Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

אוראלי Biofilm דגימה לניתוח Microbiome ב ילדים בריאים

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

שינויים microbiome דרך הפה לאורך כל הילדות הם עניין גובר. השוואה של מחקרים שונים microbiome מגלה חוסר דגימה מתוקננת פרוטוקולים. שטח מוגבל גורם הדגימה את sulcus subgingival צליל של ילדים מאתגרים. נייר נקודת דגימה מוצג כאן בפירוט שיטת הבחירה עבור אזור זה.

Abstract

אוראלי biofilm וניתוח המולקולרי שלה מספקים בסיס חוקרים שונים מחקר דנטלי, שאלות קליניות. הידע של הרכב biofilm מוביל אל הבנה טובה יותר של cariogenic ו- periopathogenic. השינויים חיידקים מתרחש בחלל הפה במהלך הילדות הם עניין מכמה סיבות. ההתפתחות של הילד microbiota שבעל-פה, משמרות בהרכב שלה צריך להיות מנותח נוסף כדי להבין, יכול למנוע את התפרצות של המחלה. במקביל, נדרש ידע מתקדם של ההרכב הטבעי של biofilm אוראלי. בשלבים המוקדמים של קבע ללא עששת שיניים עם חניכיים בריאות מספקים גידול subgingival מושפע באופן נרחב, זה יכול לשמש בסיסי בחיי עיר לימוד תכונות של בריאות הפה ומחלות. ניתוח של biofilm ילדים אוראלי בשלבים שונים בחייו ובכך הוא נושא חשוב בתחום. שיטות ניתוח המולקולרי המודרני יכול לספק מידע מקיף על מגוון כזה biofilms חיידקי. כדי לאפשר microbiota נתוני השוואה, חשוב לתקנן בכל שלב בהליך לדור הנתונים המולקולריים. הליך זה משתרע על פני מן הדגימה הקלינית, הבא הדור רצף (הגדרות), bioinformatic עיבוד נתונים, לפרשנות בטקסונומיה. אחד הגורמים הקריטיים ביותר כאן הוא biofilm הדגימה. דגימה אצל ילדים הוא יותר מאתגר במיוחד עקב שטח מוגבלת באזורים subgingival. אנו מתמקדים לפיכך השימוש של נייר נקודות עבור הדגימה subgingival. מאמר זה מספק נוהל מפורט לדיגום biofilm אוראלי של sulcus subgingival, רירית ו רוק אצל ילדים.

Introduction

Biofilm אוראלי אנוש כוללת קהילה רחבה הכוללת בעיקר commensals, מיקרואורגניזמים מועילים1,2,3. מינים שנמצאו כאן ליישב כל נישות כי חלל הפה מציע4,5,6. קומפוזיציה Biofilm ב נישות אלה משתנה כמו באופן רחב ככל הגידול. לדוגמה, הרוק מציג פרופילים חיידקים שונים מאשר דגימות פלאק. בדגימות רובד של מבוגרים בריאים, שפע יחסי של Actinobacteria הוא מעל 20%, בעוד פחות מ- 7% נמצא ברוק. Bacteroidetes ו- Firmicutes לעומת זאת מופיעים הרבה מספרים גבוהים יותר ברוק7. לכן, חשוב מדגם במקומות שונים בפה על מנת לקבל את התמונה המלאה. בנוסף, גורמים שונים, ביניהם הבדלים אתניות וגיאוגרפיות, גיל, מין, וגורמים רבים אחרים להקשות לזהות כללי biofilm פיתוח ומחלות תחילת8,9. במשך שנים רבות החקירה של periopathogenic ו- cariogenic biofilm כבר הדאגה המרכזית8,10,11,12,13.

בשנים האחרונות, המחקר בנושאים בריא צברה חשיבות לא רק להבנה רחבה יותר של המחלה, אלא גם ליישום אמצעי מניעה14. טכנולוגיות חדשות וניתוחים מולקולרי נוסף להסבר ביופילמים אוראלי ו פונקציה15,16, ולאפשר את פרופיל מלא של גיוון מיקרוביאלי17,18. זה צפוי גם להוביל הבנה חדשה של חיידקים שינויים במהלך טיפול אורתודונטי19. השפעה על התפתחות biomaterials אורתודונטי הוא הנראה לעין. ההיבט משופרת תוכל לשפוך אור חדש על סיבוכים בטיפול אורתודונטי המשויך biofilm, כגון העלמות המינרלים אמייל, מחלות חניכיים12,20,21. כדי להתיר השוואות נתונים ברחבי העולם, זה הכרחי לתקנן כל השלבים בדור נתונים. שינויים קלים בהליכים מעבדה יכול מאוד להשפיע על התוצאות. בנוסף, השימוש משתנה פלטפורמות חישובית בעיבוד נתונים יכול להוביל datasets שאינם דומים. לבסוף, הבחירה של בדיקות סטטיסטיות והתיקונים יש השפעה על התוצאות. אולם, דגימה מוטה יכול להתרחש כבר זמן רב לפני כל עבודת מעבדה או מחשוב-ביו מתחילה. שיטות דגימה שאינם סטנדרטיים להוביל מחקר מוטה באופן אינהרנטי. על רקע נמוך רמות מתונות של סטנדרטיזציה במחקרים הרלוונטיים, קיימת מעט עדויות על הקשר בין אורתודונטיה, microbiomes19. לכן, בפיתוח שיטות מתוקננת להקל על ההשוואה מוסמך של הנתונים בשדה.

מאמר זה מציג biofilm אוראלי מתוקננת תהליכי דגימה. הפרוטוקול נועד לתרום לקראת יצירת אוספים דומים באופן גלובלי של חיידקים רצף נתונים. פרוטוקול צעד אחר צעד לדיגום biofilm אוראלי בילדים בריאים מוצג. כמו שיטת הבחירה, נייר נקודות הן atraumatically שהוכנס לתוך הצליל sulcus subgingival. כדי להקל על גידול השוואות, רירית הלחי נדגמים על פי באותו הפרוטוקול. בנוסף, מאמר זה מדגים דיגום מקבילים, במאגר. יתר על כן, מוצג דגימה רוק. פשוט מקודדים תחבורה, מערכת האחסון מוצג גם, דבר המקל על ניהול הדגימה עבור עיבוד נוסף. הבחירה של פעולות במורד הזרם בנוגע באמצעי אחסון, ניתוחים metagenomic, ביואינפורמטיקה תלוי קליניות שיועלו על ידי שדות שונים במחקר דרך הפה. כתב יד זה, דגימת DNA עבור הגדרות נבחר בתור דוגמה של יישום אפשרי למחקר אורתודונטי.

Protocol

הפרוטוקול ואת ירי וידאו אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של האוניברסיטה הרפואית של גראץ (Votum 27-126ex14/15). הסכמה בכתב עבור פרסום וידאו זה הושג של הילד ושל ההורה שלה.

1. מכשירים וחומרים

  1. גזור מכויל (ISO 015/02), נקודות נייר סטרילי, המשמשים בדרך כלל טיפול שורש, על הסימן הטבעת הראשונה כדי לתקנן את אורכם (איור 1).
  2. החלת הקרנת אור UV-260 ננומטר במשך 30 דקות על מנת למנוע זיהום DNA ו- RNA של נקודות נייר (איור 2).
  3. אוטוקלב הצינורות לאחסון 120 ° C ו 1.2 בר עבור 20 דקות ו- UV-להאיר אותם גם כן או להעסיק מוכן לשימוש גמא מוקרן צינורות.

2. הכנת נושאים

הערה: בכתב הסכמה מדעת הושג של הילד ושל הוריה לפני ההרשמה.

  1. חמאת קקאו חלות על השפתיים.
  2. הר הלחי, לשון המדחק עבור גישה מלאה בשתי קשתות השיניים.
  3. כתם של פלאק השיניים עם גילוי פלאק.
  4. להסיר את המנגנון יבש שדה.
  5. לשטוף את הפה עם מים עד שהמים השקופה.
  6. מברשת השיניים ביסודיות עם מברשת שיניים חשמלית-45 ° אפוזיציה. החל מים בלבד אבל אין משחת שיניים, כמו זה. תתאים את biofilm אוראלי.
  7. הר השדה יבש המנגנון שוב, השומר הלשון כדי לשמור על הפה פתוח ויבש.
  8. נקי ויבש השיניים אינדקס עם ספוגיות כותנה סטרילי למניעת ספיגת הנוזלים supragingival במהלך נייר נקודת דגימה.

3. Biofilm דגימה

  1. נייר נקודת דגימה של sulcus subgingival
    1. לתפוס את הנקודות נייר עם פינצטה שיניים סטרילי.
    2. להוסיף נקודות נייר tangentially עד כדי באורך מוגדר של 4 מ מ. קח להפריע. טראומה מהחיבור האפיתל (איור 3).
    3. להסיר את נייר נקודות לאחר 20 s.
    4. לאסוף נקודות נייר ישירות לתוך צינורות מוכנים: מניחים נייר נקודת קצה ישירות בקבוקון סטרילי ללא ה-DNA, תחתוך אותו בהסימן השלישי לאורך מתוקננת של 4 מ מ (איור 4).
    5. אם שמציין את הפרוטוקולים המחקר, להוסיף שתי נקודות נייר מקביל, בו זמנית באותו אתר (איור 5A).
    6. לחלופין, לאסוף נקודות נייר של מספר אתרים אם פרוטוקול המחקר דורש "במאגר דגימות" (איור 5B).
    7. להסיר את המנגנון יבש שדה עבור הרירית דגימה רוק.
  2. נייר הרירית נקודת דגימה
    1. חלות נקודות נייר לקפל את שיווי המשקל של הלחי העליונה (איור 6).
    2. לסגור את הלחי, עיסוי זה בקצרה.
    3. פתח את הלחי ולהסיר את הנקודות נייר לאחר 20 s.
    4. חותכים נייר נקודות הסימן השלישי ולמקם אותם בצינור סטרילי כמצוין לדיגום subgingival.
  3. דגימה רוק
    1. תן לילד לירוק רוק unstimulated לתוך כלי איסוף סטיריליים (איור 7).

4. העברת ואחסון

  1. לאסוף נקודות נייר כדוגמאות יחיד, במאגר או במקביל בהתאם לעיצוב המחקר (איור 8).
  2. החלת מערכת אחסון בעלי צבע כדי להקל עוד יותר דוגמת ניהול (איור 9).
  3. לבסוף, לאחסן את הדגימות-−80 ° C ממתינים ניתוח microbiome.

Representative Results

בפרסום הנוכחי, דגימה של הדנ א על המיתרים הוא הפגין כדוגמה של יישום אפשרי למחקר אורתודונטי. DNA חיידקי מופק ישירות מן הדגימות נקודת נייר. ניתן להשתמש את הדנ א במחקרים של הרכב מיקרוביאלי עבור קליני או מחקר שאלות (כפי שסוכם איור 10).

שיטות אנליזה מולקולרית מודרניים כמו המיתרים בשיטה 454-pyrosequencing לתת מבט כולל microbiota מלאה של מדגם. ה-DNA של אלפי חיידקים מזוהה בעת ובעונה אחת הרמות פילוגנטי מעל מטוסי אף-16 rRNA רצף הבדלים. Bioinformatic פלטפורמות צריך להיווצר כאמצעי ברובדי לתוך אשכולות המידע מאוחזר ערכות הנתונים גדול. ניתוח סטטיסטי ואז ניתן להחיל microbiota datasets.

ניתן לנתח את השפע הכולל היחסי של מינים מסוימים חיידקי יכול במאזן microbiota בגלל שינוי תנאי המחייה. תרשימי עמודות (איור 11) ו- heatmaps (איור 12) להציג את הרכב חיידקי subgingival ברמה מערכה או ברמת סדר. יחידים וטיפולים שונים ניתן להשוות לפי סטטיסטיקה תיאורית, הסקתית. איור 13 מציג השוואה היסטוגרמה של שני מצבים של נייר subgingival נקודת דגימה ברמות שונות בטקסונומיה. טבלה 1 מציגה את המשמרת בהרכב biofilm במהלך המחקר במבחנה השוואה בין שתי נקודות זמן (T1 ו- T3). שינויים משמעותיים מבחינה סטטיסטית חושבו עם מבחן דרגה חתם Wilcoxon ותיקון Bonferroni הבאים מתוך נתוני 454-pyrosequencing.

לבסוף, המנהל קואורדינטות ניתוח (PCoA) מאפשרת השוואה ישירה תלת-ממד ברמת יחידה בטקסונומיה תפעולית (OTU) כפי שזוהו בדגימות שונות. החלקות PCoA באיור 14 להציג אינטרה - והבין אישית הבדלי microbiome subgingival בסדרה במקרה של חמישה ילדים. איור 15 מראה את תוצאות המחקר שליטה במקרה אורתודונטי: ורוד נקודות אדומות המקרים, אור לחושך נקודות כחולות הן הפקדים, שנדגמו הכל שוב ושוב על פני תקופה של ארבעה חודשים. ברור קיבוץ באשכולות של המקרים לאחר התערבות אורתודונטי (נקודות אדומות) מייצג שינוי מצב microbiome. נקודות כחולות, המייצג את קבוצת הביקורת, מופצים בצורה שווה.

Figure 1
איור 1 : להכין נייר נקודות אורך מתוקננת. נייר מכוילת סטרילי נקודות נחתכים ב סימן טבעת הראשון לתקנן את אורכם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Sterilize ונקודות נייר בחינם מ- DNA- נייר סטנדרטית נקודות סטריליים, UV מוקרן ב ספסל נקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : נייר subgingival נקודת ההכנסה. נייר מכוילת סטרילי נקודות מוכנסים tangentially sulcus subgingival עד הסימן הטבעת 4 מ מ 20 s.

Figure 4
איור 4 : חיתוך נייר נקודת לתוך צינור. ישירות לאחר דגימה, נייר נקודות נחתכים מארק הטבעת השלישית (4 מ מ) לתוך סטרילי, בקבוקון 1.5 mL ללא ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : דגימה במאגר ומקבילי. שתי נקודות נייר מוכנסים בו זמנית sulcus subgingival של שן אחת (A) או מספר נקודות נייר לתוך sulci subgingival של מספר שיניים (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : דגימה הרירית. נייר מכוילת סטרילי נקודות מוטלות לתוך רירית של קיפול שיווי המשקל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : אוסף רוק. Unstimulated רוק רוק לתוך גביע סטרילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 : ערכת דגימה. ניתן לאסוף דגימות יחיד (צד שמאל, שן אחת בכל), איחדו (מספר על פסים כל בקבוקון אחד), או דגימות במקביל (פסים כחולים, שתי נקודות נייר-שן אחת). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9 : אחסון קטגוריות מקודדות לפי צבעים. קוד צבע מפנות עבור סדינים, בקבוקונים מקלה עוד יותר לטעום טיפול.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 : ניתוח subgingival biofilm. מצגת סכמטי של הדגימה הקלינית biofilm (A), הפקת דנ א (B), טכנולוגיות הגדרות שונות (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11 : תרשים. מציג שפע יחסי של חיידקים ברמה מערכה נותחה באמצעות 454-pyrosequencing. התמונה שונה. Santigli et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12 : Heatmap. מראה abundances היחסית של חיידקי הזמנות נותחה באמצעות 454-pyrosequencing. אדום כהה מייצג של שפע יחסית גבוה (> 10%). כחול כהה מייצג מאוד. נמוך אין השפע היחסי של המסדר חיידקי בהתאמה. התמונה שונה. Santigli et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 13
איור 13 : היסטוגרמה. השוואה בין שני מצבים של נייר נקודת דגימה (מצבי A ו- B) ברמות שונות בטקסונומיה. נתונים שנוצר עם 454-pyrosequencing. התמונה שונה. Santigli et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 14
איור 14 : 2D מגרש PCoA. סדרה במקרה (n = 5) מציג הבדלים התוך אישי, בין-אישי בעקבות שתי שיטות הדגימה subgingival (1 צבע הוא נושא 1). נתונים שנוצר עם 454-pyrosequencing. התמונה שונה. Santigli et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 15
איור 15 : בזק של הנפשה תלת-ממדית של מגרש PCoA. Microbiome subgingival מראה משמרות במחקר שליטה במקרה אורתודונטי (n = 16; כל קבוצה, 3 נקודות בזמן; מקרים: ורוד אדום, פקדים: אור כחול כהה). נתונים שנוצר עם 454-pyrosequencing.שלא פורסמו נתוני קבוצת העבודה Santigli. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ומין יחיד: Bacteriae נקודת הזמן 1 [%] נקודת זמן 3 [%] מבחן דרגה חתם Wilcoxon
מערכה/סוג 25 חציון -75 25 חציון -75 ערך-p ערך-p מותאם #
אחרים
אחרים 0.70 1.07 1.28 1.32 1.63 1.93 .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces 0.00 0.04 0.13 0.06 0.30 0.97 .001 .021
Rothia 0.00 0.00 0.05 0.00 0.13 0.32 נקודות .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0.00 0.01 0.22 0.15 1.02 2.44 .000 .006
Firmicutes
השני (החיידקים) 0.00 0.01 0.06 0.00 0.04 0.10 .706 1.000
סטפילוקוקוס 0.00 0.01 0.12 0.00 0.07 0.17 .548 1.000
(Gemellaceae) 0.00 0.00 0.07 0.12 0.77 1.24 .005 .091
(Lactobacillales) 0.00 0.00 0.04 0.00 0.12 1.50 .004 .073
Granulicatella 0.09 0.23 0.37 0.64 1.59 2.28 .000 .003
לקטובצילוס 0.00 0.00 0.18 0.00 0.00 0.04 .700 1.000
השני (Streptococcaceae) 0.00 0.04 0.13 0.00 0.10 0.19 .768 1.000
(Streptococcaceae) 0.04 0.10 0.23 0.12 0.37 0.69 .005 .083
סטרפטוקוקוס 53.42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
השני (Lachnospiraceae) 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 0.11 .003 .058
Dialister 0.00 0.00 0.04 0.00 0.00 0.04 .240 1.000
Veillonella 3.43 27.15 42.78 6.69 13.38 27.05 .157 1.000
פרוטאובקטריה
Haemophilus 0.00 0.00 0.03 0.31 0.84 2.38 .000 .008
ערך-p # Wilcoxon חתם-דרגה מבחן מותאם עפ י תיקון Bonferroni
P < 0.0026 נחשב משמעותי

טבלה 1: ניתוח סטטיסטי. הבדלים microbiome דרך הפה של ילדים בריאים-שתי נקודות בזמן. נתונים שנוצר עם 454-pyrosequencing. התמונה שונה קלוג. et al. 23

Discussion

החיידקים נמצאים בכל האתרים בתוך חלל הפה24,25,26. מחקרים רבים התמקדו על השימוש של רוק כמדיום הדגימה כדי למפות קולוניזציה אוראלי כמו זה בקלות ניתן לטעום באמצעות יריקה27,28,29,30,31, 32. עם זאת, biofilm הרוק אינו משקף קומפוזיציה subgingival biofilm. לפיכך, השימוש בשיטות דגימה אחרים היא חיונית ליצירת התמונה כולה, לעורר דיונים חדשים במחקר שיניים. מספר מאמרים להשוות את השימוש curettes ונקודות נייר לדיגום subgingival של נושאים חולה periodontally8,33,34. עדיין אין קבוצת מחקר ידוע התמקדו היישום של הדגימה מתוקננת מכשירים לקבוצות גיל שונות, במיוחד עבור ילדים19.

בסרטון וידאו זה, מוצג biofilm אוראלי דגימה של שלושה בתי גידול אוראלי אצל ילדים בריאים.

שינויים, פתרון בעיות:

מטרתו של כתב היד מתמקדת פרוטוקול קליני עבור subgingival biofilm דגימה של ילדים בריאים. שיטת הבחירה מתייחס קול sulci subgingival איפה מוגבל גורם דגימה מאתגר במיוחד. בסרטון זה השיטה הוחל על שיניים קבוע מוקדם. ניתן גם להחיל אותה כדי שיניים מעורב או בוגרים, ילדים ו/או מבוגרים. השיטה הדגימה שלנו מאפשר שינויים כגון דוגמאות בודדות או במאגר. האחרון עלולה להיות גורם מכריע עבור ניתוחים מולקולריים בגלל כמות קטנה של DNA לאספנות מ sulcus subgingival בריא. ניתן לשנות את הבחירה של השיניים אינדקס לפי דרישה; בפרט, עוד שן ייתכן שנדגמו כחלופה בעת האפיתל בטראומה ומדמם, ובכך הופך את נקודת נייר לא שמיש. דיגום מקבילים באמצעות שתי נקודות נייר בו זמנית באתר אחד מעבד מדגם משכפל בשלב אחד, בנוסף קיצור הזמן כסא לילדים.

עם שינויים קלים ניתן לטעום ולכוונו כיסי חניכיים. כאן נקודות נייר תצטרך להיות מוכנס באורך מלא של הכיס, אשר יכול להגיע עד 10 מ מ. האורך ואת כל נקודות נייר, כמו גם את העומק של ההכנסה חייב להיות מותאם הגידול אוראלית של עניין, אבל תמיד צריך להיות מוגדר על-ידי חומרים וממדים. גם ניתן לקחת דגימות של רירית באמצעות נייר נקודות. פרוטוקולים זהים לאפשר השוואות של בתי גידול אוראלי שונים וחומרים שיניים שונים. הכנת החולה ואחסון מדגם יכול להתבצע כפי שמתואר בסרטון הזה. למחקר metatranscriptome, RNA יכול ניתן לטעום עם השיטה זהה. לפיכך, לאחר דגימה, הנקודות נייר צריך להיות מוכנס ישירות ב- RNA מייצב פתרון.

מגבלות של הטכניקה:

בין השינויים, שיטת הדגימה הקלינית שנתאר מוגבל הצליל sulcus subgingival. אתרים אחרים דגימה, כמו למשל הכיסים periodontally חולה, לא היו חלק תכנון המחקר שלנו. כפי שהדגימה עומק הכיסים כזה מלא יש צורך, ייתכן נייר נקודות לא גדולה מספיק כדי לאסוף דגימות במידה מספקת. אם מטרת הניסוי היא להשוות נתונים לטעום מן קול sulci subgingival והכיסים periodontally חולה, חשוב להיות מודעים משוא הפנים הגלום המשויך בשיטות דגימה קליניים שונים. לכן לא מומלץ להשוות נתונים כאלה.

מגבלה של השיטה המובאת כאן היא דגימה ללא שימוש לאחר מכן propidium monoazide. הוספת סוכן זה ישירות לאחר דגימה מאפשר ניתוח ספציפי של רק התאים החיים biofilm מנותח. השיטה הדגימה המתוארים כאן משקף מספר של תאים חיים וגם מתים. למחקר של חניכיים חמורה, נייר נקודות סביר להניח שתצטרך להיות מוחלף על ידי curettes, כמו ביופילמים בתוך כיסים עמוקים הוא חזק. יכול להיות רווי נייר נקודת דגימה עשוי לא לשקף את כל קשת מיקרוביאלי במקרים אלה, כמו פני השטח שלהם מהר מדי.

משמעות לגבי שיטות קיימות:

כתב היד המוצע הוא הראשון מסוגו לתקנן את הדגימה subgingival ב sulcus בריא עם נייר נקודות. דוחות אחרים התייחסו לשימוש של35,curettes מתכת36 או נייר נקודות 37,38,39, אך לא מתארים את התהליכים המתרחשים לפני דגימה, כזה כפקד פלאק, שן, בידוד השן, ניקוי וייבוש, כמו גם התהליכים הנובעים מביצוע לקוי מפרטים על הקווים טכניקה, זמן הדגימה.

במאמרים קודמים שני, אנו מראים כי השימוש של נייר נקודות היא שיטה ישימה לדיגום subgingival biofilm ב ילדים22,40. בשל העיצוב שלהם, curettes הם גדולים מדי עבור sulcus רדוד עם שטח מוגבל חד הבחנה המכרז האפיתל מהחיבור. זה חיוני לגשת את sulcus subgingival ללא טראומות האפיתל. בדרך זו, הטיה הנובעת הדימום הוא נמנע. לפיכך, השימוש של נקודות נייר דק ועדין הוא מועדף עבור אזור זה. נייר נקודות מתפקדים כדי לעקוב אחר השינויים בהרכב biofilm במהלך טיפול אורטודנטי21,41. הם רזה, גמיש מספיק כדי להתאים בין האלמנטים של מכשירים אורתודונטים קבוע. זהו יתרון גדול על שיטות הדגימה אחרות כמו curettes. Atraumatic הדגימה היא פשוטה, דגימה של כמויות קטנות של ה-DNA אפשרית.

יישומים עתידיים:

בסרטון זה להדגים את השיטה על שיניים שאינם נגועים, מוקדם, קבע. זה גם יכול להחיל על שיניים מעורב או בוגר. כמה עיבודים זה תוכלו לטעום periodontally חולה מהאתרים שיניים או שתלים ונישות אחרים עקב חומרים דנטליים על-ידי ביצוע באותו הפרוטוקול. עששת מחקר יכול להפיק תועלת פרוטוקול זה מתוקנן, מחקרים מסוימת על בסיס עששת. ההרצאה הכי חשובה של הסרטונים שלנו הדגימה הוא האחדה של הפרוטוקולים כדי להפוך את הנתונים דומות, לא משנה מה, כמה דוגמאות נמדדים.הפגנות וידאו בעתיד יכול לשפר את תחום קליני דגימה באופן כללי.

אוראלי biofilm שהושג כפי שמוצג בסרטון משמש במרפאות לחקירה מדעית. בגישה זו אין ויוו מייצג תוספת טובה במבחנה טכניקות מולקולריות כגון קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ15. שיטות המיתרים, כמו pyrosequencing המוצגת כאן, המוחל על biofilm שנאספו, לאפשר הניתוח של microbiota להשלים. חישוב של abundances היחסית של מינים מסוימים חיידקי יכול לשמש כדי לתמוך טיפולים או להשוות בין מטופלים שונים או טיפולים שונים. יחד עם רצף מתוקננת הפרוטוקול ואת רצף ניתוח זרימת עבודה שיש לנו בעבר תיאר40, שיטה זו הדגימה מאפשר ניתוח רצף עד לרמת סוג. עוד "מטא"-מחקרים כגון metatranscriptomic או metabolomic מחקרים אפשריות בהתבסס על פרוטוקול הדגימה המוצגים בסרטון הזה.

שלבים קריטיים:

הימנעות זיהום הוא שלב קריטי: כלי סטרילי צריך להיות מיושם בסביבה שאינו סטרילי ויוו . העברת מן הפה לספסל צריך להתבצע במהירות, באופן מאובטח על ידי הבוחן מנוסים כדי לשמור על הכיסא הזמן עבור משתתפי המחקר קצר ככל האפשר. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול היא החדרת atraumatic הנקודה נייר לתוך sulcus subgingival. שיבוש האפיתל מהחיבור ודימום בהחלט צריך להמנע. טיפול נוסף יש לנקוט על מנת לא לזהם את הנייר נקודות ואחסון צלוחיות עם ה-DNA או RNA אקסוגני. האחסון עצמו ואז גם הוא שלב קריטי. דוגמאות צריך להיות קפוא ישירות, במקרה הטוב ב −80 מעלות צלזיוס. זה מונע שינויים בדגימה פוסט הרכב חיידקי, אשר לזייף תוצאות רצף.

Disclosures

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים הקשורים לסרט מדעי.

Acknowledgments

המחברים מודים על יואכים Theussl (מרכז למחקר רפואי, רפואה באוניברסיטת גראץ) לסיוע מצוינות טכני הפקת הסרטון, מוניקה פארל (ניהול מחקר, רפואה באוניברסיטת גראץ) כמו הכישרון הקול.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
אוראלי Biofilm דגימה לניתוח Microbiome ב ילדים בריאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter