentative Gelelektrophorese PCR-Produkte; jede eingekreisten Lane Zahl zeigt die entsprechende Grundierung in Abbildung 5Afestgelegt. Ein Einzelbild elektrophoretischen gliedert sich um den Marker-Bands zu beschriften. M: molekulare Marker (100 Basenpaaren Leiter). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: phänotypische Analyse basierend auf Biofilm Entwicklung. Saccharose abgeleitet Biofilmen von jedem S. Mutans -Stamm gebildet wurden mit Coomassie brilliant blau gefärbt. WT: S. Mutans WT, ΔGtfB: S. Mutans ΔGtfB, ΔGtfC: S. Mutans ΔGtfC. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG
CAGCCACTGCATTTCCCGCAATATCTTTTGGTATG

Tabelle 1: in diesem Protokoll verwendeten Primer. Die unterstrichenen Sequenzen von "Up-Reverse und SpcR-vorwärts" und "SpcR-reverse und Down-Forward" sind komplementär. Die Fett typisierte Sequenzen von "Up-Reverse und SpcR-vorwärts" und"Spc-R- R und Down-Forward" sind komplementär.

Primerpaar Sequenz (5' 3') Erwarteten Bandgröße (bp)
2-stufige PCR für GtfC Störung
1. PCR
Up-forward
Up-Rückseite		 AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC
CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA		 1.036
SPC-R-vorwärts
SPC-R-rückwärts		 ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT
CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT		 1.188
Down-forward
Down-Rückseite		 AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG
TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC		 1.059
2. PCR
N_up-forward
N_down-Rückseite		 TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC
GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG		 3.132
Überprüfung der GtfC Störung
Kolonie PCR für das screening
S_SpcR-vorwärts
S_SpcR-rückwärts		 535
Abschließende Überprüfung
GtfC Up-forward
GtfC Up-Rückseite		 TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG
GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG		 498
GtfC Down-forward
GtfC Down-Rückseite		 GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG
TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG		 557
GtfC Up-forward
Spc-R2-Rückseite		 Oben beschriebenen
CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC		 641
Spc-R2-vorwärts
GtfC Down-Rückseite		 GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG
Oben beschriebenen		 623
Reagenz Konzentration der Stammlösungen Volumen Endkonzentration
DNA-Polymerase premix 2 × 25 ΜL 1 ×
Forward primer 5 ΜM 2 ΜL 0,2 ΜM
Rückwärts-primer 5 ΜM 2 ΜL 0,2 ΜM
Schablone DNA Variable Variable Variable * ** ***
Deionisiertes Wasser - bis zu 50 μL -

Tabelle 2: PCR Reagenzien. * Für 1St Schritt PCR; 100 ng. ** Für 2Nd PCR; jede 30-50 ng der 1St Schritt PCR Amplifikate. Für die Kolonie PCR; direkte Zugabe von bakteriellen Zellen zum Reaktionsgemisch.

Zyklus-Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung 98 ° C 2 min 1
Denaturierung
Glühen
Erweiterung		 98 ° C
55 ° C
72 ° C		 10 s
4 R
Amplifikate angewiesen
(1 min/1 Kbp)		 35
Letzte Erweiterung 72 ° C Amplifikate angewiesen
(1 min/1 Kbp)		 1

Tabelle 3: PCR Verstärkung Zyklen.

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Discussion

In diesem Protokoll sind die Primer für die 1St PCR auszulegen, um ca. 1 kb upstream und downstream flankierenden Regionen der Zielregion im Genom zu verstärken. Solche lange flankierenden Sequenzen sind notwendig, um die Effizienz der homologen Rekombination.

Die Sequenzen der Primer (Up-Reverse, Down-Forward, SpcR-vorwärts und SpcR-rückwärts) in diesem Protokoll wurden automatisch ermittelt basierend auf dem Gelände der Einbeziehung des Konstrukts Störung. Jede Grundierung beinhaltet 15 Basen komplementäre bis zum Ende der 2Nd PCR-Vorlage in der 5'-Region. Eine längere Bindungsstelle ermöglicht eine effizientere Produktion des Konstrukts Störung. Aufnahme von mindestens 10 komplementären Basen an der 5' Region jeweils Fibel wird9empfohlen.

Verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) dienten der 2Nd PCR, anstatt die äußerste Primer (bis nach vorne und nach unten-Rückseite). Die Verwendung der äußersten Primer für die 2Nd PCR ist in einigen Fällen von Vorteil; erfolgreiche Verstärkung der Störung Konstruktion für S. Mutans ΔGtfB wurde erreicht mit der äußersten Primer (Daten nicht gezeigt). Die Verwendung der äußersten Primer für den 2Nd PCR Schritt führt jedoch häufig nicht ausreichend PCR Verstärkung, wie in Abbildung 3dargestellt. Die Verwendung von geschachtelten Primer erwies sich um dieses Problem9zu beheben. Wenn die Unterbrechung-Konstrukt nicht wesentlich sogar unter Verwendung der verschachtelten Zündkapseln verstärkt ist, jedoch kann Neugestaltung der verwendet in der 1. PCR Primer erforderlich sein.

Kolonie PCR ermöglicht bequeme Screening des Stammes gen gestört. Primer der bekannten Sequenzen können für die Generation der Verwendung von SpcRgen gestört Sorte angewendet werden. Elektroporation diente für die Einführung der Störung Konstrukte in S. Mutans WT, als die Transformationseffizienz erreicht durch Elektroporation in der Regel höher als die durch andere Verfahren aktiviert ist. Transformation mit Pferd Serum oder Pferd Serum mit Kompetenz-stimulierenden Peptide, ist weitgehend akzeptiert in Streptococcus10,11,12. Obwohl eine Elektroporation Vorrichtung erforderlich ist, sind die Verfahren beteiligt, wie die zuständigen Zelle Vorbereitung, viel einfacher als die Alternativmethoden10,11. Darüber hinaus empfiehlt die Elektroporation aus der Sicht des Tierschutzes.

Dieses Protokoll gilt für mehrere gen Störung, abhängig von der Nummer Ofantibiotic-Marker. GtfC- und GtfBerzeugen- S. Mutans -Stämme, z. B. das DNA-Konstrukt für GtfCgestört-Störung konstruiert durch 2-stufige PCR kann verwandelt S. Mutans ΔGtfB. Da GtfC und GtfB in diesem Fall angrenzen, S. Mutans ΔGtfC und S. Mutans ΔGtfB Genome müssen verwendet werden als Vorlagen für die 2-stufige PCR weiterhin die homologen Sequenzen für homologe Rekombination. In der Tat doppelt gen gestört S. Mutans Belastung wurde zuvor von diesem Protokoll9gebaut.

Dieses Protokolls für gen Störung in S. Mutans kann zur Erzeugung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden. Dieses Protokoll erfordert nicht den gen Klonen Schritt bei der konventionellen Protokolle beteiligt. Darüber hinaus ist die PCR die einzige erforderliche enzymatische Reaktion; Plasmid-Vektoren, Escherichia coliund Ligase Restriktionsenzyme sind daher nicht notwendig. Darüber hinaus bietet dieses Protokolls größere Flexibilität bei der Gestaltung der Störung Konstrukt, da das Konstrukt-Design von Beschränkungsenzymsites des Zielgens unabhängig ist. Forscher können Regionen bestimmen, die gelöscht oder beibehalten im Genom, die rückwärts-Primer für die Amplifikation der vorgelagerten flankierenden Regionen und die forward Primer für Verstärkung der nachgeschalteten flankierenden Regionen zu entwerfen. Diese flankierenden Regionen sind unmittelbar vor und unmittelbar nach der Region der DNA auf Wunsch zum löschen, beziehungsweise. Diese Flexibilität kann verwendet werden, um äußere Einflüsse, wie z. B. polar Effekte auf die Expression von Genen proximate zu verringern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften [Grant-Nummern 16 K 15860, T.M und 15 K 15777 N.H] unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptococus mutans Stock strain in the lab. Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit Zymo Research D6005
Bead-beating disruption apparatus Taitec GM-01
Synthetic genes Eurofins Genomics Custom-ordered Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler Astec PC-708
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered 35 bases in length
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800
Electroporator Bio-rad 1652100
Electroporation cuvette Bio-rad 1652086 0.2-cm gap
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture media
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics
Erythromycin Wako 057-07151 Antibiotics
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining

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References

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Genetik Ausgabe 128 gen Störung DNA-Konstrukt Polymerase-Kettenreaktion besser gekleideteres Design Antibiotikaresistenz-Marker-gen Streptococcus Mutans Elektroporation homologe Rekombination
Generation von einem Gen gestört <em>Streptococcus Mutans</em> Belastung ohne Gene Klonen
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Murata, T., Okada, A., Matin, K.,… More

Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning. J. Vis. Exp. (128), e56319, doi:10.3791/56319 (2017).

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