Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

بيوفيلم الشفوي أخذ العينات للتحليل ميكروبيومي في الأطفال الأصحاء

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

تغييرات في ميكروبيومي عن طريق الفم طوال مرحلة الطفولة الاهتمام المتزايد. مقارنة للدراسات ميكروبيومي مختلفة يكشف عن عدم وجود بروتوكولات أخذ العينات موحدة. يجعل مساحة محدودة أخذ العينات ناصف سوبجينجيفال السليمة للأطفال صعبة. ورقة نقطة أخذ العينات المعروضة هنا بالتفصيل كأسلوب الاختيار لهذا المجال.

Abstract

بيوفيلم الشفوية والتحليل الجزيئي توفر أساسا للتحقيق في مختلف البحوث الأسنان والأسئلة الإكلينيكية. المعرفة لتكوين بيوفيلم يؤدي إلى فهم أفضل لآليات كاريوجينيك وبيريوباثوجينيك. الميكروبية التغيرات التي تحدث في تجويف الفم أثناء مرحلة الطفولة ذات أهمية لعدة أسباب. تطور الطفل الشفوي الحجمية والتحولات في تكوينها تحتاج إلى تحليلها كذلك إلى فهم، وربما منع ظهور المرض. في الوقت نفسه، هناك حاجة إلى معرفة متقدمة لتكوين بيوفيلم الفم الطبيعية. المراحل المبكرة من التسنين خالية من التسوس الدائمة مع اللثة صحية توفر موئلاً سوبجينجيفال لم تتأثر على نطاق واسع يمكن أن تستخدم كخط أساس في الموقع لدراسة الميزات لصحة الفم والأسنان وأمراض. تحليل بيوفيلم للأطفال عن طريق الفم أثناء المراحل المختلفة في الحياة ومن ثم موضوع مهم في هذا المجال. أساليب التحليل الجزيئي الحديثة يمكن أن توفر معلومات شاملة عن تنوع هذه الأغشية الحيوية البكتيرية. لتمكين الحجمية مقارنة البيانات، من المهم توحيد كل خطوة في الإجراء لتوليد البيانات الجزيئية. يمتد هذا الإجراء من معالجة البيانات أخذ العينات السريرية، القادم جيل التسلسل (خ ع و)، بيوينفورماتيك، إلى تفسير تصنيفية. واحدة من أهم العوامل الحاسمة هنا عينات بيوفيلم. أخذ العينات في الأطفال حتى أكثر صعوبة خاصة بسبب المساحة المحدودة في المناطق سوبجينجيفال. وهكذا نحن نركز على استخدام نقاط ورقة لأخذ العينات سوبجينجيفال. توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل للعينات بيوفيلم الشفوي ناصف سوبجينجيفال، والغشاء المخاطي، واللعاب في الأطفال.

Introduction

بيوفيلم الشفوي البشري تضم أوساط عريضة تتألف في الغالب من كومينسالس والكائنات الدقيقة المفيدة1،،من23. الأنواع الموجودة هنا استعمار جميع المنافذ أن تجويف الفم ويوفر4،،من56. ويختلف تكوين بيوفيلم في هذه المنافذ على الموائل أوسع نطاق. على سبيل المثال، يعرض اللعاب ملامح البكتيرية مختلفة من عينات اللوحة. اللوحة العينات من البالغين الأصحاء والوفرة النسبية ل Actinobacteria ما يزيد على 20 في المائة، بينما يوجد أقل من 7% في اللعاب. وفي المقابل تظهر Bacteroidetes و Firmicutes في إعداد أعلى بكثير في اللعاب7. وبالتالي، من المهم أن عينة في مواقع مختلفة في الفم من أجل الحصول على الصورة بأكملها. بالإضافة إلى ذلك، أن عوامل مختلفة مثل الفوارق الجغرافية والعرقية، والعمر والجنس وعوامل أخرى كثيرة تجعل من الصعب تحديد القواعد العامة بيوفيلم التنمية والمرض بداية8،9. لسنوات عديدة كان التحقيق في بيوفيلم بيريوباثوجينيك وكاريوجينيك الشاغل8،10،11،،من1213.

في السنوات الأخيرة، اكتسبت البحوث المتعلقة بمواضيع صحية أهمية ليس فقط لفهم أوسع للمرض، بل أيضا لتنفيذ تدابير وقائية14. التكنولوجيات الجديدة والتحليلات الجزيئية مزيد توضيح تشكيل بيوفيلم الشفوية والدالة15،16، وتمكين إنشاء ملفات التعريف الكامل للتنوع الميكروبي17،18. هذا ومن المتوقع أن تؤدي أيضا إلى فهم جديد للتغيرات الميكروبية أثناء العلاج بتقويم الأسنان19. أثر على وضع تقويم الأسنان الحيوية المنظور. سيتم تعزيز منظور ضوءا جديداً على مضاعفات للعلاج تقويم الأسنان المرتبطة بيوفيلم، مثل القعود المينا وأمراض اللثة12،،من2021. للسماح بإجراء مقارنات البيانات في جميع أنحاء العالم، من الأهمية بمكان لتوحيد جميع الخطوات في توليد البيانات. تغييرات طفيفة في الإجراءات المختبرية يمكن أن تؤثر بقوة النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي استخدام مختلف المنصات الحاسوبية في معالجة البيانات لمجموعات البيانات غير قابلة للمقارنة. وأخيراً، اختيار الاختبارات الإحصائية والتصويبات تأثيراً على النتائج. ومع ذلك، أخذ العينات التحيز يمكن أن يحدث الفعل قبل وقت طويل من أي عمل مختبر أو الحوسبة البيولوجية تبدأ. طرق أخذ العينات غير موحدة تؤدي إلى دراسة طبيعتها منحازة. نظراً لانخفاض مستويات معتدلة من التوحيد في الدراسات ذات الصلة، يوجد القليل من الأدلة على العلاقة بين تقويم الأسنان وميكروبيوميس19. ولذلك، سيسهل تطوير أساليب موحدة المؤهلين مقارنة البيانات في الحقل.

ويعرض هذا المقال بيوفيلم الشفوي موحدة إجراءات أخذ العينات. البروتوكول يهدف إلى الإسهام في توليد مجموعات قابلة للمقارنة عالمياً من بيانات تسلسل الميكروبية. ويقدم بروتوكول خطوة بخطوة لأخذ العينات بيوفيلم الشفوي في الأطفال الأصحاء. كأسلوب الاختيار، نقاط ورقة أتروماتيكالي المدرجة في ناصف سوبجينجيفال سليمة. تيسير المقارنات الموئل، هي عينات مخاطية الخد وفقا للبروتوكول نفسه. بالإضافة إلى ذلك، يوضح هذا المقال أخذ العينات المجمعة ومتوازية. وعلاوة على ذلك، يتم عرض عينات اللعاب. بسيطة مرمزة النقل ونظام التخزين يرد أيضا، تيسير إدارة العينة لمزيد من المعالجة. يتوقف اختيار عمليات ما بعد الإنتاج فيما يتعلق بالتخزين المتوسطة وتحليلات الجينومية والمعلوماتية الحيوية على الأسئلة السريرية التي أثارتها حقول مختلفة في البحث عن طريق الفم. في هذه المخطوطة، تم اختيار عينات الحمض النووي خ ع كمثال لتطبيق ممكن لتقويم البحوث.

Protocol

وقد أقر البروتوكول وتصوير الفيديو بمجلس المراجعة المؤسساتية "جامعة غراتس الطبية" (فطوم 27-126ex14/15). تم الحصول على الموافقة الخطية لهذا المنشور الفيديو من بلدها الأم والطفل.

1-الأدوات والمواد

  1. قص المعايرة (ISO 015/02)، وتشير الورقة العقيمة، عادة ما تستخدم في المعالجة اللبيّة، عند علامة الحلقة الأولى بغية توحيد على طول (الشكل 1).
  2. تطبيق إشعاع الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 260 نيوتن متر لمدة 30 دقيقة بغية تجنب تلويث الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي على ورقة النقاط (الشكل 2).
  3. اﻷوتوكﻻف الأنابيب للتخزين في 120 درجة مئوية و 1.2 تمنعهم عن 20 دقيقة ويتهددها الأشعة فوق البنفسجية كذلك أو توظيف جاهزة للاستخدام غاما المشع أنابيب.

2-إعداد المواضيع

ملاحظة: تم الحصول على الموافقة الخطية من الطفل وبلدها الأم قبل التسجيل.

  1. تطبيق زبدة الكاكاو على الشفاه.
  2. جبل الخد واللسان ضام للوصول الكامل إلى كل الأقواس طب الأسنان.
  3. وصمة عار البلاك الأسنان مع الكشف عن اللوحة.
  4. قم بإزالة الجهاز الميداني الجافة.
  5. شطف الفم بالماء حتى يصبح الماء عديم اللون.
  6. فرشاة الأسنان جيدا مع فرشاة الأسنان كهربائية في أنجوليشن 45 °. تطبيق المياه فقط ولكن لا يوجد معجون الأسنان، وهذا سوف يغير بيوفيلم الشفوي.
  7. جبل حقل جاف الجهاز مرة أخرى، بما في ذلك الحرس اللسان لإبقاء الفم مفتوحاً والجافة.
  8. نظيفة وجافة الأسنان مؤشر مع مسحات القطن المعقمة لتجنب امتصاص السوائل سوبراجينجيفال خلال ورقة نقطة أخذ العينات.

3-بيوفيلم أخذ العينات

  1. ورقة نقطة أخذ العينات من ناصف سوبجينجيفال
    1. فهم النقاط الورقة مع ملاقط الأسنان معقمة.
    2. إدراج النقاط ورقة عرضية تصل إلى طول محدد من 4 مم. عناية خاصة لا للجزع ظهارة هالة (الشكل 3).
    3. إزالة نقاط الورقة بعد 20 ثانية.
    4. جمع النقاط الورقة مباشرة إلى أنابيب معدّة: ضع ورقة وجهة نصيحة مباشرة في قنينة معقمة وخالية من الحمض النووي، وقطع عليه في العلامة الثالثة على طول موحد من 4 مم (الشكل 4).
    5. إذا كان يتبين من دراسة البروتوكولات، إدراج نقطتين ورقة موازية، وفي نفس الوقت في نفس الموقع (الشكل 5A).
    6. وبدلاً من ذلك، جمع النقاط ورقة من عدة مواقع إذا كان بروتوكول الدراسة يتطلب "العينات المجمعة" (الشكل 5 (ب)).
    7. إزالة جهاز الحقل الجاف للغشاء المخاطي وأخذ عينات اللعاب.
  2. ورقة المخاطية نقطة أخذ العينات
    1. تطبيق النقاط الورقة إلى حظيرة الدهليزية الخد العلوي (الشكل 6).
    2. إغلاق الخد والتدليك فإنه بإيجاز.
    3. فتح الخد وإزالة نقاط الورقة بعد 20 ثانية.
    4. قص الورقة النقاط في العلامة الثالثة ووضعها في أنبوب عقيم كما هو مبين لأخذ العينات سوبجينجيفال.
  3. أخذ عينات من اللعاب
    1. السماح للطفل يبصقون اللعاب unstimulated داخل وعاء جمع معقمة (الشكل 7).

4-نقل وتخزين

  1. جمع النقاط ورقة كعينات مفردة أو المجمعة أو موازية اعتماداً على تصميم الدراسة (الشكل 8).
  2. تطبيق نظام تخزين مرمزة لتيسير المزيد من نموذج إدارة (الشكل 9).
  3. وأخيراً، تخزين العينات في −80 درجة مئوية انتظارا لتحليل ميكروبيومي.

Representative Results

في هذه النشرة، يتجلى عينات الحمض النووي خ ع كمثال لتطبيق ممكن لتقويم البحوث. يتم استخراج الحمض النووي البكتيري مباشرة من العينات نقطة ورقة. ثم يمكن استخدام هذا الحمض النووي في الدراسات المتعلقة بتكوين الجراثيم السريري أو بحوث أسئلة (كما هي ملخصة في الشكل 10).

أساليب التحليل الجزيئي الحديثة مثل أسلوب خ ع 454-بيروسيكوينسينج إعطاء لمحة عامة عن الحجمية كاملة من عينة. يتم تعريف الحمض النووي لآلاف بكتيريا في وقت واحد على مختلف المستويات النشوء والتطور على 16s الاختلافات تسلسل الرنا الريباسي. منصات بيوينفورماتيك تحتاج إلى يتم إنشاؤها كوسيلة لهيكلة في مجموعات استرداد المعلومات من مجموعات البيانات الكبيرة. ثم يمكن تطبيق التحليل الإحصائي لمجموعات البيانات الحجمية.

يمكن تحليل الوفرة النسبية الإجمالية لبعض الأنواع البكتيرية كما يمكن حدوث تحولات في الحجمية سبب تغير شروط الموئل. تعرض المخططات الشريطية (الشكل 11) و heatmaps (الشكل 12) تكوين البكتيريا سوبجينجيفال على مستوى الأسرة في اللغات أو على مستوى النظام. ويمكن مقارنة مختلف الأفراد والعلاجات حسب إحصاءات وصفية واستنتاجي. ويعرض الشكل 13 مقارنة الرسم بياني لوضعي ورقة سوبجينجيفال نقطة أخذ العينات على مختلف المستويات التصنيفية. ويبين الجدول 1 أن التحول في تكوين بيوفيلم أثناء دراسة في المختبر مقارنة اثنين من النقاط الزمنية (T1 و T3). وحسبت تغييرات يعتد به إحصائيا مع الرتبي رتبة وقع الاختبار والتصحيح بونفيروني التالية من البيانات 454-بيروسيكوينسينج.

أخيرا، تمكن الرئيسية تنسيق تحليل (بكوا) مقارنة 3D مباشرة على مستوى الوحدة التصنيفية التشغيلية (أسامة) كما تم تحديدها في عينات مختلفة. قطع بكوا في الشكل 14 عرض الاختلافات داخل وبين إينديفيدوال من ميكروبيومي سوبجينجيفال في حالة سلسلة من خمسة أطفال. الرقم 15 يبين نتائج دراسة مراقبة حالة تقويم الأسنان: الوردي للنقاط الحمراء الحالات، النقاط زرقاء خفيفة للظلام والضوابط، وجميع عينات مرارا وتكرارا على مدى فترة أربعة أشهر. تجميع واضحة من الحالات بعد تدخل تقويم الأسنان (نقاط حمراء) يمثل تحولاً في ميكروبيومي. النقاط الزرقاء، وتمثل مجموعة السيطرة، تكون موزعة بالتساوي.

Figure 1
الشكل 1 : إعداد نقاط ورقة من طول موحد. يتم قطع الورق معايرة العقيمة النقاط عند علامة الحلقة الأولى لتوحيد على طول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تعقيم ونقاط ورقة خالية من الحمض النووي- نقاط ورقة موحدة يتم تعقيمها والأشعة فوق البنفسجية المشع في مقاعد البدلاء نظيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : ورق سوبجينجيفال نقطة الإدراج- يتم إدراج نقاط ورقة معايرة العقيمة عرضية في ناصف سوبجينجيفال حتى علامة خاتم 4 مم ل 20 ثانية.

Figure 4
الشكل 4 : قطع الورق نقطة في أنبوب. مباشرة بعد أخذ العينات، يتم قطع نقاط الورقة الثالثة خاتم مارك (4 مم) إلى عقيمة وخالية من الحمض النووي 1.5 مل فيال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : أخذ العينات المجمعة والموازية. يتم إدراج ورقة نقطتين في وقت واحد في ناصف سوبجينجيفال الأسنان واحد (A) أو عدة نقاط الورقة إلى سولسي سوبجينجيفال من عدة أسنان (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : أخذ العينات المخاطية. نقاط ورقة معايرة العقيمة تزرع في الغشاء المخاطي حظيرة الدهليزية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : جمع اللعاب. هو يبصقون اللعاب أونستيمولاتيد في كوب معقم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : خطة أخذ العينات- ويمكن جمع عينات كواحد (اليسار الجانب، كل واحد الأسنان)، تجمع (عدة لجميع المشارب في قنينة واحدة)، أو عينات التوازي (خطوط زرقاء، نقطتين ورقة في الأسنان واحد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الرقم 9 : مرمزة التخزين. رمز لون إشارة لأوراق وقنينات يسهل كذلك عينة المناولة.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الرقم 10 : تحليل بيوفيلم سوبجينجيفال- العرض التخطيطي لأخذ العينات السريرية بيوفيلم (A) واستخراج الحمض النووي (ب) التكنولوجيات المختلفة، خ ع (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
الرقم 11 : مخطط شريطي. عرض الوفرة النسبية للبكتيريا على مستوى الأسرة في اللغات تحليل استخدام 454-بيروسيكوينسينج. صورة معدلة من سانتيجلي et al. 22 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الرقم 12 : Heatmap. عرض وفرة نسبية من أوامر البكتيرية التي تم تحليلها باستخدام 454-بيروسيكوينسينج. الأحمر الداكن يمثل وفرة نسبية عالية (> 10%). أزرق داكن يمثل منخفضة جداً لا الوفرة النسبية لترتيب البكتيرية الخاصة بكل منها. صورة معدلة من سانتيجلي et al. 22 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 13
الرقم 13 : الرسم البياني- مقارنة بين وضعي ورقة نقطة أخذ العينات (طرق أ وب) المستويات التصنيفية المختلفة. البيانات التي تم إنشاؤها مع 454-بيروسيكوينسينج. صورة معدلة من سانتيجلي et al. 22 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 14
الرقم 14 : 2D بكوا الأرض. سلسلة حالة (n = 5) تبين الفروق الفردية داخل وفيما بين الأفراد نتيجة لاثنين من طرق أخذ العينات سوبجينجيفال (لون 1 هو الموضوع 1). البيانات التي تم إنشاؤها مع 454-بيروسيكوينسينج. صورة معدلة من سانتيجلي et al. 22 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 15
الرقم 15 : لقطة من على الأرض بكوا ثلاثية الأبعاد للرسوم المتحركة. ميكروبيومي سوبجينجيفال تظهر تحولات في دراسة مراقبة حالات تقويم الأسنان (n = 16؛ وكل مجموعة، 3 نقاط في الوقت المناسب؛ الحالات: الوردي إلى الأحمر وعناصر التحكم: الخفيفة إلى الأزرق الداكن). البيانات التي تم إنشاؤها مع 454-بيروسيكوينسينج.الحصول على بيانات غير منشورة من الفريق العامل سانتيجلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

أصنوفة: بكتيريا الوقت نقطة 1 [%] الوقت النقطة 3 [%] اختبار رتبة وقعت الرتبي
الأسرة في اللغات/جنس 25 الوسيط 75 25 الوسيط 75 قيمة p تعديل قيمة p #
الأخرى
الأخرى 0.70 1.07 1.28 1.32 1.63 1.93 .000 .005
أكتينوباكتيريا
الحارش 0.00 0.04 0.13 0.06 0.30 0.97 .001 .021
روثيا 0.00 0.00 0.05 0.00 0.13 0.32 .001 .009
باكتيرويديتيس
بريفوتيلا 0.00 0.01 0.22 0.15 1.02 2.44 .000 .006
فيرميكوتيس
أخرى (عصيات) 0.00 0.01 0.06 0.00 0.04 0.10 .706 1.000
المكوّرات العنقودية 0.00 0.01 0.12 0.00 0.07 0.17 .548 1.000
(جيميلاسيي) 0.00 0.00 0.07 0.12 0.77 1.24 .005 .091
(لاكتوباسيلاليس) 0.00 0.00 0.04 0.00 0.12 1.50 .004 .073
جرانوليكاتيلا 0.09 0.23 0.37 0.64 1.59 2.28 .000 .003
ملبنة 0.00 0.00 0.18 0.00 0.00 0.04 .700 1.000
أخرى (ستريبتوكوككاسيا) 0.00 0.04 0.13 0.00 0.10 0.19 .768 1.000
(ستريبتوكوككاسيا) 0.04 0.10 0.23 0.12 0.37 0.69 .005 .083
عقدية 53.42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
أخرى (لاتشنوسبيراسيي) 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 0.11 .003 .058
دياليستير 0.00 0.00 0.04 0.00 0.00 0.04 .240 1.000
فيلونيلا 3.43 27.15 42.78 6.69 13.38 27.05 .157 1.000
بروتيوباكتيريا
النزلة 0.00 0.00 0.03 0.31 0.84 2.38 .000 .008
اختبار قيمة p # الرتبي رتبة وقع تعديلها وفقا بونفيروني التصحيح
أ ف < 0.0026 اعتبرت هامة

الجدول 1: التحليل الإحصائي- الاختلافات في ميكروبيومي عن طريق الفم للأطفال الأصحاء عند نقطتين في الوقت المناسب. البيانات التي تم إنشاؤها مع 454-بيروسيكوينسينج. صورة معدلة من كلوغ et al. 23

Discussion

تم العثور على البكتيريا في جميع المواقع داخل تجويف الفم24،،من2526. وركزت العديد من الدراسات على استخدام اللعاب كوسيلة أخذ عينات خريطة الاستعمار عن طريق الفم كما أنه يمكن بسهولة أخذ عينات عن طريق البصق27،،من2829،،من3031، 32. ومع ذلك، لا تعكس اللعابية بيوفيلم تشكيل بيوفيلم سوبجينجيفال. وهكذا، باستخدام أساليب أخذ العينات الأخرى أمر بالغ الأهمية لإنشاء الصورة بأكملها، وسوف تثير مناقشات جديدة في بحوث طب الأسنان. عدة مقالات مقارنة استخدام كرتس ونقاط ورقة لأخذ العينات سوبجينجيفال من مواضيع المريضة بيريودونتالي8،،من3334. بعد المعروف لا فريق البحوث قد ركزت على تطبيق أجهزة جمع العينات موحدة لمختلف الفئات العمرية، وخاصة بالنسبة للأطفال19.

في هذا الفيديو، هو المقدمة بيوفيلم الشفوي لأخذ العينات من ثلاثة موائل الشفوي في الأطفال الأصحاء.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

والهدف من هذه المخطوطة يركز على البروتوكول السريرية لأخذ العينات بيوفيلم سوبجينجيفال من الأطفال الأصحاء. طريقة اختيار تشير إلى صوت سولسي سوبجينجيفال حيث يجعل مساحة محدودة من أخذ العينات لا سيما تحدي. في هذا الفيديو تم تطبيق الأسلوب على بداية التسنين الدائم. يمكن أيضا تطبيق التسنين المختلطة أو ناضجة، والأطفال أو البالغين. يسمح لنا طريقة أخذ العينات للتعديلات مثل عينات مفردة أو مجمعة. هذا الأخير يمكن أن تصبح عاملاً حاسما للتحليلات الجزيئية نظراً لكمية صغيرة من الحمض النووي التحصيل من ناصف سوبجينجيفال صحية. قد يتم تعديل اختيار الأسنان مؤشر على الطلب؛ على وجه الخصوص، قد يكون آخر الأسنان عينات كبديل عند هو صدمة الظهارة والنزيف، مما يجعل هذه النقطة الورق غير قابل للاستخدام. موازية أخذ العينات باستخدام نقطتين ورقة في وقت واحد في موقع واحد يجعل replicates عينة في خطوة واحدة، بالإضافة إلى تقصير الوقت كرسي للأطفال.

مع تعديلات طفيفة يمكن تذوق جيوب اللثة المريضة. هنا سوف تحتاج ورقة النقاط المراد إدخاله على طول كامل من الجيب، التي يمكن أن تصل إلى 10 مم. طول وكونوس ورقة النقاط وكذلك عمق الإدراج يجب أن تتكيف مع الموئل فموية للفائدة، ولكن ينبغي أن تكون موحدة دائماً بالمواد والأبعاد. ويمكن أيضا أخذ عينات من الغشاء المخاطي باستخدام نقاط ورقة. بروتوكولات مماثلة تسمح بإجراء مقارنات من الموائل المختلفة عن طريق الفم، ومختلف مواد طب الأسنان. يمكن أن يؤديها تحضير المريض وتخزين العينة كما هو موضح في هذا الفيديو. للبحث ميتاترانسكريبتومي، يمكن أخذ عينات الحمض النووي الريبي بنفس الأسلوب. وهكذا، بعد أخذ العينات، ينبغي إدراج النقاط الورقة مباشرة في الحمض النووي الريبي تثبيت الحل.

القيود المفروضة على هذه التقنية:

بغض النظر عن التعديلات، وأسلوب أخذ العينات السريرية يصف لنا ينحصر ناصف سوبجينجيفال الصوت. مواقع أخذ العينات الأخرى، أما بالنسبة جيوب المريضة بيريودونتالي سبيل المثال، لم تكن جزءا من تصميم الدراسة لدينا. كما أن هناك حاجة إلى أخذ العينات إلى كامل عمق هذه الجيوب، قد لا تكون النقاط ورقة كبيرة بما يكفي لجمع العينات بما فيه الكفاية. إذا كان الهدف التجريبية لمقارنة بيانات عينات من سولسي سوبجينجيفال سليمة وجيوب المريضة بيريودونتالي، من المهم أن تكون على علم من التحيز المتأصل الذي يقترن بأساليب أخذ العينات السريرية المختلفة. ولذلك ليس من المستصوب لمقارنة هذه البيانات.

يتم أخذ العينات حد من الطريقة المعروضة هنا دون استخدام اللاحقة من مونوازيدي بروبيديوم. تسمح إضافة هذا الوكيل مباشرة بعد أخذ العينات لتحليل محدد من الخلايا الحية فقط في بيوفيلم حلل. ويعكس أسلوب أخذ العينات الموضحة هنا عدد الخلايا الحية والميتة. للبحوث من التهاب اللثة الحاد، ربما ورقة النقاط ستحتاج لتحل محلها كرتس، كما يعتبر تشكيل بيوفيلم في جيوب عميقة قوية. ورقة نقطة أخذ العينات قد لا تعكس مجمل الميكروبية وفي هذه الحالات، كما قد تكون مشبعة على السطح بسرعة كبيرة جداً.

أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة:

مخطوطة المقترح هو أول نوعه لتوحيد سوبجينجيفال أخذ العينات في ناصف سليم مع نقاط ورقة. قد أشارت تقارير أخرى إلى استخدام كرتس معدنية35،36 أو ورقة نقاط 37،،من3839، لكن لم تصف العمليات التي تتم قبل أخذ العينات، مثل كلوحة التحكم، الأسنان تنظيف الأسنان العزلة، والتجفيف، وكذلك العمليات التي تنجم عن عدم كفاية المواصفات على خطوط الوقت وتقنيات أخذ العينات.

نحن في هاتين المادتين السابقة، يظهر أن استخدام نقاط الورقة أسلوب استنساخه لأخذ العينات بيوفيلم سوبجينجيفال في الأطفال22،40. نظراً لتصميمها، كرتس كبير جداً بالنسبة ناصف الضحلة مع مساحة محدودة وحادة جداً ظهارة هالة العطاء. من الأهمية بمكان الوصول إلى ناصف سوبجينجيفال دون يعرضونهم الظهارة. وبهذه الطريقة، يتم تجنب التحيز الناجمة عن النزف. وهكذا، استخدام نقاط ورقة ضئيلة والعطاء المفضل لهذا المجال. ورقة النقاط وظيفية لرصد التغييرات في تكوين بيوفيلم أثناء المعالجة التقويمية21،41. فضئيلة ومرنة بما يكفي لتناسب بين عناصر أجهزة تقويم الأسنان الثابتة. هذا ميزة كبيرة لطرق أخذ العينات الأخرى مثل كرتس. يتم تبسيط أتراوماتيك أخذ العينات وعينات كميات صغيرة من الحمض النووي من الممكن.

التطبيقات المستقبلية:

في هذا الفيديو أثبتنا الأسلوب في التسنين غير مريضة، مبكرا، ودائمة. كما يمكن تطبيقها على التسنين المختلطة أو ناضجة. مع بعض التعديلات من الممكن عينة المريضة بيريودونتالي مواقع مثل الأسنان أو يزرع ومنافذ أخرى بسبب مواد طب الأسنان باتباع البروتوكول نفسه. أبحاث تسوس يمكن أن تستفيد من هذا البروتوكول الموحد، في دراسات خاصة عن تسوس الجذر. المحاضرة أهم من أخذ العينات لدينا الفيديو توحيد البروتوكولات لجعل البيانات قابلة للمقارنة، بغض النظر عن ماذا، وكيف يتم قياس العينات.عروض فيديو مستقبلا يمكن أن تعزز مجال أخذ العينات السريرية بشكل عام.

بيوفيلم الشفوية التي تم الحصول عليها كما هو موضح في الفيديو يستخدم في العيادات والتحقيقات العلمية. ويمثل هذا النهج في فيفو جيدة بإضافة إلى في المختبر التقنيات الجزيئية مثل الأسفار في الموقع التهجين والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري15. خ ع الأساليب، بيروسيكوينسينج هو موضح هنا، ينطبق على بيوفيلم التي تم جمعها، تسمح تحليل الحجمية كاملة. يمكن استخدام حساب وفرة نسبية لبعض الأنواع البكتيرية لدعم العلاج أو لمقارنة مختلف المرضى أو العلاجات المختلفة. جنبا إلى جنب مع موحدة تسلسل البروتوكول وتسلسل تحليل سير عمل أن لدينا سبق وصف40، وهذا أسلوب أخذ العينات يسمح تحليل تسلسل وصولاً إلى مستوى جنس. المزيد من "ميتا"-الدراسات مثل دراسات ميتاترانسكريبتوميك أو metabolomic ممكن استناداً إلى بروتوكول أخذ العينات المعروضة في هذا الفيديو.

خطوات حاسمة:

تجنب التلوث خطوة حاسمة: أدوات عقيمة يجب أن يطبق في بيئة غير معقمة في فيفو . وقد النقل من الفم إلى هيئة المحكمة التي ينبغي أن تؤديها بسرعة وأمان ممتحن ذوي خبرة للحفاظ على وقت الرئيس للمشاركين في الدراسة قصيرة قدر الإمكان. أن الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هو إدراج النقطة الورقة إلى ناصف سوبجينجيفال أتروماتيك. وقد تعطل ظهارة هالة ونزيف على الإطلاق تجنبها. المزيد من الرعاية التي يجب اتخاذها كي لا تلوث ورقة النقاط وتخزين القنينات مع الحمض النووي الريبي أو خارجية. التخزين نفسها ثم أيضا خطوة حاسمة. عينات بحاجة إلى تجميد مباشرة، وفي أحسن الأحوال في −80 درجة مئوية. تجنب هذه التغييرات في تكوين البكتيرية بعد أخذ العينات، التي سوف تزوير نتائج التسلسل.

Disclosures

واضعي التقرير لا تضارب في المصالح المتصلة بهذا الإنتاج العلمي الفيديو.

Acknowledgments

الكتاب ممتنون يواكيم ثيوسل (مركز للبحوث الطبية، جامعة غراتس الطبية) للمساعدة التقنية الممتازة في إنتاج الفيديو ومونيكا فاريل (إدارة البحوث، جامعة غراتس الطبية) كصوت المواهب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
بيوفيلم الشفوي أخذ العينات للتحليل ميكروبيومي في الأطفال الأصحاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter