Summary
Мы описываем легким, быстрым и относительно недорогой метод для генерации ген нарушена Streptococcus mutans штаммов; Эта техника может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.
Abstract
Типичные методы для разяснения функции определенного гена включать сравнительный анализ фенотипических одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено гена интереса. Конструкцию ДНК гена нарушение, содержащие маркер подходит к антибиотикам ген полезен для поколения ген нарушена штаммов бактерий. Однако обычных строительных методов, которые требуют генов клонирования шаги, включать протоколы сложным и трудоемким. Здесь описан относительно легким, быстрое и эффективное метод срыв целевых генов в Streptococcus mutans . Этот метод использует слияние 2-х ступенчатый полимеразной цепной реакции (ПЦР) для создания разрушение конструкции и электропорации для генетической трансформации. Этот метод не требует ферментативные реакции, за исключением PCR и дополнительно предлагает большую гибкость с точки зрения дизайна разрушение конструкции. Занятость электропорации облегчает подготовку компетентных клеток и улучшает эффективность преобразования. Нынешний метод может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.
Introduction
Анализ функции гена обычно включает фенотипические сравнение между одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено определенного гена интереса. Этот ген нарушение техника была использована для анализа функции гена в широком диапазоне таксонов, от бактерий до млекопитающих. Ген нарушение конструкция необходима для поколения штамма ген нарушена; Эта конструкция дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) состоит из гена маркер антибиотикорезистентности, сливается в верхнем и нижнем течении, окаймляющие регионов целевого гена и включена в геноме через гомологичная рекомбинация. Джин нарушена деформации могут быть изолированы с помощью селективного носителей, содержащих антибиотик. Обычные метод, используемый для строительства ген нарушена штамм требует сложных шагов, таких как амплификация гена целевой полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигирование гена в подходящей плазмиду, пищеварение с ограничением ферменты и religation чтобы вставить маркер антибиотик сопротивление гена. Этот процесс является длительным, принимая несколько дней до нескольких недель, в зависимости от успеха каждого шага. Кроме того дизайн разрушение конструкции зависит энзима ограничения сайтов целевого гена. Для решения этих вопросов, были зарегистрированы на основе ПЦР ДНК сплайсинга методы1,2 для проектирования ген нарушена мутантов сапротрофные discoideum3 и Synechocystis sp. PCC68034 . В настоящем исследовании был разработан метод для создания Джин нарушена стрептококков штамм относительно быстрое, легким и недорогим способом, используя измененный метод на основе ПЦР (обозначено сплавливание 2-шаг ПЦР) для строительства нарушения Конструкция и электропорации для генетической трансформации.
2-шаг-фьюжн, PCR требует геномной ДНК, маркер генов антибиотикорезистентности как шаблон ПЦР и четыре пары надлежащим образом разработаны праймеры олигонуклеотида. На первом шаге (1st ПЦР), 1-КБ вверх по течению фланкируя региона целевого гена, 1-КБ течению фланкируя область целевого гена и Джин антибиотик сопротивление маркер усиливаются методом ПЦР. 5' регионов обратный грунт и вперед грунтовка для усиления вверх и вниз по течению фланговые регионов, соответственно, включают в себя 15 баз дополняет концы гена маркер. 5' регионов прямого и обратного Праймеры для амплификации генов маркер аналогичным образом включают 15 баз в дополнение к нижней части вверх по течению фланкируя региона целевого гена и верхний конец области течению фланкируя целевого гена, соответственно. Таким образом три усиливается фрагменты содержат перекрывающиеся области 30-пар на сайте фьюжн. На втором этапе (2nd ПЦР) ПЦР проводится с вложенными праймеры PCR, с использованием трех фрагментов, усиливается 1st PCR как шаблоны. Дополнительно взаимодополняющих регионах шаблоны связаны друг с другом через 2nd ПЦР. Наконец конструкции для гомологичная рекомбинация вводится одичал тип деформации электропорации. Успешное гена нарушения могут быть проверены с помощью конкретных праймеры PCR. Хотя нарушение конструкция усиливается с помощью высокоточных ДНК-полимеразы, дополнительные ферментативных реакций, таких как перешнуровка дна или ДНК пищеварение, не являются необходимыми для создания конструкции. Кроме того удаленные или консервированные региона на геном может гибко выбираться по конструкции праймера.
В настоящей работе удаление всего кодирвоания gtfC ген, который кодирует glucosyltransferase в Streptococcus mutans, была исполнена продемонстрировать метод срыв быстрое, легко гена в стрептококков видов. Кроме того, gtfB-нарушена штамм был создан в том же порядке. Glucosyltransferases, кодируются как gtfC , так и gtfB способствуют кариесогенных Стоматологическая биопленки развития5,6. Биопленки формирование способности одичал тип деформации (S. mutans WT), gtfC-нарушена штамм (S. mutans ΔgtfC) и gtfB-были оценены нарушается штамм (S. mutans ΔgtfB) для сравнительного анализа фенотипические. Этот протокол расширяет применение двухэтапный метод срыв гена для дополнительных видов и могут быть изменены для исследования функции гена в более широкий спектр таксонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. конструкции праймера
- подготовить грунтовки для 2-шаг fusion ПЦР и проверки нарушения ген.
Примечание: В таблице 1 показаны последовательностей праймера, используемые в настоящем Протоколе. Рисунок 1 показывает схематическое изображение метод ПЦР сплавливание 2-шаг, используемый для создания Streptococcus mutans Δ gtfC.- Дизайн праймеров для замены целевого региона в геноме с спектиномицин сопротивление гена (spc r) 7. Этот протокол заменяет весь регион кодирования gtfC гена с НПЦ р.
- Включают в себя 15 баз дополняет верхние и нижние концы spc r на 5 ' регионы вверх назад и вниз вперед грунтовки, соответственно. Аналогичным образом, включают 15 баз в дополнение к нижней части вверх по течению фланкируя регионов gtfC и верхний конец течению фланкируя регионов gtfC на 5 ' регионах НПЦ r-вперед и НПЦ r -обратный грунтовки, соответственно ( рис. 1A).
Примечание: Последовательности вверх назад, вниз вперед, spc r - вперед и spc r - обратный грунтовки автоматически определяются в зависимости от места инкорпорации разрушение конструкции. - Дизайн вверх вперед и вниз обратный праймеры составляют > 1-КБ, вверх и вниз по течению фланговых районах гена gtfC, соответственно. Установите температуру плавления (m T) вверх-вперед и вниз обратный грунтовки в соответствии с температурой плавления праймеров вверх назад и вниз вперед, соответственно ( рис. 1A).
Примечание: Обратитесь к следующей формуле для определения T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * нг) - 5, где * N представляет количество грунтовки нуклеотидов с указанным удостоверением (A, T, C или G). - Дизайн вложенные грунтовки (N_up вперед и N_up реверс) для 2-й ПЦР ( рис. 1B).
Примечание: Хотя внешняя грунтовка пара (вверх вперед и вниз обратный) могут использоваться в качестве грунтовки для 2 nd ПЦР, вложенные грунтовки (N_up вперед и N_up реверс) были разработаны в настоящем Протоколе. Вложенные Праймеры для 2 nd ПЦР, как подробно указано в Представитель результаты часто требуются. - Дизайн праймеров для НПФ r. Праймеры используются для колонии PCR экран для срыва gtfC. Нарушение
- Дизайн праймеров для проверки gtfC.
Примечание: Продукты PCR, усиленный, используя эти грунты стрэдл границы между gtfC или spc r и вверх или вниз по течению фланговые регионов gtfC. Грунтовка наборы ' gtfC вверх вперед и вверх реверс gtfC ' и ' gtfC вниз вперед и gtfC вниз обратный ' являются специфическими для gtfC, и ' gtfC вверх вперед и spc r 2 -Обратный ' и ' НПЦ r 2-вперед и gtfC вниз обратный ' являются специфическими для НПФ р.
2. Геномная ДНК извлечение из Streptococcus mutans
s UA159- полоска фондовой S. mutan на мозг сердца инфузии (BHI) агар пластину. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Подобрать единую колонию с использованием стерилизованные зубочистку и инокуляции в 5 мл бульона BHI. Инкубировать S. mutan s культуры на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Центрифуг бактериальной клетки культуры 15 мин на 2000 × g. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
- Центрифуги для 15 мин на 2000 × g. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл PBS.
- Экстракт геномной ДНК из подвески с использованием комплекта извлечения геномной ДНК шарик избиение base согласно инструкции, предоставляемые производителем.
- Подвеска передать образец 2.0-мл пробирку, содержащую стеклянные бусины (входит в комплект). 750 мкл раствора лизис (входит в комплект) к суспензии клеток.
- Крышка плотно и трубы симметрично в Трубодержатель шарик избиение срыв аппарата. Процесс на максимальной скорости на 5 мин. Центрифуги, избили из бисера образцов за 1 мин в 10 000 × g. передачи супернатант в спин фильтр (входит в комплект) в коллекции 2.0 мл трубки и центрифуги за 1 мин на 7000 × g .
- Добавить 1200 мкл ДНК привязки буфер (входит в комплект) для фильтрата. Передавать коллекции 2.0 мл трубки и центрифуги за 1 мин в 10 000 × g. 800 мкл смеси в столбце спин (входит в комплект)
- Отменить проточный, добавить 200 мкл предварительно вымыть буфера (входит в комплект) в столбец спин мыть столбца матрицы и центрифуги за 1 мин в 10 000 × g. отклонения потока через, 500 мкл буфера мытья (входит в комплект) к спин столбец для мыть столбца матрицы и центрифуги за 1 мин на 10 000 × г.
- Место столбце спина в новой трубки microcentrifuge 1,5 мл и 100 мкл буфера (входит в комплект) к матрице столбца.
- Центрифуги для 30 s на 10 000 × g элюировать геномной ДНК. Оценка концентрации ДНК и чистоты путем измерения оптической плотности на 260 Нм и 280 nmusing спектрофотометром и подтвердите, что соотношение 280 /A 260 A больше, чем 1.8.
3. Амплификации PCR
- выполнять 1 st ПЦР с помощью геном S. mutan s WT и синтетических spc r ген как шаблоны ПЦР (см. таблицу 1). Усилить регионе вверх по течению фланкируя gtfC гена, регионе течению фланкируя gtfC гена, и spc r гена, с помощью трех наборов грунты, описанные выше ( Рисунок 1A), согласно В таблице 2 и таблице 3.
Примечание: Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно. - Фракционировать каждый продукт PCR на геле агарозы 1% и акцизных соответствующие полосы, используя резец группы гель.
- Очистить каждый усиливается продукт ДНК из гелей с помощью спин столбец - и кремния гель на основе мембранных добыча комплект.
- Передачи фрагментов геля для чистой microcentrifuge трубки и смешать с 500 мкл привязки буфера (входит в комплект). Инкубировать смеси при температуре 55 ° C за 15 мин до тех пор, пока полностью растворены ломтиков геля.
- Место столбце спин (входит в комплект) в коллекции трубку (входит в комплект), загрузите образец на столбце спин и центрифуги для 30 s на 11 000 × g. Отбросить проточный, добавить 600 мкл буфера мытья (входит в комплект) в столбце спина мыть кремнезема мембраны, и центрифуги для 30 s на 11 000 × г.
- Отбросить проточных и центрифуги для 2 мин на 11 000 × г сухой кварцевый мембраны.
- Место столбце спина в новой пробки microcentrifuge 1,5 мл, 50 мкл Элюирующий буфер (входит в комплект) и инкубации при комнатной температуре на 2 мин
- Центрифуги для 2 мин на 11 000 × g элюировать амплифицированного ДНК. Оценка концентрации ДНК и чистоты путем измерения оптической плотности на 260 Нм и 280 nmusing спектрофотометром и подтвердите, что соотношение 280 /A 260 A больше, чем 1.8.
- Выполнять 2 nd ПЦР сплавливания 2-шаг ПЦР, используя три приблизительно эквимолярных фрагменты как шаблоны ПЦР, согласно Таблица 2 < / STЖун > и таблице 3.
Примечание: Эти фрагменты были усилены и сращивания с помощью вложенных праймеры ' N_up вперед и N_down обратный ' или внешний праймеры ' вверх вперед и вниз обратный ' ( рис. 1B). Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно. - Загрузить одну десятую от реакционной смеси ПЦР (5 мкл) на 0,8% агарозном геле и сравнить размер усиливается группы с размером ожидаемого диапазона для подтверждения поколения соответствующие ампликон ( рис. 1 c).
- Сконцентрировать оставшиеся конечный продукт PCR высыпанием этанола без очистки.
- Добавить 55 мкл ультра-чистой воды остальные смесь ПЦР для регулировки объема до 100 µL.Add объем одной десятой ацетат натрия 3 М (10 мкл), рН 5.2, следуют 2,5 томов 100% этанола (250 мкл). Смешать и заморозить на 30 мин в -80 ° C.
- Центрифуги для 20 минут, 15 000 × g при 4 ° C, проверьте Пелле в нижней части трубки и удалить супернатант. Помыть лепешка с 1 мл 70% этанола, центрифуги для 5 мин на 15000 × g при 4 ° C и отбросить супернатант. Просушите гранулы для приблизительно 30 мин и растворить с 10 мкл ультра-чистой воды.
4. Компетентные подготовка клетки и клетки трансформации
s UA159- полоска фондовой S. mutan на тарелку агар BHI. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Подобрать единую колонию с использованием стерилизованные зубочистку и инокуляции в 5 мл бульона BHI. Инкубировать S. mutan s культуры на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Передача 2 мл культуры S. mutan s 50 мл бульона BHI и проинкубируйте 6-8 ч при 37 ° C для оптической плотности на 600 Нм (600 OD) 0,2-0,4 в анаэробных условиях.
- Центрифуга для ячейки 15 мин на 2000 × g при 4 ° C, удалить супернатант и вымыть клетки дважды с 40 мл ледяной воды, после чего 40 мл 10% глицерина.
Примечание: Остаточные вещества влияют на последующие электропорации. - Аспирационная супернатант тщательно с пипетка Пастера, как присоединение Пелле клеток в 10% глицерина уменьшается. Ресуспензируйте клеток в 1 мл свежего 10% глицерина, обойтись 50 мкл суспензии в каждую пробирку microcentrifuge 1,5 мл и хранить при температуре-80 ° C до использования. Конструкция
- Mix 50 мкл Алиготе ледяной компетентных клеток с 5 мкл нарушения, описанные выше в разделе 3. Добавьте смесь для электропорации кюветы (с 0,2 см расстояние между электродами). Использовать режим золотистого стафилококка (1,8 кв, 600 Ω, 10 МКФ, 1 импульса) электропорации аппарата для electroporate.
- Приостановить клетки в 500 мкл BHI бульон сразу же после электропорации и добавьте 50 мкл суспензии спектиномицин содержащих плиты BHI-агара.
Примечание: Загородный инкубации время после электропорации не требуется. Однако, инкубаторов для 1-2 ч после электропорации может повысить эффективность преобразования. - Инкубировать пластину для 2-6 дней при 37 ° C в анаэробных условиях.
Примечание: S. mutans Δ gtfB построен как описано выше. Весь регион кодирования гена gtfB заменяется эритромицин сопротивления ген 8 в S. mutans Δ gtfB. Каждого штамма S. mutans культивировали в BHI бульон при 37 ° C в анаэробных условиях.
5. Проверка гена нарушения и хранения
- выбрать случайные колоний и прививать им в смесь ПЦР для выполнения колонии PCR согласно таблице 2 и таблице 3. Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно.
- Загрузить реакционную смесь ПЦР на геле агарозы 1% для подтверждения spc r-конкретные группы ДНК.
- Выбрать позитивные колонии, с использованием стерилизованные зубочистку и субкультуры клетки в 10 мл спектиномицин содержащих BHI бульон для 2 дней при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Проверить поколения S. mutans Δ gtfC.
- Делят суспензию клеток одинаково. Извлечение геномной ДНК из клетки, описанные выше (шаги 2.3. чтобы 2.5.5.). Выполнять ПЦР с геномной ДНК как ПЦР шаблон, используя Праймеры для проверки gtfC нарушения (Таблица 1) согласно таблице 2 и таблице 3.
Примечание: Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно. - Загрузить смесь ПЦР на 2% гель агарозы и сравните размер усиливается группы с размером ожидаемого диапазона для подтверждения поколения соответствующие ампликон .
- Центрифуга оставшиеся суспензию клеток для 15 мин на 2000 × g на 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл PBS.
- Центрифуги для 15 мин на 2000 × g на 4 ° C. Ресуспензируйте клетки пеллет в 1,5 мл бульона BHI, содержащих 25% глицерина и хранить в-80 ° Cor -20 ° C.
- Делят суспензию клеток одинаково. Извлечение геномной ДНК из клетки, описанные выше (шаги 2.3. чтобы 2.5.5.). Выполнять ПЦР с геномной ДНК как ПЦР шаблон, используя Праймеры для проверки gtfC нарушения (Таблица 1) согласно таблице 2 и таблице 3.
6. Фенотипического анализа
- подряд каждый штамм s S. mutan на тарелку агар BHI. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Подобрать единую колонию с использованием стерилизованные зубочистку и инокуляции в 2 мл BHI бульон с или без соответствующего антибиотика. Инкубируйте на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Инокуляции 20 мкл ночи подвеска культуры в 2 мл бульона BHI, содержащей 1% или 5% сахарозы без антибиотиков в стеклянной пробирке; культура клетки с пробирку в наклонном положении на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
- Vortex стеклянные пробирки для 10 s и сцеживаться суспензии культуры. Промойте пробирки три раза с дистиллированной водой. Добавить 1 мл 0,25% Кумасси блестящий синий (НБР) пятно биопленке на стенке трубки, а затем инкубировать 1 мин
- Сцеживаться окрашивание раствора, вымыть пробирки три раза с дистиллированной водой и сухие пробирки.
- Оценить плотность цвета и расширение окрашенных CBB биопленки визуально определить биопленки формирование способности в фенотипического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 показывает, что размер каждого продукта от 1st ПЦР, как заметил на геле агарозы 1%, был в хорошем согласии с предсказал размером примерно 1 КБ. Рисунок 3 показывает анализ электрофореза геля продукции 2nd ПЦР. Рисунок 4 показывает колоний S. mutans преобразована с разрушение конструкции и анализ электрофореза геля продуктов PCR колонии. Ампликонов от всех колоний были прогнозируемого размера. На рисунке 5 показан грунт привязки сайтов для проверки gtfC гель и срыв электрофорез продуктов PCR. ПЦР продукты, полученные путем усиления с помощью набора конкретных грунтовка gtfC -были подтверждены в S. mutans WT, но не в S. mutans ΔgtfC, тогда как продукты PCR полученные с помощью spcr-конкретных Грунтовка набор были подтверждены в S. mutans ΔgtfC, но не в S. mutans массовая Рисунок 6 показывает сахарозы производные биопленки формирование способности каждого штамма S. mutans . Адгезивная биопленки был сформирован Streptococcus mutans WT присутствии сахарозы; Адгезивная биопленки формирование способности S. mutans ΔgtfB был ниже, чем, что из Streptococcus mutans массовая Streptococcus mutans ΔgtfC выставлены очень низкой адэрентных биопленки в присутствии сахарозы.
Рисунок 1:Strategy для 2-ступенчатой fusion ПЦР. Схематическое изображение S. Показано mutans ΔgtfC строительство. Ген длины, не в масштабе. (A) вверх и вниз по течению фланговых районах gtfC и spcr локусов были усилены ПЦР. Сайтов связывания праймера в шаблоне указаны идентичные узоры. (B) второй шаг ПЦР была выполнена с использованием (как шаблоны) 3 фрагментов, которые были усилены в первом шаге ПЦР с вложенными грунтовки. (C) нарушения конструкции был получен для гомологичная рекомбинация в бактериальных штаммов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель гель-электрофорез продуктов из 1st ПЦР. Показываются ампликонов вверх по течению фланкируя региона gtfC и вниз по течению фланкируя региона gtfC и spcr . M: молекулярных маркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель гель-электрофорез продуктов из 2nd ПЦР. Продукты усиливается с вложенной праймеры и внешней праймеры, показаны. Твердых стрелка указывает прогнозируемый размер разрушение конструкции. M: молекулярных маркеров.
Рисунок 4: Скрининг для срыва gtfC колонии PCR (A). S. mutans колоний на пластину спектиномицин содержащих BHI-агар; Каждый кружил номер указывает идентификатор колонии. (B) представитель гель-электрофорез продуктов PCR колонии; Каждый номер кружил Лейн указывает идентификатор соответствующего колонии в рисунке 4A. M: молекулярных маркеров, WT: одичал тип геномной ДНК используется в качестве шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Проверка разрушения gtfC методом ПЦР. (A) грунт связывая места; гена длиной не в масштабе. ПЦР была выполнена с использованием геномной ДНК Streptococcus mutans как шаблон. Грунтовка наборы: gtfC вверх вперед и gtfC вверх реверс (конкретно gtfC); gtfC вниз вперед и gtfC вниз обратный (конкретно gtfC); gtfC вверх вперед и spcr2-реверс (специфические для НПФr); НПЦr2-вперед и gtfC вниз обратный (специфические для НПФr). (B) представитель гель-электрофорез продуктов ПЦР; каждый номер кружил Лейн указывает соответствующий грунт в Рисунок 5A. Единый образ электрофоретической делится на этикетке маркер полосы. M: молекулярных маркеров (100-база пара лестница). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: фенотипические анализ, основанный на развитии биопленки. Сахарозы производные биопленки, образованный каждого штамма S. mutans окрашивали Кумасси синий блестящий. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: Δ S. mutans gtfC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Грунтовка пара | Последовательность (5' к 3') | Размер ожидаемого диапазона (bp) | |
| 2-шаг ПЦР для нарушения gtfC | |||
| 1-Й PCR | |||
| вверх вперед вверх реверс |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1 036 | |
| SPCr-вперед SPCr-обратный |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1188 | |
| вниз вперед вниз реверс |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1 059 | |
| 2-Й PCR | |||
| N_up вперед N_down реверс |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| Проверка gtfC нарушения | |||
| Колония PCR для скрининга | |||
| S_spcr-вперед S_spcr-обратный |
|||
| gtfC вверх вперед gtfC вверх реверс |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC вниз вперед gtfC вниз реверс |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC вверх вперед НПЦr2-реверс |
Описанные выше CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| НПЦr2-вперед gtfC вниз реверс |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Описанные выше |
623 | |
| Реагент | Концентрация запасов решений | Объем | Конечная концентрация |
| ДНК-полимераза премикс | 2 × | 25 МКЛ | 1 × |
| Форвард грунтовка | 5 МКМ | 2 МКЛ | 0.2 МКМ |
| Обратный грунтовка | 5 МКМ | 2 МКЛ | 0.2 МКМ |
| Шаблон ДНК | Переменная | Переменная | Переменной * ** *** |
| Деионизированная вода | - | до 50 мкл | - |
Таблица 2: Реагенты PCR. * Для шага 1st ПЦР; 100 нг. ** Для 2nd ПЦР; каждый 30-50 ng Ампликон ПЦР шаг 1ст . Для колонии PCR; прямое дополнение бактериальных клеток в реакционной смеси.
| Шаг цикла | Температура | Время | Количество циклов |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 2 мин | 1 |
| Денатурация Отжиг Расширение |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Ампликон зависимых (1 мин/1 kbp) |
35 |
| Окончательное расширение | 72 ° C | Ампликон зависимых (1 мин/1 kbp) |
1 |
Таблица 3: Циклы амплификации PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем Протоколе Праймеры для 1st ПЦР должны разрабатываться для того чтобы усилить примерно 1 КБ, вверх и вниз по течению фланговых районах целевого региона в геноме. Такие длинные Фланкируя последовательности являются необходимыми для повышения эффективности гомологичная рекомбинация.
Последовательности праймеры (вверх назад, вниз вперед, spcr-вперед и spcr-обратный) в этом протоколе были автоматически определяются на месте инкорпорации разрушение конструкции. Каждый грунт включает в себя 15 баз дополняет в конце 2-й ПЦР шаблона в регионе 5'. Длиннее привязки сайта позволяет более эффективное производство разрушение конструкции. Включение по меньшей мере 10 дополнительных баз в регионе 5' каждого праймера рекомендуется9.
Вложенные грунтовки (N_up вперед и N_up реверс) были использованы для 2nd ПЦР, а не внешней грунтовки (вверх вперед и вниз обратный). Использование внешнего Праймеры для 2nd ПЦР является полезным в некоторых случаях; успешное усиление разрушение конструкции для S. mutans ΔgtfB была достигнута с помощью внешнего грунтовки (данные не показаны). Однако использование внешнего Праймеры для ПЦР шаг 2nd часто приводит к недостаточной амплификации PCR, как показано на рисунке 3. Для решения этой проблемы9было обнаружено использование вложенных грунтовки. Когда нарушение конструкции не усиливается существенно даже с помощью вложенных праймеры, однако, редизайн используется в 1-й ПЦР праймеры могут потребоваться.
Колония PCR позволяет удобно скрининг штамма ген нарушена. Праймеры известных последовательностей могут быть применены для поколения ген нарушена штамма с помощью spcr. Электропорация использовался для введения разрушение конструкций в S. mutans WT, как эффективность преобразования с помощью электропорации обычно выше, чем обеспечивается другими процедурами. Преобразование с помощью лошади сыворотки, или лошадь сыворотки с пептидами компетентность стимулирующее, широко признается в стрептококк10,,1112. Хотя электропорации аппарат является обязательным, соответствующих процедур, таких как подготовка компетентных клетки, гораздо проще, чем в альтернативные методы10,11. Кроме того электропорация рекомендуется с точки зрения благополучия животных.
Настоящий Протокол применяется к несколько генов потрясений, в зависимости от числа ofantibiotic маркеров. Для создания gtfC- и gtfB-нарушена штаммов S. mutans , например, ДНК конструкции для gtfC-нарушение построен 2-х ступенчатый ПЦР могут быть преобразованы в S. mutans ΔgtfB. Потому что в этом случае gtfC и gtfB являются смежными, метаболизирует ΔgtfC и Streptococcus mutans ΔgtfB геномов должны использоваться как шаблоны для 2-ступенчатой ПЦР для поддержания гомологичных последовательности для гомологичных рекомбинации. В самом деле, двойной ген нарушена Streptococcus mutans штамм ранее был построен этот протокол9.
Настоящий протокол за нарушение гена в S. mutans может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов. Этот протокол не требует клонирования шаг генов, участвующих в обычных протоколов. Кроме того ПЦР является только необходимые ферментативной реакции; Таким образом векторы плазмиды, Escherichia coli, лигаза и энзимов ограничения не являются необходимыми. Кроме того Настоящий Протокол предлагает большую гибкость с точки зрения дизайна разрушение конструкции, как дизайн конструкции независимо от энзима ограничения сайтов целевого гена. Исследователи могут определить регионы, которые удаляются или сохраняются в геноме обратный грунтовка для усиления вверх по течению фланкируя регионов и вперед грунтовка для усиления течению фланкируя регионов. Эти фланговых районах непосредственно перед и сразу же течению региона ДНК желаемой для удаления, соответственно. Такая гибкость может использоваться для уменьшения внешних воздействий, таких как полярные эффекты, на экспрессию генов, приуроченный.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддержали японское общество содействия развитию науки [номера грантов 16 K 15860 т.м. и 15 K 15777 N.H.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
Tags
Генетика выпуск 128 гена нарушения ДНК конструкции цепной реакции полимеразы конструкции праймера маркер генов антибиотикорезистентности Streptococcus mutans электропорация гомологичная рекомбинация View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
