Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

Veranderingen in de mondelinge microbiome tijdens jeugd zijn van toenemende belangstelling. Vergelijking van verschillende microbiome studies blijkt een gebrek aan gestandaardiseerde bemonstering protocollen. Beperkte ruimte maakt het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van kinderen uitdagende bemonstering. Papieren punt bemonstering wordt hier in detail gepresenteerd als de methode van keuze voor dit gebied.

Abstract

Mondelinge biofilm en haar moleculaire analyse vormen een basis voor het onderzoeken van verschillende tandheelkundige onderzoek en klinische vragen. Kennis van biofilm samenstelling leidt tot een beter inzicht in de mechanismen van verwekkende en periopathogenic. Microbiële veranderingen die plaatsvinden in de mondholte tijdens de kindertijd zijn interessant om verscheidene redenen. De evolutie van het kind mondelinge microbiota en verschuivingen in de samenstelling moet verder worden geanalyseerd om te begrijpen en eventueel voorkomen dat het begin van de ziekte. Op hetzelfde moment, is geavanceerde kennis van de natuurlijke samenstelling van mondelinge biofilm nodig. Vroege stadia van cariës-gratis permanent gebit met gezond tandvlees bieden een algemeen onaangetast subgingivale habitat die als een basislijn in situ dienen kan voor het bestuderen van functies van mondelinge gezondheid en ziekte. Analyse van de mondelinge biofilm kinderen tijdens de verschillende fasen in het leven is dus een belangrijk thema in het veld. Moderne moleculaire analysemethoden bieden uitgebreide informatie over de bacteriële diversiteit van dergelijke biofilms. Opdat de microbiota gegevens vergelijking, is het belangrijk om te standaardiseren van elke stap in de procedure voor moleculaire gegevens generatie. Deze procedure omvat van klinische steekproeven, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatic gegevensverwerking, taxonomische interpretatie. Een van de meest cruciale factoren hier is de biofilm bemonstering. Bemonstering bij kinderen is dat zelfs meer uitdagend, met name als gevolg van de beperkte ruimte in de subgingivale gebieden. Dus richten we ons op het gebruik van papier punten voor subgingivale bemonstering. Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor mondelinge biofilm bemonstering van de subgingivale Sulcus (hersenanatomie), de mucosa en speeksel bij kinderen.

Introduction

Menselijke mondelinge biofilm omvat een brede gemeenschap die bestaat voornamelijk uit commensals en gunstige micro-organismen1,2,3. Soorten die hier voorkomen koloniseren alle niches dat de mondholte4,5,6 biedt. Biofilm samenstelling in deze nissen varieert zo breed als de habitats. Speeksel weergeeft, bijvoorbeeld verschillende bacteriële profielen dan plaque monsters. In plaque monsters van gezonde volwassenen is de relatieve overvloed van Straalzwammen meer dan 20%, terwijl minder dan 7% is gevonden in het speeksel. Bacteroidetes en Firmicutes verschijnen in tegenstelling in veel hogere aantallen in speeksel7. Het is dus belangrijk om te monster op verschillende locaties in de mond om het hele beeld. Bovendien maken verschillende factoren zoals de geografische en etnische verschillen, leeftijd, geslacht, en vele andere factoren het moeilijk om algemene regels voor de biofilm ontwikkeling en ziekte begin8,9te identificeren. Het onderzoek van periopathogenic en verwekkende biofilm is al vele jaren een centraal aandachtspunt8,10,11,12,13.

In de afgelopen jaren heeft onderzoek naar gezonde proefpersonen opgedaan belang niet alleen voor een breder begrip van ziekte, maar ook voor de uitvoering van de preventiemaatregelen14. Nieuwe technologieën en moleculaire analyses verder toelichten mondelinge biofilm vorming en functie15,16, en inschakelen het volledige profilering van microbiële diversiteit17,18. Naar verwachting zal ook leiden tot een nieuw begrip van microbiële wijzigingen tijdens orthodontische therapie19. Een impact op de ontwikkeling van orthodontische biomaterialen is te verwachten. De verbeterde vooruitzichten zal werpen nieuw licht op complicaties van orthodontische therapie biofilm, zoals emaille demineralisatie en parodontale ziekten12,20,21is gekoppeld. Als u wilt toestaan dat wereldwijd gegevens vergelijkingen, is het van cruciaal belang om te standaardiseren van alle stappen in de generatie van de gegevens. Kleine wijzigingen in de procedures van het laboratorium kunnen de resultaten sterk beïnvloeden. Bovendien is het gebruik van verschillende computationele platformen in de verwerking van gegevens kan leiden tot niet-vergelijkbare datasets. Ten slotte, de keuze van de statistische tests en correcties heeft een invloed op de resultaten. Echter, sampling bias al lang voordat de wijzigingen van de lab kan optreden of bio-demand begint. Niet-gestandaardiseerde bemonsteringsmethoden leiden tot een inherent partijdig studie. Met het oog op lage tot gematigde niveaus van normalisatie in de relevante studies bestaat weinig bewijs over de relatie tussen orthodontie en microbiomes19. Daarom zou de ontwikkeling van gestandaardiseerde methoden vergemakkelijken gekwalificeerde vergelijking van gegevens in het veld.

Dit artikel presenteert gestandaardiseerde mondelinge biofilm bemonsteringsprocedures. Het protocol beoogt bij te dragen aan het genereren van globaal vergelijkbare collecties van microbiële sequencedata. Een stapsgewijze protocol voor mondelinge biofilm bemonstering bij gezonde kinderen wordt gepresenteerd. Als de methode van keuze zijn papier punten ingevoegde atraumatically in de correcte subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Om te vergemakkelijken habitat vergelijkingen, Wang mucosa bemonsterd volgens hetzelfde protocol. Dit artikel demonstreert bovendien parallelle en gegroepeerde bemonstering. Bovendien, de bemonstering van het speeksel is aangetoond. Een eenvoudige vergelijkende vervoer en opslagsysteem wordt ook gepresenteerd, vergemakkelijking van het beheer van het specimen voor verdere verwerking. De keuze van de stroomafwaartse activiteiten met betrekking tot opslagmedium, metagenomic analyses, en bio-informatica, hangt af van de klinische vragen van verschillende velden in mondelinge onderzoek. In dit manuscript, DNA bemonstering voor NGS uitgekozen als voorbeeld van een mogelijke toepassing voor orthodontische onderzoek.

Protocol

Protocol en video ontspruiten werden goedgekeurd door het bestuur van de institutionele beoordeling van de medische universiteit van Graz (Votum 27-126ex14/15). Schriftelijke toestemming voor de publicatie van deze video is afkomstig van het kind en haar ouders.

1. instrumenten en materialen

  1. Knippen gekalibreerd (ISO 015/02) en steriel papier punten, meestal gebruikt in endodontische therapie, op de eerste ring merk oog op de standaardisering van hun lengte (Figuur 1).
  2. Toepassen van UV licht bestraling bij 260 nm gedurende 30 minuten om te voorkomen dat besmetting van DNA en RNA van de papier-punten (Figuur 2).
  3. Autoclaaf de buizen voor opslag bij 120 ° C en 1.2 bar voor 20 min en UV-bestralen hen zo goed of dienst kant-en-klare gamma bestraald buizen.

2. voorbereiding van onderwerpen

Opmerking: Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van het kind en haar ouder voorafgaand aan de inschrijving.

  1. Toepassing van cacaoboter aan de lippen.
  2. Monteren van de Wang en tong oprolmechanisme voor volledige toegang tot beide tandheelkundige bogen.
  3. Vlek de tandplaque met plaque openbaarmaking.
  4. Verwijder het apparaat droog gebied.
  5. Spoel de mond met water totdat het water kleurloos is.
  6. Grondig tanden te poetsen met een elektrische tandenborstel op 45 ° gehoekt. Breng water alleen maar geen tandpasta, als dit de mondelinge biofilm veranderen zou.
  7. Monteer het droge veld apparaat opnieuw, met inbegrip van de tong guard om te houden van de mond open en droog.
  8. Schoon en droog de tanden van de index met steriel katoenen wissers om te voorkomen dat de absorptie van supragingival vloeistof tijdens papier wijs bemonstering.

3. de Biofilm bemonstering

  1. Papieren punt bemonstering van de subgingivale Sulcus (hersenanatomie)
    1. Pak het papier punten met een steriele dentale pincet.
    2. Plaats papier punten tangentieel omhoog tot een gedefinieerde lengte van 4 mm. Wees extra voorzichtig niet te traumatiseren de regulates epitheel (Figuur 3).
    3. Verwijder papier punten na 20 s.
    4. Papier punten verzamelen rechtstreeks in bereid buizen: plaats het papier punt topje rechtstreeks in een steriele en DNA-gratis flesje en snijd het op de derde merk tot een gestandaardiseerde lengte van 4 mm (Figuur 4).
    5. Als aangegeven door de studie protocollen, plaatst u twee papier punten parallel en gelijktijdig op dezelfde locatie (figuur 5A).
    6. U kunt ook papier punten verzamelen van verschillende sites als het studie-protocol vereist "samengevoegde monsters" (figuur 5B).
    7. Verwijderen van het apparaat droog veld voor cutane en bemonstering van het speeksel.
  2. Mucosale papier wijs bemonstering
    1. Papier punten gelden voor de vestibulaire plooi van het bovenste Wang (Figuur 6).
    2. Sluit de Wang en massage het kort.
    3. Open van de Wang en verwijder het papier punten na 20 s.
    4. Gesneden papier punten op de derde merk en plaats ze in een steriele buis zoals aangegeven voor subgingivale bemonstering.
  3. Bemonstering van het speeksel
    1. Laat het kind ongestimuleerde speeksel spuwen in een gesteriliseerde collectie vaartuig (Figuur 7).

4. overdracht en opslag

  1. Papier punten verzamelen als single, gegroepeerd of parallelle monsters afhankelijk van het ontwerp van de studie (Figuur 8).
  2. Toepassing van een kleurcode opslagsysteem om verdere Steekproefbeheer (Figuur 9).
  3. Tot slot slaan de monsters op −80 ° C in afwachting van de microbiome analyse.

Representative Results

In de huidige publicatie, is DNA bemonstering voor NGS als een voorbeeld van een mogelijke toepassing voor orthodontische onderzoek aangetoond. Bacteriële DNA wordt geëxtraheerd rechtstreeks uit de papier punt monsters. Dit DNA kan vervolgens worden gebruikt in studies van de microbiële samenstelling voor klinische of onderzoek vragen (zoals samengevat in Figuur 10).

Moderne moleculaire analysemethoden zoals de NGS methode 454-pyrosequencing geven een overzicht van de volledige microbiota van een steekproef. Het DNA van duizenden bacteriën wordt geïdentificeerd gelijktijdig op verschillende niveaus van de fylogenetische over het 16s rRNA reeks verschillen. Bioinformatic platformen moeten worden gegenereerd als een middel in clusters die de informatie van de grote gegevenssets ontvangen te structureren. Statistische analyse kan vervolgens worden toegepast op datasets microbiota.

De totale relatieve overvloed van bepaalde bacteriesoorten kan als verschuivingen in de microbiota als gevolg van veranderende habitat voorwaarden kunnen worden geanalyseerd. Staafdiagrammen (Figuur 11) en heatmaps (Figuur 12) weergeven op het niveau van de stam of op het niveau van de bestelling de subgingivale bacteriële samenstelling. Verschillende individuen en behandelingen kunnen worden vergeleken door beschrijvende en inferentiële statistiek. Figuur 13 presenteert een histogram vergelijking van twee modi van subgingivale papier punt bemonstering op verschillende taxonomische niveaus. Tabel 1 toont de verschuiving in de samenstelling van de biofilm tijdens een in vitro studie van het vergelijken van twee tijdstippen (T1- en T3). Statistisch significante wijzigingen werden berekend met Wilcoxon ondertekend-rank test en volgende Bonferroni correctie van de 454-pyrosequencing-gegevens.

Ten slotte Principal coördinaat analyse (PCoA) in staat stelt direct 3D vergelijking op het niveau van de operationele taxonomische eenheid (OTU) zoals aangegeven in de verschillende monsters. De percelen van de PCoA in Figuur 14 weergeven intra - en intersite - individual verschillen van de subgingivale microbiome in een case-serie van vijf kinderen. Figuur 15 toont de resultaten van een orthodontische patiënt-controle-onderzoek: roze met rode stippen zijn de gevallen, licht tot donker blauwe stippen zijn de besturingselementen, alle bemonsterde herhaaldelijk over een periode van vier maanden. Een duidelijke clustering van de gevallen na de orthodontische ingreep (rode stippen) vertegenwoordigt een verschuiving in de microbiome. Blauwe stippen, die van de controlegroep, gelijkmatig verdeeld zijn.

Figure 1
Figuur 1 : Bereiden van papier punten van gestandaardiseerde lengte. Steriel gekalibreerde papier punten worden gesneden op het eerste merk van de ring op de standaardisering van hun lengte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Sterilize en gratis papier punten uit DNA. Gestandaardiseerde papier punten zijn gesteriliseerd en UV bestraald in een schone bankje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Subgingivale papier punt inbrengen. Steriel gekalibreerde papier punten tangentieel worden ingevoegd in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) tot het mark ring 4 mm voor 20 s.

Figure 4
Figuur 4 : Papier punt in buis snijden. Direct na de monsterneming, papier punten worden gesneden op de derde ring mark (4 mm) in een steriele en DNA-vrije 1,5 mL flacon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Gebundelde en parallelle bemonstering. Twee papier punten worden gelijktijdig in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van een tand (A) of verschillende punten van de papieren in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van verschillende tanden (B) ingevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Mucosal bemonstering. Steriel gekalibreerde papier punten worden gelegd in de mucosa van de vestibulaire vouw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Speeksel collectie. Ongestimuleerde speeksel is spit in een steriele bekerglas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Bemonsteringsplan. Monsters kunnen worden genomen als single (linkerkant, elke één tand), gebundeld (verschillende aan alle strepen in één flesje) of parallel (blauwe strepen, twee punten van het papier op een tand) monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9 : Vergelijkende opslag. Een verwijzende kleurcode voor lakens en flesjes vergemakkelijkt sample verdere behandeling.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10 : Analyse van de subgingivale biofilm. Schematische voorstelling van klinische biofilm bemonstering (A), DNA-extractie (B), en verschillende NGS technologieën (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11 : Staafdiagram. Toont de relatieve abundantie van de bacteriën op stam niveau geanalyseerd met behulp van 454-pyrosequencing. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 12
Figuur 12 : Heatmap. Toont de relatieve abundanties van bacteriële orders geanalyseerd met behulp van 454-pyrosequencing. Donkerrood vertegenwoordigt een hoge relatieve overvloed (> 10%). Donkerblauw vertegenwoordigt een zeer lage tot geen relatieve overvloed van de respectieve bacteriële orde. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 13
Figuur 13 : Histogram. Vergelijking van de twee modi van papier wijzen (modi A en B) bemonstering op verschillende taxonomische niveaus. Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 14
Figuur 14 : 2D PCoA plot. Een case-serie (n = 5) met intra-persoonlijke en inter-individuele verschillen als gevolg van twee subgingivale bemonsteringsmethoden (1 kleur is 1 onderwerp). Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 15
Figuur 15 : Momentopname van een 3D-animatie van PCoA plot. Weergegeven: subgingivale microbiome verschuivingen in een orthodontische case controle studie (n = 16; elke groep, 3 punten in tijd; gevallen: roze naar rood, besturingselementen: licht tot donker blauw). Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing.Niet-gepubliceerde gegevens van werkgroep Santigli. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Taxon: bacteriën Tijdstip 1 [%] Tijdstip 3 [%] Wilcoxon ondertekend-rank test
Phylum/geslacht 25e Mediaan 75ste 25e Mediaan 75ste p-waarde p-waarde aangepast #
Andere
Andere 0.70 1.07 1.28 1.32 1.63 1.93 .000 .005
Straalzwammen
Actinomyces 0,00 0.04 0.13 0,06 0,30 0.97 .001 .021
Rothia 0,00 0,00 0,05 0,00 0.13 0.32 .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0,00 0,01 0.22 0,15 1.02 2.44 .000 .006
Firmicutes
Andere (bacillen) 0,00 0,01 0,06 0,00 0.04 0.10 .706 1,000
Staphylococcus 0,00 0,01 0.12 0,00 0,07 0,17 .548 1,000
(Gemellaceae) 0,00 0,00 0,07 0.12 0.77 1.24 .005 .091
(Melkzuurbacteriën) 0,00 0,00 0.04 0,00 0.12 1,50 .004 .073
Granulicatella 0.09 0.23 0.37 0.64 1,59 2.28 .000 .003
Lactobacillus 0,00 0,00 0.18 0,00 0,00 0.04 .700 1,000
Andere (Streptococcaceae) 0,00 0.04 0.13 0,00 0.10 0.19 .768 1,000
(Streptococcaceae) 0.04 0.10 0.23 0.12 0.37 0.69 .005 .083
Streptococcus 53.42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
Andere (Lachnospiraceae) 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0.11 .003 .058
Dialister 0,00 0,00 0.04 0,00 0,00 0.04 .240 1,000
Veillonella 3.43 27.15 42,78 6.69 13,38 27.05 .157 1,000
Proteobacteria
Haemophilus 0,00 0,00 0.03 0.31 0.84 2.38 .000 .008
#p-waarde Wilcoxon ondertekend-rank test aangepast volgens Bonferroni-correctie
Een p < 0.0026 werd beschouwd als een belangrijke

Tabel 1: Statistische analyse. Verschillen in de mondelinge microbiome van gezonde kinderen op twee punten in de tijd. Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing. Afbeelding van Klug et al. gewijzigd 23

Discussion

Bacteriën zijn te vinden op alle sites binnen de mondholte24,25,26. Vele studies hebben gericht op het gebruik van speeksel als een medium van de bemonstering voor de kaart van mondelinge kolonisatie, aangezien het kan gemakkelijk worden bemonsterd door het spugen27,28,29,30,31, 32. Speeksel biofilm weerspiegelt echter niet subgingivale biofilm samenstelling. Dus, het gebruik van andere bemonsteringsmethoden is van cruciaal belang voor het maken van het geheel, en nieuwe discussies in tandheelkundige onderzoek zal oproepen. Verschillende artikelen vergelijken met het gebruik van Curettes| en papier punten voor subgingivale bemonstering van periodontally zieke onderwerpen8,33,34. Nog is geen onderzoeksgroep bekend te hebben gericht op de toepassing van gestandaardiseerde bemonstering apparaten voor verschillende leeftijdsgroepen, met name voor kinderen,19.

In deze video, wordt mondelinge biofilm bemonstering van drie mondeling habitats bij gezonde kinderen gepresenteerd.

Wijzigingen en probleemoplossing:

Het doel van het manuscript richt zich op het protocol voor klinische voor subgingivale biofilm bemonstering van gezonde kinderen. De methode van keuze verwijst naar geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) waar beperkte ruimte maakt bemonstering vooral uitdagend. In deze video werd de methode toegepast op vroege permanent gebit. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen gebit, en aan kinderen en/of volwassenen. Onze bemonsteringsmethode zorgt voor wijzigingen zoals één of samengevoegde monsters. Deze instelling kan worden een cruciale factor voor moleculair analyses als gevolg van de kleine hoeveelheid DNA collectable van de gezonde subgingivale Sulcus (hersenanatomie). De keuze van de tanden van de index kan worden gewijzigd op verzoek; in het bijzonder kunnen een andere tand bemonsterde als alternatief wanneer het epithelium is getraumatiseerd en bloeden, waardoor het papier punt onbruikbaar zijn. Parallelle bemonstering twee papier punten tegelijk op één site te gebruiken maakt monster replicaat-organismen in één stap, naast het verkorten van de tijd van de stoel voor kinderen.

Met kleine aanpassingen kunnen zieke paradontale pockets worden bemonsterd. Hier zal papier punten moeten worden opgenomen in de volledige lengte van de zak, die tot 10 mm oplopen kan. De lengte en de conus van papier punten en de diepte van de invoegpositie moet worden aangepast aan de intraoral habitat van belang, maar moet altijd worden gestandaardiseerd door materiaal en afmetingen. Monsters kunnen ook worden genomen vanaf de mucosa met behulp van papier punten. Identieke protocollen toestaan vergelijkingen van verschillende mondelinge habitats en diverse tandheelkundige materialen. Patiënt voorbereiding en monster-opslag kunnen worden uitgevoerd zoals beschreven in deze video. Voor metatranscriptome onderzoek, kan RNA worden bemonsterd met dezelfde methode. Dus, na de monsterneming, de papier-punten moeten worden opgenomen rechtstreeks in RNA stabilisatie oplossing.

Beperkingen van de techniek:

Ongeacht wijzigingen is de klinische bemonsteringsmethode we beschrijven beperkt tot het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Andere bemonsteringsplaatsen, wat betreft de periodontally zieke zakken voorbeeld, uitmaakten geen deel van ons studie-ontwerp. Als bemonstering tot de volledige diepte van dergelijke zakken nodig is, is het mogelijk dat papier punten niet groot genoeg is voor het verzamelen van monsters voldoende worden. Als de experimentele doel is om gegevens bemonsterd van geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) en periodontally zieke zakken te vergelijken, is het belangrijk om te beseffen van de inherente bias die is gekoppeld aan verschillende klinische bemonsteringsmethoden. Het is daarom niet aan te raden om dergelijke gegevens te vergelijken.

Een beperking van de methode die hier gepresenteerd is bemonstering zonder het latere gebruik van propidium monoazide. Het toevoegen van deze agent direct na de monsterneming voorziet in specifieke analyse van alleen de levende cellen in de biofilm geanalyseerd. De hier beschreven methode van monsterneming weerspiegelt aantallen levende en dode cellen. Voor het onderzoek van ernstige parodontitis, zal papier punten waarschijnlijk moeten worden vervangen door Curettes|, zoals biofilm vorming in diepe zakken sterk is. Papieren punt bemonstering mogelijk niet overeen met het gehele microbiële spectrum in deze gevallen, als hun oppervlak kan te snel worden verzadigd.

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:

Het voorgestelde manuscript is de eerste in zijn soort op de standaardisering van subgingivale bemonstering in de gezonde Sulcus (hersenanatomie) met papier punten. Andere verslagen hebben verwezen naar het gebruik van metalen Curettes|35,36 of papier punten 37,38,39, maar niet beschrijven de processen die vóór de bemonstering plaatsvinden, dergelijke Als de plaque control, tand schoonmaken, tand isolatie en drogen, evenals de processen die voortvloeien uit de ontoereikende specificaties op de bemonsteringsleidingen techniek en tijd.

In de twee vorige artikelen, laten we zien dat het gebruik van papier punten een reproduceerbare methode voor subgingivale biofilm bemonstering in kinderen22,40 is. Als gevolg van hun ontwerp zijn Curettes| te groot voor de ondiepe Sulcus (hersenanatomie) met beperkte ruimte en te scherp voor de aanbesteding regulates epitheel. Het is van cruciaal belang voor toegang tot de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) zonder het epithelium traumatiserend. Op deze manier wordt bias die voortvloeien uit het bloeden vermeden. Het gebruik van de punten slank en teder papier is dus voor dit gebied de voorkeur. Papier punten zijn functioneel om te controleren van wijzigingen in de samenstelling van de biofilm tijdens orthodontische behandeling21,41. Ze zijn slank en flexibel genoeg om te passen tussen de elementen van vaste orthodontische apparaten. Dit is een groot voordeel naar andere bemonsteringsmethoden zoals Curettes|. Atraumatische bemonstering wordt vereenvoudigd en bemonstering van kleine hoeveelheden DNA is mogelijk.

Toekomstige toepassingen:

In deze video toonden we de methode van permanente, niet-zieke, vroege gebit. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen gebit. Met enkele aanpassingen is het mogelijk om te proeven van periodontally zieke sites zoals tanden of implantaten en andere niches als gevolg van tandheelkundige materialen door hetzelfde protocol te volgen. Cariës onderzoek kon profiteren van dit gestandaardiseerde protocol, in bijzondere studies op wortel cariës. De belangrijkste les van onze monster video is standaardisatie van de protocollen gegevens om vergelijkbaar te maken, geen kwestie wat en hoe monsters worden gemeten.Toekomstige video demonstraties kunnen het veld van klinische bemonstering in het algemeen verbeteren.

Mondelinge biofilm verkregen zoals in de video wordt gebruikt in klinieken en voor wetenschappelijk onderzoek. Deze aanpak in vivo vormt een goede aanvulling op in vitro moleculaire technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie15. NGS methoden, toestaan toegepast op de verzamelde biofilm, als de pyrosequencing die hier is afgebeeld, de analyse van de volledige microbiota. Berekening van de relatieve abundanties van bepaalde bacteriesoorten kan worden gebruikt ter ondersteuning van behandelingen of om andere patiënten of verschillende behandelingen te vergelijken. Samen met een gestandaardiseerde sequencing protocol en sequentie analyse workflow hebben wij eerder beschreven40, deze bemonsteringsmethode kunt sequentieanalyse tot op het niveau van het geslacht. Verder "meta"-studies zoals metatranscriptomic of metabolomic studies zijn mogelijk gebaseerd zijn op het protocol van de bemonstering gepresenteerd in deze video.

Kritische stappen:

Vermijden van vervuiling is een cruciale stap: steriele instrumenten moeten worden toegepast in een omgeving met niet-steriele in vivo . De overdracht van de mond naar de Bank moet snel en veilig worden uitgevoerd door een ervaren onderzoeker stoel tijd voor studiedeelnemers zo kort mogelijk houden. De meest kritische stap in het protocol is de atraumatische invoeging van het punt van het papier in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Verstoring van de regulates epitheel en bloeden absoluut moeten worden vermeden. Verdere zorg moet worden genomen om niet besmetten papier punten en opslag flesjes met exogene DNA of RNA. De opslag zelf dan ook is een cruciale stap. Monsters moeten worden bevroren rechtstreeks, op zijn best bij −80 ° C. Dit voorkomt veranderingen in bacteriële samenstelling post steekproeven, die rangschikkend resultaten vervalsen zou.

Disclosures

De auteurs melden geen belangenconflicten die verband houden met deze wetenschappelijke video productie.

Acknowledgments

De auteurs zijn Joachim Theussl (centrum voor medisch onderzoek, medische universiteit van Graz) dankbaar voor de uitstekende technische bijstand in de videoproductie en Monica Farrell (onderzoekmanagement, medische universiteit van Graz) als stem talent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter