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Genetics

जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56319

Summary

हम जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans उपभेदों की पीढ़ी के लिए एक सतही, तेजी से, और अपेक्षाकृत सस्ती विधि का वर्णन; इस तकनीक के जीन की पीढ़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-विभिंन प्रजातियों के उपभेदों बाधित ।

Abstract

एक विशेष जीन के समारोह के elucidation के लिए विशिष्ट तरीकों जंगली प्रकार के तनाव और एक तनाव जिसमें ब्याज की जीन बाधित किया गया है की तुलनात्मक phenotypic विश्लेषण शामिल है । एक जीन व्यवधान डीएनए एक उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन युक्त का निर्माण जीन की पीढ़ी के लिए उपयोगी है बैक्टीरिया में रुकावट उपभेदों । हालांकि, पारंपरिक निर्माण विधियों, जो जीन क्लोनिंग कदम की आवश्यकता होती है, जटिल और समय लेने वाली प्रोटोकॉल शामिल है । यहां, स्ट्रेप्टोकोकस mutans में लक्षित जीन व्यवधान के लिए अपेक्षाकृत सतही, तीव्र, और लागत प्रभावी पद्धति का वर्णन किया गया है । विधि एक 2-कदम फ्यूजन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के विघटन का निर्माण और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए electroporation उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल करता है । इस विधि एक एंजाइमी प्रतिक्रिया, पीसीआर के अलावा अंय की आवश्यकता नहीं है, और इसके अतिरिक्त व्यवधान निर्माण के डिजाइन के मामले में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करता है । electroporation के रोजगार सक्षम कोशिकाओं की तैयारी की सुविधा और परिवर्तन दक्षता में सुधार । वर्तमान विधि जीन की पीढ़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-विभिंन प्रजातियों के उपभेदों बाधित ।

Introduction

जीन समारोह विश्लेषण आमतौर पर एक जंगली प्रकार के तनाव और एक तनाव जिसमें ब्याज की एक विशेष जीन बाधित किया गया है के बीच एक phenotypic तुलना शामिल है । इस जीन विघटन तकनीक taxa की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन समारोह विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया है, बैक्टीरिया से स्तनधारियों के लिए. एक जीन विघटन निर्माण जीन बाधित तनाव की पीढ़ी के लिए आवश्यक है; इस deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) के निर्माण एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर के शामिल जीन ऊपर और बहाव लक्ष्य जीन के पार्श्व क्षेत्रों से जुड़े हुए हैं, और मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम जीनोम में शामिल है । जीन बाधित तनाव चयनात्मक एंटीबायोटिक युक्त मीडिया का उपयोग कर अलग किया जा सकता है । परंपरागत जीन बाधित तनाव के निर्माण के लिए इस्तेमाल विधि जटिल कदम है, जैसे लक्ष्य जीन के प्रवर्धन के रूप में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), एक उपयुक्त प्लाज्मिड में जीन की बंधाव, प्रतिबंध के साथ पाचन की आवश्यकता है एंजाइमों, और रेलीगेशन एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन डालने के लिए । इस प्रक्रिया में समय लेने वाली है, कई हफ्तों के लिए कई दिनों ले, हर कदम की सफलता पर निर्भर करता है । इसके अलावा, व्यवधान निर्माण के डिजाइन लक्ष्य जीन की प्रतिबंध एंजाइम साइटों पर निर्भर है । इन मुद्दों को हल करने के लिए, पीसीआर आधारित डीएनए ब्याह तरीकों1,जीन के डिजाइन के लिए2 -बाधित म्यूटेंट के Dictyostelium discoideum3 और Synechocystis sp. PCC68034 बताया गया है । वर्तमान अध्ययन में, एक विधि एक अपेक्षाकृत तेजी से, सतही, और सस्ती तरीके से एक जीन बाधित स्त्रेप्तोकोच्कल तनाव उत्पंन विकसित किया गया था, एक संशोधित पीसीआर आधारित विधि का उपयोग (2-कदम फ्यूजन पीसीआर नामित) व्यवधान के निर्माण के लिए निर्माण और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए electroporation ।

2-कदम फ्यूजन पीसीआर जीनोमिक डीएनए की आवश्यकता है, एक पीसीआर टेम्पलेट के रूप में एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन, और उचित रूप से डिजाइन oligonucleotide प्राइमरों के चार जोड़े । पहले चरण में (1सेंट पीसीआर), लक्ष्य जीन की एक 1 केबी नदी के ऊपर की दिशा क्षेत्र, लक्ष्य जीन के एक 1 kb बहाव पार्श्व क्षेत्र, और एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन पीसीआर द्वारा परिलक्षित होते हैं । दोनों रिवर्स प्राइमर के ' 5 क्षेत्रों और आगे प्राइमर, नदी के ऊपर और नीचे की ओर के प्रवर्धन के लिए क्षेत्र पार्श्व, क्रमशः, 15 मार्कर जीन के सिरों के पूरक कुर्सियां शामिल हैं । मार्कर जीन प्रवर्धन के लिए दोनों आगे और रिवर्स प्राइमरों के ' 5 क्षेत्रों इसी तरह 15 कुर्सियां लक्ष्य जीन की नदी के ऊपर पार्श्व क्षेत्र के निचले छोर से पूरक और लक्ष्य जीन के नीचे की ओर पार्श्व क्षेत्र के ऊपरी छोर शामिल हैं, क्रमश. इसलिए, तीन प्रवर्धित अंशों में अधिव्याप्त 30-आधार युग्म क्षेत्र फ़्यूज़न साइट पर होते हैं । दूसरे चरण में (2एन डी पीसीआर), पीसीआर तीन टेंपलेट्स के रूप में 1सेंट पीसीआर द्वारा परिलक्षित तीनों टुकड़ों का उपयोग कर नेस्टेड पीसीआर प्राइमरों के साथ किया जाता है । टेंपलेट्स के पूरक क्षेत्र इसके अतिरिक्त 2एनडी पीसीआर के जरिए एक दूसरे से जुड़े हुए हैं । अंत में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए निर्माण electroporation द्वारा जंगली प्रकार के तनाव के लिए शुरू की है । सफल जीन व्यवधान पीसीआर द्वारा सत्यापित किया जा सकता है विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग । हालांकि विघटन निर्माण उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर प्रवर्धित है, डीएनए बंधाव या डीएनए पाचन के रूप में अतिरिक्त एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, निर्माण उत्पन्न करने के लिए आवश्यक नहीं हैं. इसके अलावा, जीनोम पर एक हटाया या संरक्षित क्षेत्र प्राइमर डिजाइन के अनुसार चुना flexibly हो सकता है ।

वर्तमान काम में, gtfC जीन है, जो स्ट्रेप्टोकोकस mutansमें glucosyltransferase encodes के पूरे कोडिंग क्षेत्र के विलोपन, एक स्त्रेप्तोकोच्कल प्रजातियों में तेजी से, आसान जीन व्यवधान विधि का प्रदर्शन किया गया । साथ ही, एक gtfB-बाधित तनाव एक ही तरीके से उत्पंन किया गया था । glucosyltransferases दोनों gtfC और gtfB द्वारा इनकोडिंग cariogenic दंत फिल्म विकास5,6में योगदान करते हैं । जंगली-प्रकार के तनाव (एस की क्षमता बनाने वाली फिल्म। mutans WT), gtfC-बाधित तनाव (S. mutans ΔgtfC), और gtfB-बाधित तनाव (S. mutans ΔgtfB) का मूल्यांकन किया गया त्यात तुलनात्मक phenotypic िरा. इस प्रोटोकॉल एक अतिरिक्त प्रजातियों के लिए जीन व्यवधान के लिए एक दो कदम विधि के आवेदन प्रदान करता है और taxa की एक व्यापक रेंज में जीन समारोह के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. प्राइमरी डिजाइन

  1. 2-step फ्यूजन पीसीआर और जीन व्यवधान के सत्यापन के लिए प्राइमरों को तैयार करें ।
    नोट: तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया प्राइमर दृश्यों से पता चलता है. < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 2-कदम फ्यूजन पीसीआर विधि का एक योजनाबद्ध चित्रण से पता चलता है उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया S. mutans & #916; gtfC .
    1. डिजाइन प्राइमर spectinomycin-प्रतिरोध जीन के साथ जीनोम में लक्ष्य क्षेत्र के प्रतिस्थापन के लिए ( spc आर ) < सुप वर्ग = "xref" > ७ . इस प्रोटोकॉल gtfC जीन spc आर .
    2. के साथ की पूरी कोडिंग क्षेत्र की जगह
    3. में spc r के 5 & #39 के ऊपरी और निचले छोर के पूरक 15 कुर्सियां शामिल हैं; अप-रिवर्स और डाउन-फॉरवर्ड प्राइमरों के क्षेत्रों क्रमशः । इसी प्रकार, gtfC के ऊपर की ओर के निचले छोर के पूरक 15 कुर्सियां शामिल है और gtfC के बहाव वाले क्षेत्रों के ऊपरी छोर पर 5 & #39; क्षेत्रों के spc आर -फॉरवर्ड और spc आर -रिवर्स प्राइमर्स, क्रमशः (< मजबूत वर्ग = "xfig" > फिगर 1a ).
      नोट: अप की जुगाड़-रिवर्स, डाउन-फॉरवर्ड, spc आर -फॉरवर्ड, और spc आर -रिवर्स प्राइमर स्वचालित रूप से विघटन का निर्माण के शामिल की साइट के आधार पर निर्धारित कर रहे हैं.
    4. डिजाइन अप-फॉरवर्ड और डाउन रिवर्स प्राइमरों को शामिल & #62; 1-केबी नदी के ऊपर और नीचे की ओर gtfC जीन, क्रमशः के पार्श्व क्षेत्रों । अप-रिवर्स और डाउन-फॉरवर्ड प्राइमरों के पिघलने के तापमान के अनुसार ऊपर-आगे और नीचे रिवर्स प्राइमरों के पिघलने तापमान ( T m ) सेट करें, क्रमशः (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
      नोट: यह निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र का संदर्भ लें t m : t m (& #176; ग) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* नेकां + * एनजी)-5, जहां * N निर्दिष्ट पहचान के साथ प्राइमरी न्यूक्लियोटाइड की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है (ए, टी, सी, या जी) ।
    5. डिजाइन नेस्टेड प्राइमरों (N_up-आगे और N_up-रिवर्स) के लिए 2 एन डी पीसीआर (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ).
      नोट: हालांकि बाहरी प्राइमर जोड़ी (ऊपर-आगे और नीचे रिवर्स) 2 एन डी पीसीआर के लिए प्राइमर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, नेस्टेड प्राइमरों (N_up-आगे और N_up-रिवर्स) इस प्रोटोकॉल में डिजाइन किए गए थे । नेस्टेड प्राइमरों अक्सर 2 एन डी पीसीआर के लिए आवश्यक हैं, के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में विस्तृत .
    6. डिजाइन प्राइमर spc आर के लिए विशिष्ट । प्राइमरों के लिए उपयोग किया जाता है कॉलोनी पीसीआर gtfC व्यवधान के लिए स्क्रीन करने के लिए ।
    7. gtfC व्यवधान के सत्यापन के लिए डिजाइन प्राइमर.
      नोट: पीसीआर इन प्राइमरों का उपयोग प्रवर्धित उत्पादों gtfC या spc आर और नदी के नीचे या बहाव gtfC के पार्श्व क्षेत्रों के बीच सीमा झीनी । प्राइमरी सेट्स & #39; gtfC अप-फॉरवर्ड और gtfC अप-रिवर्स & #39; व & #39; gtfC डाऊन-फॉरवर्ड आणि gtfC डाऊन-रिवर्स & #39; gtfC के लिए विशिष्ट हैं, और & #39; gtfC अप-फॉरवर्ड और spc r 2 -उलट & #39; र & #39; spc r 2-आश व gtfC डाऊन-रिवर्स & #39; spc r .
    8. के लिए विशिष्ट हैं
< p class = "jove_title" > 2. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण से s. mutans

  1. लकीर स्टॉक s. मुतन s UA159 पर एक ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) आगर प्लेट. ३७ पर रात भर थाली मशीन & #176; C under anaerobic conditions.
  2. एक निष्फल दंर्तखोदनी का उपयोग कर एक कॉलोनी उठाओ और यह BHI शोरबा के 5 मिलीलीटर में लगाना । मुतन s संस्कृति रात भर में ३७ & #176; C अंतर्गत anaerobic अटी.
  3. 15 मिनट के लिए बैक्टीरियल सेल संस्कृति केंद्रापसारक २,००० & #215; जी. फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 5 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  4. २,००० & #215 पर 15 मिनट के लिए
  5. केंद्रापसारक; जी ने सेल की गोली को फिर से सस्पेंड कर २०० & #181; पंजाब के एल.
  6. निकालने जीनोमिक डीएनए के निलंबन से एक मनका-पिटाई-आधार जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार ।
    1. एक २.०-एमएल नमूना ग्लास मोती युक्त ट्यूब (किट में शामिल) के लिए निलंबन स्थानांतरण । जोड़ ७५० & #181; lysis समाधान (किट में शामिल) के एल सेल निलंबन के लिए ।
    2. कैप कसकर और नलियों की ट्यूब धारक में सममित-धड़कन व्यवधान उपकरण जगह । 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर प्रक्रिया । मनका-1 मिनट के लिए १०,००० & #215 में नमूनों को पीटा; g. supernatant स्पिन फ़िल्टर करने के लिए स्थानांतरण (किट में शामिल) में एक २.०-एमएल संग्रह ट्यूब और 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ७,००० & #215; छ .
    3. Add १,२०० & #181; डीएनए बाइंडिंग बफ़र (किट में शामिल) की छानने के लिए एल । स्थानान्तरण ८०० & #181; मिश्रण के स्पिन स्तंभ के लिए एल (किट में शामिल) के लिए एक २.०-एमएल संग्रह ट्यूब और 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर १०,००० & #215; g.
    4. प्रवाह-थ्रू, जोड़ें २०० & #181; पूर्व के एल-धोने बफर (किट में शामिल) के लिए स्पिन कॉलम स्तंभ मैट्रिक्स धोने के लिए, और १०,००० पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक & #215; जी छोड़ो प्रवाह के माध्यम से, जोड़ें ५०० & #181; धो बफर के एल (किट में शामिल) के लिए स्पिन स्तंभ मैट्रिक्स को धोने के लिए, और १०,००० पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक & #215; g.
    5. स्पिन कॉलम को एक नए १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह और १०० & #181; एल रेफरेंस बफर (किट में शामिल) कॉलम मैट्रिक्स में जोड़ें ।
    6. 30 एस के लिए
    7. केंद्रापसारक पर १०,००० & #215; g को elute जीनोमिक डीएनए. २६० एनएम और २८० nmusing एक spectrophotometer पर अवशोषण को मापने के द्वारा डीएनए एकाग्रता और पवित्रता का अनुमान है और एक २६० / २८० अनुपात १.८ से अधिक है कि पुष्टि करें ।
< p class = "jove_title" > 3. पीसीआर प्रवर्धन

  1. प्रदर्शन 1 सेंट पीसीआर का उपयोग एस मुतन एस WT जीनोम और सिंथेटिक spc आर जीन के रूप में पीसीआर टेंपलेट्स (देखें तालिका 1 ) । gtfC जीन, gtfC जीन, और spc आर जीन का बहाव पार्श्व क्षेत्र के नदी के ऊपर की दिशा बढ़ाना ऊपर वर्णित प्राइमरों के तीन सेट का उपयोग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ), के अनुसार तालिका 2 और तालिका 3 .
    नोट: पीसीआर प्राइमर, रिएजेंट, और प्रवर्धन चक्र तालिका 1 , तालिका 2 , और तालिका 3 , क्रमशः में संक्षेप हैं ।
  2. एक 1% agarose जेल पर प्रत्येक पीसीआर उत्पाद Fractionate और एक जेल बैंड कटर का उपयोग कर इसी बैंड एक्साइज ।
  3. एक स्पिन कॉलम का उपयोग जैल से प्रत्येक प्रवर्धित डीएनए उत्पाद को शुद्ध-और सिलिका झिल्ली आधारित जेल निष्कर्षण किट.
    1. एक स्वच्छ microcentrifuge ट्यूब के लिए जेल स्लाइसें हस्तांतरण और ५०० & #181 के साथ मिश्रण, बाध्यकारी बफर के एल (किट में शामिल). ५५ & #176 पर मिश्रण मशीन, जेल स्लाइसें पूरी तरह से भंग कर रहे है जब तक 15 मिनट के लिए सी ।
    2. प्लेस स्पिन कॉलम (किट में शामिल) एक संग्रह ट्यूब में (किट में शामिल), स्पिन कॉलम पर नमूना लोड, और ११,००० & #215 पर 30 एस के लिए केंद्रापसारक; g । प्रवाह के माध्यम से त्यागें, जोड़ें ६०० & #181; धोने बफर के एल (किट में शामिल) के लिए स्पिन स्तंभ के लिए सिलिका झिल्ली धोने, और 30 एस के लिए केंद्रापसारक पर ११,००० & #215; g .
    3. के माध्यम से प्रवाह को त्यागें और ११,००० & #215 पर 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक; जी सिलिकान झिल्ली को सुखाने के लिए.
    4. एक नया १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में स्पिन कॉलम प्लेस, ५० & #181 जोड़ें; एल रेफरेंस बफर (किट में शामिल), और 2 min.
    5. के लिए कमरे के तापमान पर मशीन 2 मिनट के लिए
    6. केंद्रापसारक पर ११,००० & #215; g प्रवर्धित डीएनए elute. २६० एनएम और २८० nmusing एक spectrophotometer पर अवशोषण को मापने के द्वारा डीएनए एकाग्रता और पवित्रता का अनुमान है और एक २६० / २८० अनुपात १.८ से अधिक है कि पुष्टि करें ।
  4. 2-चरण फ्यूजन पीसीआर के 2 एन डी पीसीआर का प्रदर्शन पीसीआर टेम्पलेट्स के रूप में तीन लगभग equimolar टुकड़े का उपयोग, तालिका 2 के अनुसार व टेबल 3 .
    नोट: इन टुकड़ों को परिलक्षित किया गया और नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग कर ब्याह & #39; N_up-आगे और N_down-रिवर्स & #39; या द बाहरी प्राइमर्स & #39; अप-फॉरवर्ड और डाउन-रिवर्स & #39; (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b
    ). पीसीआर प्राइमर, रिएजेंट, और प्रवर्धन चक्र तालिका 1 , तालिका 2 , और तालिका 3 , क्रमशः में संक्षेप हैं ।
  5. लोड एक-दसवां पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर (5 & #181; L) एक ०.८% agarose जेल पर और उपयुक्त amplicon की पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए अपेक्षित बैंड आकार के साथ प्रवर्धित बैंड आकार की तुलना करें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
  6. शुद्धि के बिना इथेनॉल वर्षा द्वारा शेष अंतिम पीसीआर उत्पाद ध्यान केंद्रित ।
    1. Add ५५ & #181; L अति शुद्ध जल के शेष पीसीआर मिश्रण को १०० & #181 को कुल मात्रा समायोजित करने के लिए; L. 3 एम सोडियम एसीटेट (10 & #181; l) के एक-एक दसवें खंड को जोड़ें, पीएच ५.२, १००% इथेनॉल (२५० & #181; l) के २.५ संस्करणों के बाद । मिश्रण और 30 मिनट के लिए फ्रीज पर-८० & #176; ग.
    2. १५,००० पर 20 मिनट के लिए
    3. केंद्रापसारक & #215; g पर 4 & #176; C, ट्यूब के तल पर गोली के लिए जाँच करें, और supernatant त्यागें. ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धोने, १५,००० पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक & #215; g पर 4 & #176; C, और supernatant को त्यागें । हवा-लगभग 30 मिनट के लिए गोली सूखी और 10 & #181 के साथ भंग अल्ट्रा शुद्ध पानी की; एल
< p class = "jove_title" > 4. सक्षम सेल तैयारी और सेल परिवर्तन

  1. लकीर स्टॉक s. मुतन s UA159 एक BHI आगर प्लेट पर । ३७ पर रात भर थाली मशीन & #176; C under anaerobic conditions.
  2. एक निष्फल दंर्तखोदनी का उपयोग कर एक कॉलोनी उठाओ और यह BHI शोरबा के 5 मिलीलीटर में लगाना । मुतन s संस्कृति रात भर में ३७ & #176; C अंतर्गत anaerobic अटी.
  3. एस मुतन संस्कृति के 2 मिलीलीटर के लिए ५० एमएल के लिए BHI शोरबा और मशीन के 6-8 एच में ३७ & #176; सी के लिए ६०० एनएम (आयुध डिपो ६०० ) पर एक ऑप्टिकल घनत्व 0.2-0.4 के तहत anaerobic शर्तों के ।
  4. २,००० पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक & #215; g पर 4 & #176; ग, supernatant को त्यागें, और कोशिकाओं को दो बार बर्फ-ठंडा पानी के ४० मिलीलीटर के साथ धो 10% ग्लिसरॉल के ४० मिलीलीटर के बाद ।
    नोट: अवशिष्ट पदार्थ बाद electroporation.
  5. को प्रभावित
  6. महाप्राण एक पाश्चर पिपेट के साथ supernatant सावधानी के रूप में सेल गोली के पालन के रूप में 10% ग्लिसरॉल कम है । ताजा 10% ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड, वितरण ५० & #181; प्रत्येक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में निलंबन के एल, और स्टोर पर-८० & #176; C बस उपयोग करने से पहले तक.
  7. मिश्रण के ५० & #181; l aliquot के साथ आइस-कोल्ड सक्षम कोशिकाओं के 5 & #181; खंड 3 में ऊपर वर्णित विघटन के निर्माण के एल. electroporation cuvettes (इलेक्ट्रोड के बीच एक ०.२ सेमी दूरी के साथ) के मिश्रण जोड़ें । रोजगार Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुस मोड (१.८ केवी, ६०० & #937;, 10 & #181; फ, 1 पल्स) electroporation उपकरण के electroporate.
  8. को सस्पेंड ५०० & #181; electroporation के तुरंत बाद BHI शोरबा के एल और ५० & #181 के लिए निलंबन के l spectinomycin-से युक्त bhi-आगर प्लेटों को जोड़ने के लिए.
    नोट: अतिरिक्त मशीन समय electroporation के बाद की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, electroporation के बाद 1-2 ज के लिए मशीन परिवर्तन दक्षता में सुधार हो सकता है ।
  9. 2-6 दिनों के लिए थाली मशीन पर ३७ & #176; ग अंतर्गत anaerobic अटी.
    नोट: S. mutans & #916; gtfB ऊपर बताए अनुसार निर्माण किया है । gtfB जीन के पूरे कोडन क्षेत्र इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध जीन के साथ बदल दिया है < सुप वर्ग = "xref" > 8 in S. mutans & #916; gtfB. प्रत्येक एस mutans तनाव ३७ & #176 पर BHI शोरबा में संस्कृति है, anaerobic शर्तों के तहत सी ।
< p class = "jove_title" > 5. जीन व्यवधान और भंडारण के सत्यापन

  1. यादृच्छिक कालोनियों उठाओ और उन्हें पीसीआर मिश्रण में लगाना तालिका 2 और तालिका 3 के अनुसार कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए । पीसीआर प्राइमर, रिएजेंट, और प्रवर्धन चक्र तालिका 1 , तालिका 2 , और तालिका 3 , क्रमशः में संक्षेप हैं ।
  2. spc r -विशिष्ट डीएनए बैंड की पुष्टि करने के लिए एक 1% agarose जेल पर पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर लोड करें.
  3. ३७ पर 2 दिनों के लिए spectinomycin-युक्त BHI शोरबा के 10 मिलीलीटर में एक निष्फल दंर्तखोदनी और उपसंस्कृति कोशिकाओं का उपयोग कर सकारात्मक कॉलोनी उठाओ & #176; ग अंतर्गत anaerobic अटी.
  4. गर्दै उ पादन S. mutans & #916; gtfC.
    1. सेल सस्पेंशन को समान रूप से विभाजित करते हैं । ऊपर वर्णित कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालें (कदम २.३. to 2.5.5.) । पीसीआर टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए के साथ पीसीआर प्रदर्शन, gtfC व्यवधान के सत्यापन के लिए प्राइमर का उपयोग ( तालिका 1 ) के अनुसार तालिका 2 और तालिका 3 .
      नोट: पीसीआर प्राइमरों, रिएजेंट, और प्रवर्धन चक्र तालिका में संक्षेप हैं 1 , तालिका 2 , और तालिका 3 , क्रमशः.
    2. एक 2% agarose जेल पर पीसीआर मिश्रण लोड और अपेक्षित बैंड आकार के साथ प्रवर्धित बैंड आकार की तुलना करने के लिए उपयुक्त amplicon की पीढ़ी की पुष्टि करें ।
    3. 15 मिनट के लिए शेष सेल सस्पेंशन २,००० & #215; g 4 & #176; C. पंजाब के 5 एमएल में सेल गोली से सस्पेंड ।
    4. २,००० पर 15 मिनट के लिए
    5. केंद्रापसारक & #215; g at 4 & #176; c. सेल गोली को फिर से सस्पेंड करें १.५ में 25% ग्लिसरॉल और स्टोर में शामिल BHI शोरबा-८० & #176; ï-20 & #176; ग.
< p class = "jove_title" > 6. Phenotypic विश्लेषण

  1. लकीर प्रत्येक एस मुतन एस एक BHI आगर प्लेट पर तनाव । ३७ पर रात भर थाली मशीन & #176; C under anaerobic conditions.
  2. एक निष्फल दंर्तखोदनी का उपयोग कर एक कॉलोनी उठाओ और साथ या एक उचित एंटीबायोटिक के बिना BHI शोरबा के 2 मिलीलीटर में लगाना । ३७ पर रात भर मशीन & #176; ग अंतर्गत anaerobic अटी.
  3. लगाना 20 & #181; एक गिलास टेस्ट ट्यूब में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 1% या 5% सुक्रोज युक्त BHI शोरबा के 2 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति निलंबन के एल; संस्कृति एक झुका स्थिति में टेस्ट ट्यूब के साथ कोशिकाओं ३७ & #176; ग के तहत anaerobic शर्तों.
  4. भंवर 10 एस और खिचड़ी भाषा संस्कृति निलंबन के लिए ग्लास टेस्ट ट्यूब । परीक्षण ट्यूबों तीन बार आसुत पानी के साथ धो लो । जोड़ें ०.२५% Coomassie प्रतिभाशाली नीले (CBB) की 1 मिलीलीटर ट्यूब दीवार पर फिल्म दाग, और फिर 1 min.
  5. के लिए मशीन
  6. नहीं कर सकते धुंधला समाधान, परीक्षण ट्यूबों धो आसुत जल के साथ तीन बार, और परीक्षण ट्यूबों सूखी ।
  7. दोनों रंग घनत्व और CBB सना हुआ फिल्म के विस्तार नेत्रहीन का मूल्यांकन करने के लिए एक phenotypic विश्लेषण में फिल्म बनाने की क्षमता का निर्धारण ।

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Representative Results

चित्रा 2 पता चलता है कि 1सेंट पीसीआर से प्रत्येक उत्पाद का आकार, 1% agarose जेल पर मनाया के रूप में लगभग 1 केबी के अनुमानित आकार के साथ अच्छे समझौते में था । चित्रा 3 2एन डी पीसीआर के उत्पादों की जेल ट्रो विश्लेषण से पता चलता है । चित्रा 4 से पता चलता है एस mutans बाधा निर्माण के साथ तब्दील कालोनियों, और एक जेल कॉलोनी पीसीआर उत्पादों के ट्रो विश्लेषण । सभी कालोनियों से amplicons की भविष्यवाणी आकार के थे । चित्रा 5 पीसीआर उत्पादों की gtfC व्यवधान और जेल ट्रो के सत्यापन के लिए प्राइमरी बाइंडिंग साइटों से पता चलता है । पीसीआर उत्पादों gtfC-विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग कर प्रवर्धन द्वारा प्राप्त एस mutans WT में पुष्टि की गई, लेकिन एस mutans ΔgtfCमें नहीं है, जबकि पीसीआर उत्पादों spcआरविशिष्ट का उपयोग कर प्राप्त प्राइमरी सेट एस. mutans Δ gtfC में पुष्टि की गई, लेकिन एस. mutans WT में नहीं । चित्रा 6 सुक्रोज-एक एस mutans तनाव की-व्युत्पन्न फिल्म बनाने की क्षमता से पता चलता है. सुक्रोज की उपस्थिति में एस. mutans WT द्वारा एक अनुयाई फिल्म का गठन किया गया; एस mutans ΔgtfB की अनुयाई की क्षमता के गठन की है कि एस mutans WT. s mutans ΔgtfC की तुलना में कम था अनुयाई की उपस्थिति में बहुत कम सुक्रोज फिल्म के गठन का प्रदर्शन किया ।

Figure 1
चित्रा 1:2 के लिए रणनीति-कदम फ्यूजन पीसीआर । Sका एक योजनाबद्ध चित्रण । mutans ΔgtfC निर्माण दिखाया गया है । जीन लंबाई पैमाने पर करने के लिए नहीं कर रहे हैं । (क) नदी के ऊपर और नीचे की दिशा gtfC और spcआर loci के क्षेत्रों पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया । प्राइमर टेंपलेट में बाध्यकारी साइटों समान पैटर्न द्वारा संकेत दिया जाता है । (ख) दूसरी पीसीआर कदम का उपयोग किया गया (के रूप में टेंपलेट्स) 3 टुकड़े कि नेस्टेड प्राइमरों के साथ पहले पीसीआर कदम में परिलक्षित किया गया । (ग) विघटन निर्माण जीवाणु उपभेदों में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए प्राप्त किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि जेल 1सेंट पीसीआर से उत्पादों की ट्रो । gtfC और बहाव gtfC और spcआर के पार्श्व क्षेत्र के ऊपर पार्श्व क्षेत्र के Amplicons दिखाया जाता है । एम: आणविक मार्कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि जेल 2एन डी पीसीआर से उत्पादों की ट्रो । नेस्टेड प्राइमरों और बाहरी प्राइमरों के साथ परिवर्धित उत्पादों को दिखाया जाता है । ठोस तीर व्यवधान निर्माण का अनुमानित आकार इंगित करता है । एम: आणविक मार्कर ।

Figure 4
चित्र 4: कॉलोनी पीसीआर () द्वारा gtfC व्यवधान के लिए स्क्रीनिंग एस. mutans कालोनियों पर spectinomycin-युक्त BHI-आगर प्लेट; प्रत्येक सर्किल नंबर कॉलोनी आईडी इंगित करता है । (ख) प्रतिनिधि जेल कॉलोनी पीसीआर उत्पादों की ट्रो; प्रत्येक गोला लेन संख्या चित्रा 4aमें इसी कॉलोनी आईडी इंगित करता है. एम: आण्विक मार्कर, WT: वंय प्रकार जीनोमिक डीएनए टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पीसीआर द्वारा gtfC व्यवधान का सत्यापन । (क) प्राइमरी बाइंडिंग साइटें; जीन की लंबाई पैमाने पर नहीं है । पीसीआर एक टेम्पलेट के रूप में एस mutans जीनोमिक डीएनए का उपयोग किया गया था । प्राइमर सेट: gtfC अप-फॉरवर्ड और gtfC अप-रिवर्स ( gtfCके लिए विशिष्ट); gtfC डाउन-फॉरवर्ड और gtfC डाउन-रिवर्स ( gtfCके लिए विशिष्ट); gtfC अप-फॉरवर्ड और spcआर2-रिवर्स ( spcआर) के लिए विशिष्ट; spcआर2-आगे और gtfC डाउन-रिवर्स ( spcआरके लिए विशिष्ट) । (ख) पीसीआर उत्पादों के प्रतिनिधि जेल ट्रो; प्रत्येक वृत्तीय लेन संख्या चित्रा 5 एमें सेट संगत प्राइमर इंगित करता है । एक एकल electrophoretic छवि मार्कर बैंड लेबल करने के लिए विभाजित है । एम: आण्विक मार्कर (१००-आधार जोड़ी सीढ़ी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Phenotypic विश्लेषण पर आधारित फिल्म विकास । सुक्रोज-व्युत्पंन एक एस mutans तनाव द्वारा गठित की गई फिल्म Coomassie शानदार नीले रंग के साथ दाग थे । WT: s. mutans WT, ΔgtfB: s. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG
CAGCCACTGCATTTCCCGCAATATCTTTTGGTATG

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त प्राइमर. ' अप-रिवर्स और spcआर-फॉरवर्ड ' और 'spcआर-रिवर्स और डाउन-फॉरवर्ड ' का रेखांकित जुगाड़ पूरक है । ' अप-रिवर्स और spcआर-फॉरवर्ड ' और 'spcआर-आर और डाउन-फॉरवर्ड ' के बोल्ड टाइप अनुक्रम पूरक हैं ।

प्राइमरी जोड़ी अनुक्रम (5 ' से 3 ') अपेक्षित बैंड आकार (bp)
2- gtfC व्यवधान के लिए पीसीआर कदम
1 पीसीआर
अप-फॉरवर्ड
अप-रिवर्स
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC
CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA
१,०३६
spcr-अग्रेषित
spcआर-रिवर्स
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT
CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT
१,१८८
डाउन-फॉरवर्ड
डाउन-रिवर्स
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG
TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC
१,०५९
2 पीसीआर
N_up-फॉरवर्ड
N_down-रिवर्स
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC
GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG
३,१३२
gtfC का सत्यापन बाधित
स्क्रीनिंग के लिए कॉलोनी पीसीआर
S_spcआर-फॉरवर्ड
S_spcआर-रिवर्स
५३५
अंतिम सत्यापन
gtfC अप-फॉरवर्ड
gtfC अप-रिवर्स
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG
GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG
४९८
gtfC डाउन-फॉरवर्ड
gtfC डाउन-रिवर्स
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG
TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG
५५७
gtfC अप-फॉरवर्ड
spcआर2-रिवर्स
ऊपर वर्णित
CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC
६४१
spcआर2-फॉरवर्ड
gtfC डाउन-रिवर्स
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG
ऊपर वर्णित
६२३
अभिकर्मक स्टॉक समाधान की एकाग्रता वॉल्यूम अंतिम एकाग्रता
डीएनए पोलीमरेज़ premix 2 × 25 μL 1 ×
फॉरवर्ड प्राइमर ५ µ मी 2 μL ०.२ µ m
रिवर्स प्राइमर ५ µ मी 2 μL ०.२ µ m
टेंपलेट डीएनए चर चर चर * * * * * *
जल - ५० μL तक -

तालिका 2: पीसीआर रिएजेंट । * 1st चरण पीसीआर के लिए; १०० एनजी । 2एन डी पीसीआर के लिए * *; प्रत्येक 30-50 1st कदम पीसीआर amplicon के एनजी । कॉलोनी पीसीआर के लिए; प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इसके अलावा ।

सायकल स्टेप तापमान समय चक्रों की संख्या
प्रारंभिक विकार ९८ ° c 2 min 1
विकार
एनीलिंग
एक्सटेंशन
९८ ° c
५५ ° c
७२ ° c
10 एस
5 एस
Amplicon आश्रित
(1 min/1 kbp)
३५
अंतिम विस्तार ७२ ° c Amplicon आश्रित
(1 min/1 kbp)
1

तालिका 3: पीसीआर प्रवर्धन चक्र ।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में, 1st पीसीआर के लिए प्राइमरों लगभग 1 केबी नदी के ऊपर और बहाव जीनोम में लक्ष्य क्षेत्र के पार्श्व क्षेत्रों बढ़ाना डिजाइन किया जाना चाहिए । ऐसे लंबे पार्श्व अनुक्रम मुताबिक़ पुनर्संयोजन की क्षमता में सुधार करने के लिए आवश्यक हैं ।

प्राइमरों के जुगाड़ (अप-रिवर्स, डाउन-फॉरवर्ड, spcआर-फॉरवर्ड, और spcआररिवर्स) इस प्रोटोकॉल में स्वचालित रूप से व्यवधान का निर्माण के शामिल की साइट के आधार पर निर्धारित किया गया । प्रत्येक प्राइमर 15 कुर्सियां 5 ' क्षेत्र में 2एन डी पीसीआर टेम्पलेट के अंत के लिए पूरक शामिल हैं । एक लंबे समय तक बाध्यकारी साइट व्यवधान निर्माण के अधिक कुशल उत्पादन में सक्षम बनाता है । प्रत्येक प्राइमरी के ' 5 ' क्षेत्र में ंयूनतम 10 पूरक आधारों को शामिल करना9की सिफारिश की है ।

नेस्टेड प्राइमरों (N_up-आगे और N_up-रिवर्स) 2एन डी पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया, बजाय बाहरी प्राइमरों (ऊपर-आगे और नीचे रिवर्स) थे । 2nd पीसीआर के लिए बाहरी प्राइमरों का इस्तेमाल कुछ मामलों में फायदेमंद है; एस mutans ΔgtfB के लिए विघटन के निर्माण के सफल प्रवर्धन बाहरी प्राइमरों का उपयोग कर प्राप्त किया गया था (नहीं दिखाया गया डेटा). हालांकि, 2एन डी पीसीआर कदम के लिए बाहरी प्राइमरों का उपयोग अक्सर अपर्याप्त पीसीआर प्रवर्धन में परिणाम, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग इस समस्या को हल करने के लिए पाया गया9. जब विघटन का निर्माण काफी भी नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग कर परिलक्षित नहीं है, तथापि, 1 पीसीआर में इस्तेमाल प्राइमरों के स्वरूप की आवश्यकता हो सकती है ।

कॉलोनी पीसीआर जीन बाधित तनाव की सुविधाजनक स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है । ज्ञात दृश्यों के प्राइमरों जीन बाधित तनाव की पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है spcआरका उपयोग कर । Electroporation बाधा निर्माण की शुरूआत के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में mutans WT, में परिवर्तन दक्षता Electroporation का उपयोग कर प्राप्त आम तौर पर है कि अंय प्रक्रियाओं द्वारा सक्षम से अधिक है । क्षमता-उत्तेजक पेप्टाइड्स के साथ हार्स सीरम, या हार्स सीरम का उपयोग रूपांतरण, व्यापक रूप से स्ट्रेप्टोकोकस10,11,12में स्वीकार किया जाता है । हालांकि एक electroporation तंत्र की आवश्यकता है, इस तरह सक्षम सेल तैयारी के रूप में शामिल प्रक्रियाओं,10,11वैकल्पिक तरीकों में उन लोगों की तुलना में बहुत सरल हैं । इसके अलावा, electroporation पशु कल्याण के दृष्टिकोण से सिफारिश की है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल कई जीन व्यवधान के लिए लागू है, संख्या ofantibiotic मार्करों पर निर्भर करता है । gtfC-और gtfB-बाधित एस mutans उपभेदों दोनों उत्पंन करने के लिए, उदाहरण के लिए, डीएनए gtfC-2-चरणीय पीसीआर द्वारा निर्मित व्यवधान के लिए निर्माण एस mutans Δ gtfB में तब्दील किया जा सकता है क्योंकि gtfC और gtfB इस मामले में सटी हैं, एस. mutans ΔgtfC और एस. mutans ΔgtfB जीनोम के लिए टेंपलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए 2-कदम पीसीआर मुताबिक़ के लिए मुताबिक़ दृश्यों को बनाए रखने के लिए पुनर्संयोजन. वास्तव में, डबल जीन बाधित एस mutans तनाव पहले इस प्रोटोकॉल9द्वारा निर्माण किया गया था ।

एस mutans में जीन व्यवधान के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल जीन के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-विभिंन प्रजातियों के उपभेदों बाधित । इस प्रोटोकॉल के पारंपरिक प्रोटोकॉल में शामिल जीन क्लोनिंग कदम की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, पीसीआर केवल आवश्यक एंजाइमी प्रतिक्रिया है; इसलिए, प्लाज्मिड वैक्टर, ई कोलाई, ligase, और प्रतिबंध एंजाइमों आवश्यक नहीं हैं । इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल व्यवधान निर्माण के डिजाइन के मामले में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करता है, के रूप में निर्माण डिजाइन प्रतिबंध लक्ष्य जीन के एंजाइम साइटों के स्वतंत्र है । शोधकर्ताओं क्षेत्रों है कि नष्ट कर दिया या जीनोम में संरक्षित कर रहे है ऊपर पार्श्व क्षेत्रों के प्रवर्धन के लिए रिवर्स प्राइमर डिजाइन और बहाव पार्श्व क्षेत्रों के प्रवर्धन के लिए आगे प्राइमर निर्धारित कर सकते हैं । इन पार्श्व क्षेत्रों तुरंत नदी के ऊपर है और तुरंत हटाने के लिए वांछित डीएनए के क्षेत्र के बहाव, क्रमशः । इस तरह के लचीलेपन सीमेट जीन की अभिव्यक्ति पर, ध्रुवीय प्रभाव के रूप में बाहरी प्रभावों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान के संवर्धन के लिए समर्थन किया गया था [अनुदान संख्या 16K15860 करने के लिए T.M. और 15K15777 करने के लिए राष्ट्रीय].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptococus mutans Stock strain in the lab. Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit Zymo Research D6005
Bead-beating disruption apparatus Taitec GM-01
Synthetic genes Eurofins Genomics Custom-ordered Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler Astec PC-708
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered 35 bases in length
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800
Electroporator Bio-rad 1652100
Electroporation cuvette Bio-rad 1652086 0.2-cm gap
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture media
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics
Erythromycin Wako 057-07151 Antibiotics
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining

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References

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  2. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
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  8. Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
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जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित <em>स्ट्रेप्टोकोकस mutans</em> तनाव की पीढ़ी
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Murata, T., Okada, A., Matin, K.,More

Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning. J. Vis. Exp. (128), e56319, doi:10.3791/56319 (2017).

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