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Medicine

स्वस्थ बच्चों में Microbiome विश्लेषण के लिए मौखिक फिल्म नमूना

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

बचपन भर में ओरल microbiome में बदलाव बढ़ती रुचि के होते हैं. विभिंन microbiome अध्ययन की तुलना मानकीकृत नमूना प्रोटोकॉल की कमी से पता चलता है । सीमित अंतरिक्ष बच्चों की ध्वनि subgingival sulcus चुनौतीपूर्ण नमूना बनाता है । पेपर प्वाइंट नमूना यहां इस क्षेत्र के लिए पसंद की विधि के रूप में विस्तार से प्रस्तुत किया है ।

Abstract

मौखिक और फिल्म आणविक विश्लेषण विभिंन दंत अनुसंधान और नैदानिक प्रश्नों की जांच के लिए एक आधार प्रदान करते हैं । फिल्म रचना का ज्ञान cariogenic और periopathogenic तंत्र की बेहतर समझ की ओर ले जाता है । बचपन के दौरान मौखिक गुहा में जगह लेने के माइक्रोबियल परिवर्तन कई कारणों के लिए ब्याज की हैं । बच्चे मौखिक microbiota और उसकी संरचना में बदलाव के विकास के लिए और अधिक समझने और संभवतः रोग की शुरुआत को रोकने के विश्लेषण की जरूरत है । एक ही समय में, मौखिक फिल्म की प्राकृतिक संरचना के उंनत ज्ञान की जरूरत है । क्षय के प्रारंभिक चरण-स्वस्थ मसूड़ों के साथ नि: शुल्क स्थाई दांत एक व्यापक रूप से अप्रभावित subgingival वास है कि मौखिक स्वास्थ्य और रोग की सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए सीटू आधारभूत में एक के रूप में सेवा कर सकते हैं प्रदान करते हैं । जीवन में विभिंन चरणों के दौरान बच्चों की मौखिक फिल्म का विश्लेषण इस प्रकार क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण विषय है । आधुनिक आणविक विश्लेषण विधियों ऐसी जैव फिल्म के जीवाणु विविधता के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । microbiota डेटा की तुलना को सक्षम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है आणविक डेटा पीढ़ी के लिए प्रक्रिया में प्रत्येक चरण का मानकीकरण. यह कार्यविधि नैदानिक नमूना, अगली पीढ़ी sequencing (NGS), bioinformatic डेटा संसाधन, वर्गीकरण व्याख्या करने के लिए तक विस्तृत है । सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक यहां है फिल्म नमूना । बच्चों में सैंपलिंग subgingival क्षेत्रों में सीमित स्थान के कारण विशेष रूप से और भी चुनौतीपूर्ण है । हम इस प्रकार subgingival नमूना के लिए कागज अंक के उपयोग पर ध्यान केंद्रित । इस लेख subgingival sulcus के मौखिक फिल्म नमूने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, म्यूकोसा, और बच्चों में लार ।

Introduction

मानव मौखिक फिल्म एक व्यापक commensals और लाभकारी सूक्ष्मजीवों1,2,3के ज्यादातर शामिल समुदाय शामिल हैं । प्रजातियों यहां पाया उपनिवेश सभी niches कि मौखिक गुहा4,5,6प्रदान करता है । इन niches में फिल्म संरचना के रूप में व्यापक रूप से निवास के रूप में बदलता है । उदाहरण के लिए लार पट्टिका नमूनों से अलग बैक्टीरियल प्रोफाइल प्रदर्शित करता है । स्वस्थ वयस्कों के पट्टिका नमूनों में, Actinobacteria के सापेक्ष बहुतायत 20% से अधिक है, जबकि 7% से कम लार में पाया जाता है । Bacteroidetes और Firmicutes विपरीत में बहुत अधिक संख्या में लार7में दिखाई देते हैं । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है के लिए मुंह में विभिंन स्थानों पर नमूना के लिए पूरी तस्वीर पाने के लिए । इसके अतिरिक्त, भौगोलिक और जातीय मतभेदों, उंर, सेक्स, और कई अंय कारकों के रूप में विभिंन कारकों के लिए यह मुश्किल के लिए सामांय नियमों की पहचान करने के लिए फिल्म विकास और रोग शुरुआत8,9। कई वर्षों से periopathogenic और cariogenic फिल्म की जांच के लिए एक केंद्रीय चिंता8,10,11,12,13है ।

हाल के वर्षों में, स्वस्थ विषयों पर अनुसंधान रोग की एक व्यापक समझ के लिए ही नहीं बल्कि निवारक उपायों के कार्यांवयन के लिए भी14महत्व प्राप्त की है । नई प्रौद्योगिकियों और आणविक विश्लेषण आगे स्पष्ट मौखिक जैव फिल्म गठन और समारोह15,16, और माइक्रोबियल विविधता की पूरी रूपरेखा17,18सक्षम करें । यह भी orthodontic थेरेपी के दौरान माइक्रोबियल परिवर्तन की एक नई समझ के लिए नेतृत्व की उंमीद है19। orthodontic के विकास पर एक प्रभाव के निकट है । संवर्धित परिप्रेक्ष्य, इस तरह के तामचीनी विखनिजीकरण और periodontal रोग12,20,21के रूप में, orthodontic चिकित्सा की जटिलताओं पर नई रोशनी बहा देगा । दुनिया भर में डेटा तुलना की अनुमति देने के लिए, यह डेटा जनरेशन में सभी चरणों का मानकीकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रयोगशाला प्रक्रियाओं में मामूली परिवर्तन दृढ़ता से परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, डेटा संसाधन में भिन्न गणनात्मक प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग गैर-तुलनीय डेटासेट को ले सकता है. अंत में, सांख्यिकीय परीक्षणों और सुधार के चुनाव परिणामों पर एक प्रभाव है । हालांकि, नमूना पूर्वाग्रह पहले से ही लंबे समय किसी भी प्रयोगशाला काम या जैव कंप्यूटिंग शुरू से पहले हो सकता है । गैर मानकीकृत नमूना तरीकों एक स्वाभाविक पक्षपातपूर्ण अध्ययन करने के लिए सीसा । प्रासंगिक अध्ययन में मानकीकरण के मध्यम स्तर को कम करने के मद्देनजर, छोटे सबूत orthodontics और microbiomes19के बीच संबंधों पर मौजूद है । इसलिए, मानकीकृत तरीकों के विकास के क्षेत्र में डेटा की योग्य तुलना की सुविधा होगी ।

यह लेख मानकीकृत मौखिक फिल्म नमूना प्रक्रियाओं प्रस्तुत करता है । प्रोटोकॉल के लिए माइक्रोबियल अनुक्रम डेटा के विश्व स्तर पर तुलनीय संग्रह पैदा करने की दिशा में योगदान करना है । स्वस्थ बच्चों में मौखिक फिल्म नमूना के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । पसंद की विधि के रूप में, कागज अंक ध्वनि subgingival sulcus में atraumatically डाला जाता है । निवास की तुलना की सुविधा के लिए, गाल म्यूकोसा एक ही प्रोटोकॉल के अनुसार नमूना है । यह आलेख इसके साथ ही प्रदर्शित करता है समानांतर और pooled नमूना । इसके अलावा, लार नमूना दिखाया गया है । एक साधारण रंग कोडित परिवहन और भंडारण प्रणाली भी प्रस्तुत की है, आगे की प्रक्रिया के लिए नमूना प्रबंधन की सुविधा । भंडारण माध्यम के बारे में बहाव आपरेशनों के विकल्प, metagenomic विश्लेषण, और bioinformatics मौखिक अनुसंधान में विभिन्न क्षेत्रों द्वारा उठाए गए नैदानिक सवालों पर निर्भर करता है. इस पांडुलिपि में, NGS के लिए डीएनए नमूना orthodontic अनुसंधान के लिए एक संभव आवेदन का एक उदाहरण के रूप में चुना गया है ।

Protocol

प्रोटोकॉल और वीडियो शूटिंग के लिए चिकित्सा विश्वविद्यालय के चराई के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया (Votum 27-126ex14/ इस वीडियो प्रकाशन के लिए लिखित सहमति बच्चे और उसके माता पिता से प्राप्त की गई थी ।

1. उपकरण और सामग्री

  1. कटौती नपे (आईएसओ 015/02) और बाँझ कागज अंक, आमतौर पर नालिका चिकित्सा में इस्तेमाल किया, पहली अंगूठी निशान में क्रम में अपनी लंबाई (चित्रा 1) का मानकीकरण करने के लिए.
  2. 30 मिनट के लिए २६० एनएम पर यूवी प्रकाश विकिरण लागू करने के लिए कागज अंक (चित्रा 2) के डीएनए और आरएनए संदूषण से बचने के लिए ।
  3. आटोक्लेव १२० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए ट्यूबों और 20 मिनट और यूवी के लिए १.२ बार-विकीर्ण उन्हें के रूप में अच्छी तरह से या तैयार करने के लिए उपयोग गामा विकिरणित ट्यूबों को रोजगार ।

2. विषयों की तैयारी

नोट: नामांकन से पूर्व बच्चे और उसके माता-पिता से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई ।

  1. होंठ के लिए कोको मक्खन लागू करें ।
  2. दोनों दंत मेहराब के लिए पूर्ण पहुंच के लिए गाल और जीभ reट्रेक्टर माउंट ।
  3. पट्टिका प्रकटीकरण के साथ दंत पट्टिका दाग ।
  4. शुष्क फ़ील्ड उपकरण निकालें ।
  5. पानी से मुंह को तब तक कुल्ला करे जब तक कि जल बेरंग न हो जाए ।
  6. ४५ ° angulation पर एक इलेक्ट्रिक टूथ ब्रश के साथ अच्छी तरह से ब्रश दांत । लागू पानी केवल लेकिन कोई टूथपेस्ट, के रूप में इस मौखिक फिल्म में परिवर्तन होगा ।
  7. सूखी क्षेत्र तंत्र फिर से माउंट, जीभ गार्ड सहित मुंह खुला और शुष्क रखने के लिए ।
  8. साफ और शुष्क कपास झाड़ू के साथ सूचकांक दांत सूखी कागज बिंदु नमूने के दौरान supragingival द्रव के अवशोषण से बचने के लिए ।

3. फिल्म नमूना

  1. subgingival sulcus के कागज बिंदु नमूना
    1. बाँझ दंत चिमटी के साथ कागज अंक समझ ।
    2. संमिलित करें कागज अंक 4 मिमी की एक निर्धारित लंबाई तक tangentially । जंक्शनीय उपकला (चित्रा 3) ज़ख़म नहीं करने के लिए विशेष ध्यान रखना.
    3. 20 एस के बाद पेपर पॉइंट्स निकालें ।
    4. कागज अंक सीधे तैयार ट्यूबों में ले लीजिए: एक बाँझ और डीएनए मुक्त शीशी में सीधे कागज बिंदु टिप प्लेस, और 4 मिमी (चित्रा 4) की एक मानकीकृत लंबाई के लिए तीसरे निशान में कटौती.
    5. यदि अध्ययन प्रोटोकॉल द्वारा इंगित किया गया हो, तो दो काग़ज़ बिंदु समानांतर और एक साथ एक ही साइट (चित्र 5/) में डालें ।
    6. वैकल्पिक रूप से, कई साइटों से कागज अंक इकट्ठा अगर अध्ययन प्रोटोकॉल की आवश्यकता है "नमूनों परित" (चित्रा 5B) ।
    7. श्लैष्मिक और लार नमूना के लिए सूखी क्षेत्र उपकरण निकालें ।
  2. श्लैष्मिक पेपर पॉइंट नमूना
    1. ऊपरी गाल (चित्रा 6) के vestibular गुना करने के लिए कागज अंक लागू करें ।
    2. गाल बंद करो और यह संक्षेप में मालिश ।
    3. गाल खोलो और 20 एस के बाद पेपर अंक निकालो ।
    4. तीसरे निशान पर कागज अंक में कटौती और उंहें एक बाँझ ट्यूब में जगह के रूप में subgingival नमूना के लिए संकेत दिया ।
  3. लार नमूना
    1. बच्चे को एक निष्फल संग्रह पोत (चित्रा 7) में उत्तेजित लार थूक दें ।

4. अंतरण और भंडारण

  1. अध्ययन डिजाइन (चित्रा 8) के आधार पर एकल, परित, या समानांतर नमूनों के रूप में कागज अंक ले लीजिए ।
  2. आगे नमूना प्रबंधन (चित्र 9) की सुविधा के लिए कोई रंग-कोडेड संग्रहण सिस्टम लागू करें ।
  3. अंत में, नमूनों की दुकान − ८० ° c लंबित microbiome विश्लेषण ।

Representative Results

वर्तमान प्रकाशन में, NGS के लिए डीएनए नमूना orthodontic अनुसंधान के लिए एक संभव आवेदन का एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । बैक्टीरियल डीएनए सीधे कागज बिंदु नमूनों से निकाला जाता है । यह डीएनए तो नैदानिक या अनुसंधान के सवालों के लिए माइक्रोबियल संरचना के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है (के रूप में चित्रा 10में संक्षेप) ।

आधुनिक आणविक विश्लेषण विधियों जैसे NGS विधि ४५४-pyrosequencing एक नमूना की पूरी microbiota का अवलोकन दे । हजारों बैक्टीरिया के डीएनए 16s rRNA अनुक्रम मतभेद पर अलग वंशावली स्तरों पर एक साथ की पहचान की है । Bioinformatic प्लेटफार्मों बड़े डेटा सेट से प्राप्त जानकारी क्लस्टर में संरचना के एक साधन के रूप में उत्पन्न होने की जरूरत है । सांख्यिकीय विश्लेषण फिर microbiota डेटासेट पर लागू किया जा सकता है.

कुछ जीवाणु प्रजातियों के समग्र सापेक्ष बहुतायत का विश्लेषण किया जा सकता है के रूप में निवास स्थान की स्थिति बदलने के कारण microbiota में बदलाव कर सकते हैं । बार चार्ट्स (चित्र 11) और heatmaps (चित्र 12) जाति स्तर पर या क्रम स्तर पर subgingival बैक्टीरियल संरचना प्रदर्शित करते हैं । विभिंन व्यक्तियों और उपचार वर्णनात्मक और तरजीही आंकड़ों की तुलना में किया जा सकता है । चित्रा 13 अलग वर्गीकरण स्तर पर subgingival कागज बिंदु नमूना के दो मोड के हिस्टोग्राम तुलना प्रस्तुत करता है । 1 तालिका में एक इन विट्रो दो समय अंक (T1 और T3) की तुलना में अध्ययन के दौरान फिल्म संरचना में बदलाव से पता चलता है । सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन Wilcoxon हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण और ४५४-pyrosequencing डेटा से निम्न Bonferroni सुधार के साथ परिकलित किए गए थे ।

अंत में, प्रिंसिपल निर्देशांक विश्लेषण (PCoA) प्रत्यक्ष 3d तुलना में कार्यरत वर्गीकरण इकाई (ओटू) स्तर पर विभिन्न नमूनों में पहचान के रूप में सक्षम बनाता है । चित्रा 14 में PCoA भूखंड पांच बच्चों की एक मामले श्रृंखला में subgingival microbiome के अंतर और अंतर-व्यक्तिगत मतभेदों को प्रदर्शित करते हैं । चित्रा 15 एक orthodontic मामले नियंत्रण अध्ययन के परिणाम से पता चलता है: लाल डॉट्स के लिए गुलाबी मामलों रहे हैं, गहरे नीले डॉट्स के लिए प्रकाश नियंत्रण कर रहे हैं, चार महीने की अवधि से अधिक बार सभी नमूना. orthodontic हस्तक्षेप (लाल डॉट्स) के बाद मामलों की एक स्पष्ट clustering microbiome में एक बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है । नीले डॉट्स, नियंत्रण समूह का प्रतिनिधित्व, समान रूप से वितरित कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : मानकीकृत लंबाई के कागज अंक तैयार. उनकी लम्बाई का मानकीकरण करने के लिए पहले रिंग मार्क पर बाँझ नपे पेपर पॉइंट कट जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : डीएनए से बंध्याकरण और मुक्त कागज अंक । मानकीकृत कागज अंक निष्फल और एक स्वच्छ पीठ में यूवी विकिरणित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : Subgingival पेपर पॉइंट लन. 20 एस के लिए 4 मिमी अंगूठी निशान तक बाँझ नपे कागज अंक subgingival sulcus में tangentially डाला जाता है ।

Figure 4
चित्र 4 : ट्यूब में कागज बिंदु काटना । सीधे नमूने के बाद, कागज अंक एक बाँझ और डीएनए मुक्त १.५ मिलीलीटर की शीशी में तीसरे रिंग चिह्न (4 मिमी) में कटौती कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : परित और समानांतर नमूना। दो कागज अंक एक दांत के subgingival sulcus में एक साथ डाला जाता है (एक) या कई दांत (बी) के subgingival sulci में अनेक कागज अंक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : श्लैष्मिक sample. बाँझ नपे कागज अंक vestibular गुना के म्यूकोसा में रखी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : लार संग्रह. उत्तेजित लार एक बाँझ चोंच में थूक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : नमूना योजना. नमूने एकल (बाईं ओर, एक दांत प्रत्येक), परित (एक शीशी में सभी धारियों के लिए कई), या समानांतर (नीली पट्टियां, एक दांत में दो कागज अंक) के रूप में एकत्र किया जा सकता है नमूने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : रंग-कोडेड संग्रहण. चादरें और शीशियों के लिए एक संदर्भ रंग कोड आगे नमूना हैंडलिंग की सुविधा ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : Subgingival फिल्म विश्लेषण । नैदानिक फिल्म नमूना (), डीएनए निष्कर्षण (बी), और विभिंन NGS प्रौद्योगिकियों (सी) की योजनाबद्ध प्रस्तुति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 : पट्टी चार्ट. जाति स्तर पर बैक्टीरिया के सापेक्ष बहुतायत दिखा ४५४-pyrosequencing का उपयोग कर विश्लेषण । छवि Santigli एट अल से संशोधित । 22 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्र 12 : Heatmap । जीवाणु आदेश के सापेक्ष बहुतायत दिखा ४५४-pyrosequencing का उपयोग कर विश्लेषण । गहरा लाल एक उच्च सापेक्ष बहुतायत का प्रतिनिधित्व करता है (& #62; 10%) । डार्क ब्लू संबंधित बैक्टीरियल आदेश का कोई रिश्तेदार बहुतायत करने के लिए एक बहुत कम का प्रतिनिधित्व करता है । छवि Santigli एट अल से संशोधित । 22 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 13
चित्र 13 : हिस्टोग्राम. पेपर प्वाइंट नमूना के दो मोड की तुलना (एक और बी) अलग वर्गीकरण के स्तर पर मोड । ४५४-pyrosequencing के साथ उत्पंन डेटा । छवि Santigli एट अल से संशोधित । 22 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 14
चित्र 14 : 2d PCoA प्लाट । एक मामले श्रृंखला (n = 5) अंतर व्यक्तिगत और अंतर व्यक्तिगत अंतर दो subgingival नमूना तरीकों (1 रंग 1 विषय है) का एक परिणाम के रूप में दिखा । ४५४-pyrosequencing के साथ उत्पंन डेटा । छवि Santigli एट अल से संशोधित । 22 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 15
चित्र 15 : 3d PCoA प्लॉट ऐनिमेशन का स्नैपशॉट. एक orthodontic मामले नियंत्रण अध्ययन में subgingival microbiome पाली दिखा रहा है (n = 16; प्रत्येक समूह, समय में 3 अंक; मामले: लाल, नियंत्रण करने के लिए गुलाबी: गहरे नीले रंग के लिए प्रकाश) । ४५४-pyrosequencing के साथ उत्पंन डेटा ।कार्य समूह Santigli से अप्रकाशित डेटा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Taxon: बैक्टीरिया समय बिंदु 1 [%] समय बिंदु 3 [%] Wilcoxon साइन-रैंक टेस्ट
जाति/जीनस 25 माध्य 75 25 माध्य 75 पी-मान p मान समायोजित #
अन्य
अन्य ०.७० १.०७ १.२८ १.३२ १.६३ १.९३ .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces ०.०० ०.०४ ०.१३ ०.०६ ०.३० ०.९७ .001 .021
Rothia ०.०० ०.०० ०.०५ ०.०० ०.१३ ०.३२ .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella ०.०० ०.०१ ०.२२ ०.१५ १.०२ २.४४ .000 .006
Firmicutes
अन्य (बेसिली) ०.०० ०.०१ ०.०६ ०.०० ०.०४ ०.१० । ७०६ १.०००
staphylococcus ०.०० ०.०१ ०.१२ ०.०० ०.०७ ०.१७ । ५४८ १.०००
(Gemellaceae) ०.०० ०.०० ०.०७ ०.१२ ०.७७ १.२४ .005 । ०९१
(Lactobacillales) ०.०० ०.०० ०.०४ ०.०० ०.१२ १.५० .004 । ०७३
Granulicatella ०.०९ ०.२३ ०.३७ ०.६४ १.५९ २.२८ .000 .003
लैक्टोबैसिलस ०.०० ०.०० ०.१८ ०.०० ०.०० ०.०४ । ७०० १.०००
अन्य (Streptococcaceae) ०.०० ०.०४ ०.१३ ०.०० ०.१० ०.१९ । ७६८ १.०००
(Streptococcaceae) ०.०४ ०.१० ०.२३ ०.१२ ०.३७ ०.६९ .005 । ०८३
स्ट्रेप्टोकोकस ५३.४२ ६१.९६ ८८.३८ ४८.४४ ६०.८३ ७३.९७ । ०५५ । ९३०
अन्य (Lachnospiraceae) ०.०० ०.०० ०.०१ ०.०० ०.०० ०.११ .003 । ०५८
Dialister ०.०० ०.०० ०.०४ ०.०० ०.०० ०.०४ । २४० १.०००
Veillonella ३.४३ २७.१५ ४२.७८ ६.६९ १३.३८ २७.०५ । १५७ १.०००
Proteobacteria
haemophilus ०.०० ०.०० ०.०३ ०.३१ ०.८४ २.३८ .000 .008
#p-मान Wilcoxon साइन-रैंक टेस्ट गर्नुभयो नुसार Bonferroni सुधार
A p & #60; ०.००२६ को महत्वपूर्ण माना गया

तालिका 1: सांख्यिकीय विश्लेषण. समय में दो बिंदुओं पर स्वस्थ बच्चों के मौखिक microbiome में अंतर । ४५४-pyrosequencing के साथ उत्पंन डेटा । छवि Klug एट अल से संशोधित । 23

Discussion

बैक्टीरिया मौखिक गुहा के भीतर सभी साइटों पर पाए जाते हैं24,25,26. कई अध्ययनों से यह आसानी से थूकना27,28,29,30,31के माध्यम से नमूना लिया जा सकता है के रूप में मौखिक औपनिवेशीकरण नक्शा करने के लिए एक नमूना माध्यम के रूप में लार के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है, ३२. हालांकि, लार subgingival फिल्म संरचना को प्रतिबिंबित नहीं करता है । इस प्रकार, अंय नमूना तरीकों का उपयोग पूरी तस्वीर बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, और दंत अनुसंधान में नए विचार विमर्श आह्वान करेंगे । कई लेख periodontal रोग के विषय8,३३,३४के नमूने subgingival के लिए curettes और कागज अंक के उपयोग की तुलना करें । अभी तक कोई अनुसंधान समूह के लिए विभिंन आयु समूहों के लिए मानकीकृत नमूना उपकरणों के आवेदन पर ध्यान केंद्रित किया है जाना जाता है, विशेष रूप से बच्चों के लिए19

इस वीडियो में, स्वस्थ बच्चों में तीन मौखिक निवास के मौखिक फिल्म नमूना प्रस्तुत किया जाता है ।

संशोधन और समस्या निवारण:

पांडुलिपि का उद्देश्य स्वस्थ बच्चों के subgingival की फिल्म के नमूने के लिए नैदानिक प्रोटोकॉल पर केंद्रित है । विकल्प की विधि subgingival sulci ध्वनि को संदर्भित करता है जहां सीमित स्थान विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण नमूना बनाता है । इस वीडियो में विधि जल्दी स्थाई दांत के लिए लागू किया गया था । यह भी मिश्रित या परिपक्व दांत के लिए लागू किया जा सकता है, और बच्चों और/ हमारे नमूना विधि एकल या परित नमूनों के रूप में संशोधनों के लिए अनुमति देता है । बाद आणविक विश्लेषण स्वस्थ subgingival sulcus से एकत्र डीएनए की छोटी राशि के कारण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है । सूचकांक दांत की पसंद की मांग पर संशोधित किया जा सकता है; विशेष रूप से, एक और दांत एक विकल्प के रूप में नमूना लिया जा सकता है जब उपकला आघात और खून बह रहा है, इस प्रकार कागज बिंदु अनुपयोगी बनाने. समानांतर एक साइट पर एक साथ दो कागज अंक का उपयोग कर नमूना renders नमूना एक कदम में दोहराने, बच्चों के लिए कुर्सी का समय छोटा करने के अलावा ।

मामूली संशोधनों के साथ periodontal जेब रोगग्रस्त हो सकता है । यहां पेपर पॉइंट्स को पॉकेट की पूरी लंबाई में डालने की जरूरत होगी, जो 10 एमएम तक पहुंच सकती है । लंबाई और कागज अंक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रविष्टि की गहराई कांउस ब्याज की intraoral निवास स्थान के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन हमेशा सामग्री और आयामों द्वारा मानकीकृत किया जाना चाहिए । नमूने भी कागज अंक का उपयोग कर म्यूकोसा से लिया जा सकता है । समान प्रोटोकॉल अलग मौखिक निवास और विभिन्न दंत सामग्रियों की तुलना की अनुमति देते हैं । रोगी की तैयारी और नमूना भंडारण के रूप में इस वीडियो में वर्णित किया जा सकता है । metatranscriptome अनुसंधान के लिए, आरएनए एक ही विधि के साथ नमूना किया जा सकता है । इस प्रकार, नमूना लेने के बाद, कागज अंक आरएनए स्थिरीकरण समाधान में सीधे डाला जाना चाहिए.

तकनीक की सीमाएं:

संशोधनों के बावजूद, नैदानिक नमूना विधि हम वर्णन ध्वनि subgingival sulcus तक ही सीमित है । अंय नमूना साइटों, उदाहरण के लिए के रूप में periodontal रोगग्रस्त जेब, हमारे अध्ययन डिजाइन का हिस्सा नहीं थे । इस तरह की जेब की पूरी गहराई के लिए नमूने के रूप में की जरूरत है, कागज अंक पर्याप्त नमूनों को इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । यदि प्रयोगात्मक लक्ष्य ध्वनि subgingival sulci और periodontal रोगग्रस्त जेब से नमूना डेटा की तुलना करने के लिए है, यह निहित पूर्वाग्रह है कि अलग नैदानिक नमूना तरीकों के साथ जुड़ा हुआ है के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है । इसलिए इस तरह के डेटा की तुलना करना उचित नहीं है ।

यहां प्रस्तुत विधि की एक सीमा propidium monoazide के बाद के उपयोग के बिना नमूना है । इस एजेंट को जोड़ने के बाद सीधे नमूना के विशिष्ट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है केवल जीवित कोशिकाओं में फिल्म का विश्लेषण किया । यहां वर्णित नमूना विधि जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या को दर्शाता है । गंभीर periodontitis के अनुसंधान के लिए, कागज अंक शायद curettes द्वारा प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी, के रूप में गहरी जेब में फिल्म निर्माण मजबूत है । कागज बिंदु नमूना इन मामलों में पूरे माइक्रोबियल स्पेक्ट्रम को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है, के रूप में उनकी सतह भी जल्दी से संतृप्त किया जा सकता है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:

प्रस्तावित पांडुलिपि अपनी तरह का पहला है कागज अंक के साथ स्वस्थ sulcus में subgingival नमूना मानकीकृत । अंय रिपोर्टों धातु curettes३५,३६ या कागज अंक ३७,३८,३९के उपयोग के लिए भेजा है, लेकिन प्रक्रियाओं है कि नमूना लेने से पहले जगह ले वर्णन नहीं किया है, ऐसे पट्टिका नियंत्रण के रूप में, दांत सफाई, दांत अलगाव, और सुखाने, साथ ही प्रक्रियाओं है कि नमूना तकनीक और समय लाइनों पर अपर्याप्त विनिर्देशों से परिणाम है ।

पिछले दो लेखों में, हम बताते है कि कागज अंक के उपयोग के बच्चों में22,४०subgingival फिल्म नमूना के लिए एक प्रतिलिपि विधि है । उनके डिजाइन के कारण, curettes सीमित स्थान के साथ उथले sulcus के लिए बहुत बड़े है और निविदा जंक्शनीय उपकला के लिए बहुत तेज है । यह उपकला traumatizing बिना subgingival sulcus का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह, रक्तस्राव से होने वाले पूर्वाग्रह से बचा जाता है । इस प्रकार, स्लिम और निविदा कागज अंक का उपयोग इस क्षेत्र के लिए पसंद है । कागज अंक orthodontic उपचार21,४१के दौरान फिल्म संरचना में परिवर्तन की निगरानी के लिए कार्यात्मक हैं । वे स्लिम और काफी लचीला करने के लिए तय orthodontic उपकरणों के तत्वों के बीच फिट कर रहे हैं । यह curettes जैसे अंय नमूना तरीकों के लिए एक प्रमुख लाभ है । Atraumatic नमूना सरल और डीएनए की छोटी मात्रा का नमूना है संभव है ।

भविष्य अनुप्रयोगों:

इस वीडियो में हमने गैर रोगग्रस्त, शीघ्र, स्थायी दांत पर विधि का प्रदर्शन किया. यह भी मिश्रित या परिपक्व दांत के लिए लागू किया जा सकता है । कुछ रूपांतरों के साथ यह एक ही प्रोटोकॉल का पालन करके दंत सामग्री के कारण दांत या प्रत्यारोपण और अन्य niches की तरह periodontal रोग साइटों के नमूने के लिए संभव है । क्षय अनुसंधान रूट क्षय पर विशेष रूप से अध्ययन में, इस मानकीकृत प्रोटोकॉल से लाभ हो सकता है । हमारे नमूना वीडियो से सबसे महत्वपूर्ण व्याख्यान डेटा तुलनीय बनाने के लिए प्रोटोकॉल का मानकीकरण है, कोई बात नहीं क्या और कैसे नमूने मापा जाता है.भविष्य वीडियो प्रदर्शनों सामांय में नैदानिक नमूना के क्षेत्र में वृद्धि कर सकता है ।

वीडियो में दिखाए गए के रूप में प्राप्त मौखिक फिल्म क्लीनिक में और वैज्ञानिक जांच के लिए प्रयोग किया जाता है । यह vivo में दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है एक अच्छा इसके अलावा करने के लिए इन विट्रो सीटू संकरण और फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी15 में प्रतिदीप्ति के रूप में आणविक तकनीकों । NGS तरीकों, के रूप में यहां दिखाया pyrosequencing, एकत्र की गई फिल्म के लिए आवेदन किया, पूर्ण microbiota के विश्लेषण की अनुमति । कुछ जीवाणु प्रजातियों के सापेक्ष बहुतायत की गणना उपचार का समर्थन करने के लिए या विभिन्न रोगियों या विभिन्न उपचार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक मानकीकृत अनुक्रमण प्रोटोकॉल और अनुक्रम विश्लेषण कार्यप्रवाह है कि हम पहले४०वर्णित के साथ, इस नमूना विधि अनुक्रम विश्लेषण जीनस स्तर के लिए नीचे की अनुमति देता है । इसके अलावा "मेटा"-ऐसे metatranscriptomic या metabolomic अध्ययन के रूप में अध्ययन इस वीडियो में प्रस्तुत नमूना प्रोटोकॉल के आधार पर संभव है ।

महत्वपूर्ण कदम:

दूषण से बचना एक महत्वपूर्ण कदम है: बाँझ उपकरणों vivo वातावरण में एक गैर बाँझ में लागू किया जा करने के लिए है । बेंच के लिए मुंह से स्थानांतरण करने के लिए जल्दी और सुरक्षित रूप से एक अनुभवी परीक्षक द्वारा प्रदर्शन के लिए संभव के रूप में कम अध्ययन प्रतिभागियों के लिए कुर्सी समय रखने के लिए किया है । प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम subgingival sulcus में कागज बिंदु के atraumatic प्रविष्टि है । जंक्शन उपकला के विघटन और रक्तस्राव बिल्कुल से बचा जा करने के लिए है । आगे की देखभाल के क्रम में exogenous डीएनए या आरएनए के साथ कागज अंक और भंडारण शीशियों दूषित नहीं करने के लिए लिया जाना है । भंडारण ही तो एक महत्वपूर्ण कदम भी है. नमूनों पर सीधे जमे रहने की जरूरत है, सबसे अच्छा पर − ८० ° c । इस बैक्टीरियल संरचना पोस्ट नमूना है, जो अनुक्रमण परिणाम कपट होगा में परिवर्तन से बचा जाता है ।

Disclosures

लेखक इस वैज्ञानिक वीडियो उत्पादन से संबंधित ब्याज की कोई संघर्ष रिपोर्ट ।

Acknowledgments

लेखक जोकिम Theussl के लिए आभारी है (चिकित्सा अनुसंधान के केंद्र, वीडियो उत्पादन में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए चिकित्सा विश्वविद्यालय के) और मोनिका Farrell (अनुसंधान प्रबंधन, चिकित्सा चराई के विश्वविद्यालय) आवाज प्रतिभा के रूप में ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

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स्वस्थ बच्चों में Microbiome विश्लेषण के लिए मौखिक फिल्म नमूना
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Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

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