Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56319
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

Abstract

שיטות טיפוסי הבהרה של הפונקציה של גן מסוים כרוך ניתוח השוואתי פנוטיפי של המתח פראי-סוג של זן אשר שיבשו את הגן עניין. מבנה ה-DNA ג'ין-הפרעה המכיל גן מרקר מתאים עמידות לאנטיביוטיקה היא שימושית לדור של ג'ין-שיבשו זנים של חיידקים. עם זאת, שיטות בנייה קונבנציונלית, אשר דורשים צעדים שיבוט גנטי, כרוכים פרוטוקולים מורכב ולגזול. כאן, מתוארת שיטה יחסית נתיישב, מהירה וחסכונית עבור ג'ין יישוב להפרעה mutans סטרפטוקוקוס . השיטה משתמשת 2-שלב פיוז ' ן תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי ליצור את השיבוש לבנות ואת אלקטרופורציה לשינוי גנטי. שיטה זו אינה דורשת לתגובה אנזימטיות, מלבד PCR, ומציע בנוסף גמישות רבה יותר מבחינת העיצוב של הבונה שיבוש. העסקתם של אלקטרופורציה מקלה על ההכנה של תאים המוסמכת ומשפר את היעילות טרנספורמציה. השיטה הנוכחי עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

Introduction

הפונקציה מפענוח כוללת בדרך כלל השוואה פנוטיפי בין זן פראי-סוג זן שבו גן מסוים של עניין יש נשענה. טכניקה זו ג'ין-הפרעה יש נעזרו ג'ין ניתוחים פונקציה במגוון רחב של taxa, מחיידקים יונקים. מבנה הגן-הפרעה הוא הכרחי עבור הדור של המתח שיבשו-גן; המבנה הזה, חומצה deoxyribonucleic (DNA) מורכב הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה דבוקה את ויוצאת איגוף מחוזות הגן היעד, הוא שולב הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. המתח שיבשו גנים עשויים להיות מבודדים באמצעות המדיה סלקטיבי המכילה האנטיביוטיקה. השיטה המקובלת המשמש לבנייה של המתח שיבשו ג'ין דורש צעדים מורכבים, כגון ההגברה של הגן היעד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מצדו של הגן לתוך פלסמיד מתאים, מערכת העיכול עם הגבלה אנזימים, religation להוסיף את הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה. תהליך זה הוא זמן רב, לוקח מספר ימים עד מספר שבועות, בהתאם להצלחת כל שלב. בנוסף, העיצוב של הפרעה בונה תלויה האתרים אנזים הגבלה של הגן היעד. כדי לפתור בעיות אלה, דווחו DNA מבוססי ה-PCR splicing שיטות1,2 על עיצוב האתר של ג'ין שיבשו מוטציות של Dictyostelium discoideum3 ו- Synechocystis sp. PCC68034 . במחקר הנוכחי, פותחה שיטה ליצור זן streptococcal משובשות ג'ין בצורה מהירה יחסית, נתיישב, וזולה, ניצול שיטה מבוססת-PCR ששונתה (איזור 2-שלב פיוז ' ן PCR) לבנייה של ההפרעה לבנות, אלקטרופורציה לשינוי גנטי.

היתוך גרעיני 2-שלב שה-PCR דורש דנ א גנומי, הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה כתבנית PCR ו- 4 זוגות כראוי מעוצב לנוקלאוטידים. בשלב הראשון (1סנט PCR), אזור במעלה 1-kb איגוף של הגן היעד, אזור במורד הזרם 1-kb איגוף של היעד ג'ין, הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה הם מוגבר על ידי ה-PCR. 5' אזורים ומהצמיגים הפוכה והן את קדימה למתחילים, הגברה של במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים, בהתאמה, כוללים משלים הקצוות של הגן סמן 15 בסיסים. 5' אזורים ויוצאים צבעי יסוד סמן גנטי הגברה באופן דומה לכלול 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזור איגוף במעלה הזרם של הגן היעד, בקצה העליון של האזור איגוף במורד הזרם של הגן היעד, בהתאמה. לכן, שברי מוגבר שלושה מכילים אזורים חופפים זוג 30-בסיסים באתר פיוז'ן. בשלב השני (2nd PCR), PCR מבוצע עם תחל PCR מקוננות באמצעות שלושה שברי מוגבר על ידי 1סנט PCR כתבניות. האזורים משלימים תבניות בנוסף מקושרים אחד לשני באמצעות 2nd PCR. לבסוף, הבונה על רקומבינציה הומולוגית הוא הכיר את המתח פראי-סוג מאת אלקטרופורציה. ניתן לבירור שיבוש גנטי מוצלחת על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים. למרות הבונה הפרעה מוגבר באמצעות אמינות גבוהה DNA פולימראז, תגובות אנזימטיות נוספים, כגון ה-DNA מצדו או עיכול דנ א, אינם הכרחיים ליצירת הבונה. בנוסף, אזור שנמחקו או משומר על הגנום יכול לבחור בגמישות על פי עיצוב פריימר.

בשנת העבודה הנוכחית, בוצעה מחיקה של כל האזור קידוד של הגן gtfC , שמקודד glucosyltransferase ב mutans סטרפטוקוקוס, כדי להדגים את שיטת שיבוש גנטי מהיר, קל זן streptococcal. בנוסף, gtfB-זן שיבשו נוצר באופן זהה. Glucosyltransferases מקודד על ידי הן gtfC והן gtfB לתרום cariogenic שיניים biofilm פיתוח5,6. היכולות להיוות biofilm הפראי-סוג זן (ס' mutans WT), gtfC-הפרעת המתח (Δס mutans gtfC), gtfB-זן שיבשו (Δס mutans gtfB) הוערכו עבור ניתוחים פנוטיפי השוואתי. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של שיטה שני שלבים של הפרעה גן זן נוסף, עשוי להיות שונה עבור מחקרים של ג'ין פונקציה במגוון רחב יותר של taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פריימר עיצוב

  1. להתכונן תחל 2-שלב פיוז ' ן PCR ואימות של שיבוש גנטי.
    הערה: טבלה 1 מציגה את רצפי פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. איור 1 מראה של איור סכמטי של שיטת ה-PCR 2-שלב פיוז ' ן המשמש ליצירת Δ ס mutans gtfC.
    1. תחל עיצוב עבור התחליף של אזור היעד הגנום עם ג'ין (spc r) ההתנגדות spectinomycin 7. פרוטוקול זה מחליף את כל האזור קידוד של הגן gtfC spc r.
    2. לכלול 15 בסיסים משלימים בקצוות העליונים והתחתונים של spc r ב- 5 ' מחוזות היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה. באופן דומה, כולל 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזורים איגוף במעלה הזרם של gtfC, בקצה העליון של האזורים איגוף במורד הזרם של gtfC-5 ' מחוזות spc r-קדימה ואת spc r -הפוך תחל בהתאמה ( איור 1 א').
      הערה: רצפים של היפוך למעלה, למטה-קדימה, spc r - קדימה, ו- spc r - הפוך תחל נקבעים באופן אוטומטי בהתאם אתר מסמכי התאגדות של הבונה הפרעה של.
    3. לעצב את תחל למעלה-קדימה, למטה-הפוך מעגנת > 1-kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של הגן gtfC, בהתאמה. להגדיר את טמפרטורת ההיתוך (T m) של מעלה-קדימה, למטה-הפוך תחל בהתאם טמפרטורת ההיתוך של היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה ( איור 1 א').
      הערה: להפנות הנוסחה הבאה כדי לקבוע T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, היכן * N מייצג את מספר נוקלאוטידים תחל עם הזהות המצוינת (A, T, C או G)-
    4. עיצוב תחל מקוננים (N_up-קדימה ואת היפוך N_up) עבור 2 nd PCR ( איור 1B).
      הערה: למרות הזוג תחל החיצוני (up-קדימה, למטה-אחורי) עשויה לשמש תחל 2 nd PCR, תחל מקוננים (N_up-קדימה ו- N_up-אחורי) עוצבו ב פרוטוקול זה. תחל מקוננים נדרשים לעתים קרובות עבור 2 nd PCR, כמפורט נציג תוצאות.
    5. תחל עיצוב ספציפי עבור spc r. תחל משמשים המושבה PCR למסך להפרעה gtfC.
      6. הפרעה
    6. תחל עיצוב עבור האימות של gtfC.
      הערה: המוצרים PCR מוגבר באמצעות תחל אלה שנושקות לגבול בין gtfC או spc r במעלה או במורד הזרם איגוף מחוזות gtfC. ערכות פריימר ' gtfC up-קדימה ואת gtfC up-הפוך ', ' gtfC למטה-קדימה, gtfC למטה-הפוך ' ספציפיות עבור gtfC, ו ' gtfC up-קדימה ו- spc r 2 -הפוך ', ' spc r 2-קדימה ו- gtfC למטה-הפוך ' ספציפיות עבור spc r.

2. הפקת דנ א גנומי מ ס mutans

  1. המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר המוח אינפוזיה (BHI) הלב. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  2. שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  3. צנטריפוגה התרבות תא החיידק למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
  4. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS.
  5. לחלץ דנ א גנומי התליה באמצעות של חרוז-מכות-בסיס גנומי DNA ערכת חילוץ בהתאם להוראות היצרן-
    1. העברת ההשעיה מדגם 2.0-mL שפופרת המכילה חרוזי זכוכית (כלול בערכה). להוסיף µL 750 בפתרון פירוק (כלול בערכה) התליה תא.
    2. קאפ בחוזקה ולמקם הצינורות באופן סימטרי בעל שפופרת של מנגנון השיבוש חרוז-מכות. תהליך במהירות המרבית עבור 5 דקות. צנטריפוגה הוכה חרוז הדוגמאות עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' × להעביר את תגובת שיקוע המסנן ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב × 7,000 g .
    3. µL 1,200 להוסיף איגוד ה-DNA של מאגר (כלול בערכה) פילטרט. העברת µL 800 של התערובת לעמודה ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×
    4. להשליך הזרימה דרך, להוסיף 200 µL מאגר קדם כביסה (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את המטריצה עמודה, ו צנטריפוגה עבור 1 דקות בג' 10,000 × להשליך הזרימה דרך, להוסיף 500 µL מאגר לשטוף (כלול בערכה) ספין עמודה כדי לשטוף את המטריצה עמודה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×
    5. למקם את העמודה ספין לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge ולהוסיף 100 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה) אל המטריקס עמודה.
    6. צנטריפוגה ב-30 s ב × 10,000 g כדי elute את הדנ א הגנומי. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס 280 /A 260 A גדול מ- 1.8.

3. PCR-הגברה

  1. בצע 1 סנט PCR באמצעות הגנום s WT המוטנטים לפני שהם י ס והגן סינתטי spc r כתבניות PCR (ראה טבלה 1). להגביר את האזור איגוף במעלה הזרם של הגן gtfC, אזור איגוף במורד הזרם של הגן gtfC, הגן spc r באמצעות שלושה זוגות תחל שתוארו לעיל ( איור 1 א'), לפי בטבלה 2 ו- 3 בטבלה.
    הערה: תחל PCR, ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
  2. Fractionate כל מוצר ה-PCR על ג'ל agarose 1% ו בלו הלהקות המתאימים שימוש בחותך הלהקה ג'ל.
  3. לטהר כל מוצר ה-DNA מוגבר של ג'לים שימוש של ספין עמודה, סיליקה ג'ל המבוסס על רפידה ערכת חילוץ.
    1. העברת הפרוסות ג'ל כדי microcentrifuge נקי צינור ומערבבים עם 500 µL של איגוד מאגר (כלול בערכה). דגירה התערובת ב 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד הפרוסות ג'ל התפרקה לחלוטין.
    2. למקם את העמודה ספין (כלול בערכה) לתוך צינור אוסף (כלול בערכה) לטעון את הדגימה אל העמודה ספין, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g. למחוק את הזרימה דרך, להוסיף את µL 600 מאגר לשטוף (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את הקרום סיליקה, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g.
    3. להיפטר זרימה דרך של צנטריפוגה למשך 2 דקות ב × 11,000 g כדי לייבש את הקרום סיליקה.
    4. במקום העמודה ספין לתוך צינור microcentrifuge 1.5-mL החדש, להוסיף 50 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק
    5. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 11,000 × g כדי elute את ה-DNA מוגבר. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס 280 /A 260 A גדול מ- 1.8.
  4. לבצע 2 nd PCR של 2-שלב פיוז ' ן PCR באמצעות שלושה שברי כ equimolar כתבניות PCR, לפי בטבלה 2 < /stרונג > ו לטבלה 3.
    הערה: קטעים אלה היו מוגבר, משולבים באמצעות תחל מקוננים על ' N_up-קדימה ואת היפוך N_down ' או את תחל החיצוני ' up-קדימה, למטה-הפוך ' ( איור 1B). PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
  5. לטעון עשירית של תערובת התגובה PCR (5 µL) ב- 0.8% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים ( איור 1C).
  6. להתרכז המוצר PCR הסופי שנותרו על ידי משקעים אתנול ללא טיהור.
    1. µL להוסיף 55 של אולטרה טהור מים לתערובת PCR הנותרים כדי לכוונן את העוצמה הכוללת כדי 100 µL.Add נפח עשירית של 3 מ' סודיום אצטט (10 µL), pH 5.2, ואחריו 2.5 בנפחים של 100% אתנול (250 µL). לערבב ומקפיאים למשך 30 דקות ב-80 מעלות צלזיוס
    2. צנטריפוגה כעשרים דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, בדוק בגדר בתחתית של התחתית, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. מילה נהדרת בגדר כ 30 דקות, להמיס עם 10 µL של מים אולטרא טהורים.

4. הכנה תא המוסמכת וטרנספורמציה תא

  1. המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  2. שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  3. להעביר 2 מ"ל של התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י 50 מ ל מרק BHI, תקופת דגירה של 6-8 h ב- 37 ° C עד צפיפות אופטית על 600 nm (OD 600) של 0.2-0.4 בתנאים אנאירוביים.
  4. Centrifuge התאים למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מ של קרח מים ואחריו 40 מיליליטר 10% גליצרול.
    הערה: חומרים שיורית משפיע אלקטרופורציה עוקבות.
  5. וארוקן את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה פסטר כמו דבקותה של בגדר תא גליצרול 10% מצטמצם. Resuspend תאי 1 מ"ל של גליצרול 10% טרי, לוותר על 50 µL של ההשעיה לתוך כל שפופרת microcentrifuge 1.5-mL ו לאחסן ב- 80 ° C עד לפני שימוש.
  6. מערבבים את aliquot 50 µL של תאים המוסמכת קפואים עם 5 µL של הבונה הפרעה שתוארו לעיל בסעיף 3. להוסיף את התערובת אלקטרופורציה וואקום (עם מרחק 0.2 ס מ בין האלקטרודות). להעסיק את מצב Staphylococcus aureus (1.8 kV, 600 Ω, 10 µF, הדופק 1) על מנגנוני אלקטרופורציה כדי electroporate.
  7. להשעות את התאים µL 500 BHI מרק מיד לאחר אלקטרופורציה ולהוסיף 50 µL של ההשעיה ללוחות BHI-אגר המכילות spectinomycin.
    הערה: הדגירה תוספת הזמן לאחר אלקטרופורציה אינה נדרשת. עם זאת, דגירה עבור h 1-2 לאחר אלקטרופורציה עשוי לשפר את יעילות טרנספורמציה.
  8. תקופת דגירה לצלחת של 2-6 ימים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
    הערה: S. mutans Δ gtfB נבנה כמתואר לעיל. כל האזור קידוד של הגן gtfB מוחלף עם אריתרומיצין ההתנגדות ג'ין 8 ב Δ mutans ס gtfB. כל זן mutans ס הוא תרבותי ב- BHI מרק ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.

5. אימות של שיבוש גנטי ואחסון

  1. לאסוף מושבות אקראי ואת לחסן אותם לתוך התערובת PCR לבצע המושבה PCR לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה. PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
  2. לטעון את תערובת התגובה PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר את ה-spc r-להקת ה-DNA ספציפיים.
  3. לבחור את המושבה חיובי באמצעות קיסם סטיריליים ותאים תת-תרבות ב 10 מ"ל של spectinomycin-המכילים BHI ציר 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  4. לאמת את הדור של ס' mutans Δ gtfC.
    1. לחלק התליה תא באותה מידה. לחלץ דנ א גנומי מתאי שתוארו לעיל (צעדים 2.3. כדי 2.5.5.). לבצע PCR עם ה-DNA גנומי כתבנית PCR, באמצעות תחל עבור האימות של שיבוש gtfC (טבלה 1) לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה.
      הערה: ה-PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
    2. לטעון את התערובת PCR על 2% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים .
    3. Centrifuge התליה תא הנותרות למשך 15 דקות ב 2,000 × g ב- 4 מעלות צלזיוס Resuspend בגדר תא ב 5 מ של PBS.
    4. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב-4 ° C. Resuspend התא הצניפה ב- 1.5 מ ל מרק BHI המכיל 25% גליצרול ולאחסן ב-80 מעלות קור-20 ° C.

6. ניתוח פנוטיפי

  1. פס כל המוטנטים לפני שהם י S. s זן על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  2. שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך 2 מ ל מרק BHI עם או בלי אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  3. לחסן µL 20 של ההשעיה תרבות לילה לתוך 2 מ ל מרק BHI המכיל 1% או 5% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה במבחנה זכוכית; התרבות התאים עם מבחנה במצב נוטה ללון ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
  4. מערבולת הכוס מבחנות 10 s ו decant תרבות המתלים. רחץ צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% Coomassie מבריק כחול (CBB) כתם biofilms על הקיר צינור ולאחר מכן תקופת דגירה של דק 1
  5. Decant הפתרון מוכתמים, רוחצים צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים, ומייבשים את המבחנות.
  6. להעריך את צפיפות הצבע והן הארכת CBB צבעונית-biofilm באופן חזותי כדי לקבוע את יכולת ניתוח פנוטיפי להיוות biofilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג את הגודל של כל מוצר מ- 1סנט PCR, כפי שנצפה על הג'ל 1% agarose, היה הסכם טוב עם חזה בגודל של 1 kb. איור 3 מראה ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של המוצרים של 2nd PCR. איור 4 מראה המושבות ס mutans טרנספורמציה עם הבונה שיבושים, ניתוח ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR המושבה. Amplicons של כל המושבות היו של גודל החזוי. איור 5 מציג את האתרים מחייב פריימר עבור האימות של הפרעה gtfC ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR. מוצרי ה-PCR מתקבל על ידי הגברה שימוש בערכת פריימר ספציפי gtfC -אומתו ס mutans WT, אך לא ס mutans ΔgtfC, ואילו מוצרים PCR שהושג באמצעות ה- spcr-ספציפי סט פריימר אומתו ב Δ ס mutans gtfC, אבל לא ב- S. mutans WT. איור 6 מראה סוכרוז-derived להיוות biofilm היכולת של כל זן mutans ס . Biofilm חסיד הוקמה על ידי S. mutans WT בנוכחות סוכרוז; היכולת להרכיב biofilm חסיד של ס' mutans ΔgtfB היה נמוך יותר של ס' mutans WT. ס mutans ΔgtfC הציג נמוך מאוד ביופילמים חסיד בנוכחות סוכרוז.

Figure 1
להבין את 1:Strategy עבור 2-שלב פיוז ' ן PCR. איור סכמטי של S. מוצג mutans ΔgtfC הבנייה. אורך הגנים אינם לקנה המידה. (א) במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של gtfC ו- spcr לוקוסים היו מוגבר על ידי ה-PCR. האתרים מחייב פריימר בתבנית מסומנים באמצעות דפוסי זהים. (B) השלב השני PCR בוצעה באמצעות (כמו תבניות) את השברים 3 היו מוגבר בשלב ה-PCR הראשון עם תחל מקוננים. (ג) הבונה הפרעה הושג על רקומבינציה הומולוגית ב זני חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג בג'ל של מוצרים מ 1סנט PCR. Amplicons של האזור איגוף במעלה הזרם של gtfC ואיזור איגוף במורד הזרם של gtfC ו- spcr מוצגים. מ' סמן מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג אלקטרופורזה בג'ל של מוצרים החל 2nd PCR. מוצרים מוגבר עם תחל המקוננת, תחל החיצוני ביותר מוצגים. החץ מוצק מציין את הגודל החזוי של הבונה שיבוש. מ' סמן מולקולרי.

Figure 4
איור 4: ההקרנה להפרעה gtfC על ידי המושבה PCR (א). ס mutans מושבות על הצלחת BHI-אגר המכילות spectinomycin; חגו מספר זה מציין את מזהה המושבה (B) נציג בג'ל של מוצרי ה-PCR המושבה; ליין חגו מספר זה מציין את מספר הזיהוי המושבה המתאים באיור 4A. מ' סמן מולקולרי, WT: פראי-סוג דנ א גנומי המשמש כתבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אימות של שיבוש gtfC על ידי ה-PCR- אתרים מחייב פריימר (א) ; אורך הגן אינו לקנה המידה. PCR בוצעה באמצעות DNA גנומי ס mutans כתבנית. ערכות פריימר: gtfC up-קדימה ואת gtfC היפוך למעלה (ספציפי עבור gtfC); gtfC למטה-קדימה, gtfC למטה-הפוכה (ספציפי עבור gtfC); gtfC up-קדימה ו- spcr2-הפוכה (ספציפי עבור spcr); spcr2-קדימה, gtfC למטה-הפוכה (ספציפי עבור spcr). (B) נציג בג'ל של מוצרי ה-PCR; ליין חגו מספר זה מציין מן המפתח המתאים להגדיר איור 5A. Electrophoretic תמונה אחת מחולקת תווית הלהקות סמן. מ' סמן מולקולרי (100-בסיס זוג הסולם). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ניתוח פנוטיפי המבוססת על פיתוח biofilm. סוכרוז-derived biofilms הנוצרת על-ידי כל זן mutans ס היו מוכתמים Coomassie כחול מבריק. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: ס mutans ΔgtfB, ΔgtfC: ס mutans ΔgtfC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG
CAGCCACTGCATTTCCCGCAATATCTTTTGGTATG

טבלה 1: תחל בשימוש בפרוטוקול זה. רצפי בקו תחתון ' היפוך למעלה ו- spcr-קדימה ', 'spcr-הפוכה, למטה-קדימה "הם משלימים. רצפי מודגש-הקלדת ' היפוך למעלה ו- spcr-קדימה 'spcr- r ו למטה-קדימה' הם משלימים.

זוג פריימר רצף (5' ל 3') במידה הצפוי (bp)
2-שלב ה-PCR להפרעה gtfC
PCR 1
למעלה-קדימה
היפוך למעלה		 AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC
CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA		 1,036
spcr-קדימה
spcr-הפוך		 ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT
CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT		 1,188
למטה-קדימה
היפוך למטה		 AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG
TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC		 1,059
PCR 2
N_up-קדימה
N_down-הפוך		 TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC
GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG		 3,132
אימות של הפרעה gtfC
המושבה PCR להקרנה
זהspcr-קדימה
זהspcr-הפוך		 535
האימות הסופי
gtfC up-קדימה
gtfC היפוך למעלה		 TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG
GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG		 498
gtfC למטה-קדימה
gtfC למטה-הפוך		 GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG
TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG		 557
gtfC up-קדימה
spcr2-הפוך		 המתואר לעיל
CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC		 641
spcr2-קדימה
gtfC למטה-הפוך		 GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG
המתואר לעיל		 623
מגיב ריכוז של פתרונות מניות נפח ריכוז סופי
Dna פולימראז premix 2 × 25 ΜL 1 ×
פריימר לפנים 5 מיקרומטר 2 ΜL 0.2 ΜM
פריימר הפוכה 5 מיקרומטר 2 ΜL 0.2 ΜM
תבנית ה-DNA משתנה משתנה משתנה * * * * * *
מים יונים - μL עד 50 -

בטבלה 2: PCR ריאגנטים. * עבורst 1 שלב PCR; 100 ng. * * עבור 2nd PCR; כל 30-50 ng של 1סנט שלב ה-PCR אמפליקון. המושבה PCR; תוספת ישירה של תאים חיידקיים לתערובת התגובה.

שלב מחזור טמפרטורה זמן מספר מחזורי
דנטורציה הראשונית 98 ° C 2 דקות 1
דנטורציה
חישול
סיומת		 98 ° C
55 ° C
72 ° C		 10 s
5 s
אמפליקון תלויים
(kbp min/1 1)		 35
סיומת הסופי 72 ° C אמפליקון תלויים
(kbp min/1 1)		 1

טבלה 3: PCR הגברה מחזורי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי, יש לתכנן את צבעי יסוד 1סנט PCR כדי להגביר כ 1 kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של אזור היעד הגנום. רצפי זמן איגוף כאלה נחוצים לשפר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית.

מסדרות תחל (היפוך למעלה, למטה-קדימה, spcr-קדימה, ו- spcr-הפוך) בפרוטוקול זה באופן אוטומטי נקבעו בהתבסס על האתר של התאגדות של הבונה שיבוש. כל פריימר כולל 15 בסיסים משלימים לסוף התבנית PCR 2nd -האזור 5'. אתר איגוד יותר מאפשר ייצור יעיל יותר של הבונה שיבוש. ההכללה של בסיסים משלימים לפחות 10-5' האזור של כל פריימר מומלץ9.

תחל מקוננים (N_up-קדימה ו- N_up-אחורי) שימשו 2nd PCR, יותר מאשר את תחל החיצוני (up-קדימה, למטה-הפוכה). השימוש תחל החיצוני ביותר עבור 2nd PCR הוא מועיל במקרים מסוימים; הגברה מוצלחת של הבונה הפרעה עבור Δ ס mutans gtfB הושגה באמצעות את תחל החיצוני (נתונים לא מוצג). עם זאת, השימוש תחל החיצוני ביותר עבור השלב ה-PCR 2nd לעתים קרובות תוצאות לא מספיקות הגברה PCR, כמוצג באיור3. השימוש תחל מקוננים נמצאה כדי לפתור את הבעיה הזו9. כאשר הבונה הפרעה לא משמעותי מוגבר אפילו באמצעות תחל את המקוננת, אולם, עיצוב מחדש צבעי יסוד המשמשים את ה-PCR 1 ייתכן שתידרש.

המושבה PCR מאפשר הקרנה נוחים של המתח שיבשו-ג'ין. ניתן להחיל primers של רצפים ידועים לדור של המתח שיבשו הגן באמצעות spcr. אלקטרופורציה שימש המבוא של הפרעה בונה לתוך ס mutans WT, כמו היעילות טרנספורמציה מושגת באמצעות אלקטרופורציה היא בדרך כלל גבוהה יותר זמינות לשגרות אחרות. השינוי באמצעות סוסים סרום, או סרום סוס עם מיומנות-מגרה פפטידים, מקובל סטרפטוקוקוס10,11,12. למרות מכשירים אלקטרופורציה נדרש, מעורב, כגון הכנה תא המוסמכת, ההליכים הם הרבה יותר פשוט מאשר אלה שיטות אלטרנטיביות10,11. בנוסף, מומלץ אלקטרופורציה נקודת המבט של רווחת בעלי חיים.

בפרוטוקול הנוכחי חל שיבוש גנטי מרובים, בהתאם מספר סמני ofantibiotic. כדי ליצור gtfBו- gtfC--שיבשו ס mutans זנים, לדוגמה, ה-DNA לבנות עבור gtfC-הפרעה שנבנה על ידי 2-צעד PCR עשוי להיהפך Δ mutans ס gtfB. מאחר gtfC ו- gtfB הם סמוכים, במקרה הזה, Δ ס mutans gtfC ו- S. mutans ΔgtfB הגנום חייב לשמש תבניות עבור 2-צעד PCR כדי לשמור על רצפים הומולוגיים עבור הומולוגיים רקומבינציה. למעשה, כפול שיבשו ג'ין ס' mutans זן נבנה בעבר על ידי פרוטוקול זה9.

בפרוטוקול הנוכחי עבור ג'ין להפרעה ס mutans שעשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים. פרוטוקול זה אינו דורש השלב שיבוט גנים המעורבים פרוטוקולים קונבנציונלי. בנוסף, PCR היא התגובה היחידה הנדרשת אנזימטי; לכן, פלסמיד וקטורים, Escherichia coli, ליגאז, אנזימי הגבלה אינם הכרחיים. יתר על כן, הפרוטוקול הנוכחי מציע גמישות רבה יותר מבחינת עיצוב של הבונה שיבושים, העיצוב לבנות הוא עצמאי אנזים הגבלה האתרים של הגן היעד. חוקרים עשוי לקבוע אזורים נמחקים או המשומרים הגנום לעצב ומהצמיגים הפוך עבור הגברה של האזורים איגוף במעלה הזרם, ומהצמיגים קדימה עבור הגברה של האזורים איגוף במורד הזרם. איגוף אזורים אלה באופן מיידי נגד הזרם, מיד במורד הזרם של אזור ה-DNA הרצוי למחיקה, בהתאמה. גמישות כזו עשוי לשמש כדי להקטין השפעות חיצוניות, כגון אפקטים קוטבי, על הביטוי של גנים המוערכת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן הקידום של המדע [מספרים גרנט 16 K 15860 אל ט. מ ו- 15 K 15777 כדי N.H.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptococus mutans Stock strain in the lab. Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit Zymo Research D6005
Bead-beating disruption apparatus Taitec GM-01
Synthetic genes Eurofins Genomics Custom-ordered Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler Astec PC-708
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered 35 bases in length
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800
Electroporator Bio-rad 1652100
Electroporation cuvette Bio-rad 1652086 0.2-cm gap
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture media
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics
Erythromycin Wako 057-07151 Antibiotics
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  3. Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
  4. Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
  5. Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
  9. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
  10. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
  11. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  12. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).

Tags

גנטיקה גיליון 128 שיבוש גנטי מבנה ה-DNA תגובת שרשרת פולימראזית עיצוב פריימר עמידות לאנטיביוטיקה סמן גנטי סטרפטוקוקוס mutans אלקטרופורציה רקומבינציה הומולוגית
מהדור ג'ין-שיבשו <em>סטרפטוקוקוס mutans</em> זן בלי ג'ין שיבוט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murata, T., Okada, A., Matin, K.,… More

Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning. J. Vis. Exp. (128), e56319, doi:10.3791/56319 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter