Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Oral Biofilm provtagning för mikrobiomet analys hos friska barn

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

Förändringar i den muntliga mikrobiomet under hela barndomen är av växande intresse. Jämförelse mellan olika mikrobiomet studier visar en brist på standardiserade provtagning protokoll. Begränsat utrymme gör provtagning den sunda subgingival sulcus av barn utmanande. Papper punkt provtagning presenteras här i detalj som metod för val för detta område.

Abstract

Oral biofilm och dess molekylära analys underlag för att undersöka olika odontologisk forskning och kliniska frågor. Kunskap om biofilm sammansättning leder till en bättre förståelse av mekanismerna för cariogenic och periopathogenic. Mikrobiell förändringar som sker i munhålan under barndomen är av intresse för flera skäl. Utvecklingen av barn oral bakterieflora och förskjutningar i dess sammansättning behöver analyseras ytterligare för att förstå och möjligen förebygga uppkomsten av sjukdom. På samma gång behövs fördjupade kunskaper om den naturliga sammansättningen av oral biofilm. Tidiga stadier av karies-gratis permanent tanduppsättning med friskt tandkött ger en allmänt opåverkad subgingival livsmiljö som kan fungera som en i situ baslinjen för att studera funktionerna i oral hälsa och sjukdom. Analys av barns orala biofilmen under olika skeden i livet är således ett viktigt tema i fältet. Moderna molekylära analysmetoder kan ge omfattande information om bakteriella mångfalden av sådan biofilm. För att aktivera bakterieflora data jämförelse, är det viktigt att standardisera varje steg i förfarandet för molekylära data generation. Detta förfarande spänner från klinisk provtagning, Nästa Generation Sequencing (NGS), bioinformatiska databehandling, till taxonomiska tolkning. En av de mest kritiska faktorerna här är biofilm provtagning. Provtagning på barn är ännu mer utmanande i synnerhet på grund av begränsat utrymme i subgingival områden. Således fokuserar vi på användning av papper punkter för subgingival provtagning. Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för oral biofilm provtagning av den subgingivala sulcus, slemhinna och saliv hos barn.

Introduction

Mänskliga oral biofilm består av en bred gemenskap som består mestadels av förknippas och nyttiga mikroorganismer1,2,3. Arter finns här kolonisera alla nischer att munhålan erbjuder4,5,6. Biofilm sammansättning i dessa nischer varierar så mycket som livsmiljöer. Saliv visar till exempel olika bakteriella profiler än plack prover. I plack prover av friska vuxna är det relativa överflödet av Actinobacteria över 20%, medan mindre än 7% återfinns i saliv. Bacteroidetes och Firmicutes visas däremot i mycket högre siffror i saliv7. Det är därför viktigt att prov på olika platser i munnen för att få hela bilden. Dessutom kan gör olika faktorer såsom geografiska och etniska skillnader, ålder, kön och många andra faktorer det svårt att identifiera allmänna regler för biofilm utveckling och sjukdom debut8,9. Utredning av periopathogenic och cariogenic biofilm har under många år varit en central fråga8,10,11,12,13.

Under de senaste åren har forskning på friska försökspersoner fått betydelse inte bara för en bredare förståelse för sjukdomen, men också för genomförandet av förebyggande åtgärder14. Ny teknik och molekylära analyser ytterligare belysa oral biofilm bildning och funktion15,16, och möjliggöra komplett profilering av mikrobiell mångfald17,18. Detta förväntas också leda till en ny förståelse av mikrobiell förändringar under ortodontisk behandling19. En inverkan på utveckling tandreglering biomaterial är förutsebara. Det förbättrade perspektivet kommer att kasta nytt ljus på komplikationer av ortodontisk behandling är associerad med biofilm, såsom emalj demineralization och parodontala sjukdomar12,20,21. För att tillåta worldwide data jämförelser, är det viktigt att standardisera alla steg i data generation. Mindre ändringar i laboratorierutiner kan starkt påverka resultaten. Dessutom, kan användning av varierande computational plattformar i databehandling leda till icke jämförbara datamängder. Slutligen, valet av statistiska tester och korrigeringar har en inverkan på resultaten. Dock provtagning bias kan uppstå redan långt innan några laborationer eller bio-computing påbörjas. Icke-standardiserade provtagningsmetoder leda till en inneboende partisk studie. Med tanke på låga till måttliga halter av standardisering i relevanta studier, det finns lite bevis på förhållandet mellan Ortodonti och microbiomes19. Utvecklingen av standardiserade metoder skulle därför underlätta kvalificerad jämförelse av data i fältet.

Denna artikel presenterar standardiserade oral biofilm provtagningsförfaranden. Protokollet är avsett att bidra till att generera globalt jämförbara samlingar av mikrobiell sekvensdata. Ett steg för steg protokoll för oral biofilm provtagning hos friska barn presenteras. Som metod för val är papper punkter infogade atraumatiskt i den sunda subgingival sulcus. För att underlätta livsmiljö jämförelser, samplas kinden slemhinna enligt samma protokoll. Denna artikel visar dessutom parallellt och poolade provtagning. Dessutom visas saliv provtagning. En enkel färgkodade transport och lagringssystem presenteras också, att underlätta preparatet förvaltning för vidare bearbetning. Valet av downstreamverksamhet avseende lagringsmedium, gjorts analyser och bioinformatik är beroende av de kliniska frågor som olika fält i muntliga forskning. I detta manuskript valts DNA-provtagning för NGS som ett exempel på en eventuell tillämpning för tandreglering forskning.

Protocol

Av styrelsens institutionella granskning av medicinska universitetet i Graz (Votum 27-126ex14/15) godkändes protokollet och videofilmning. Skriftligt samtycke för denna video publikation erhölls från barnet och hennes förälder.

1. instrument och material

  1. Cut kalibrerad (ISO 015/02) och steril paper points, vanligen används i ENDODONTISK behandling, i första ringen-märket för att standardisera sin längd (figur 1).
  2. Använda UV-ljus strålning på 260 nm för 30 min för att undvika DNA och RNA kontaminering av papper (figur 2).
  3. Autoklav rören för lagring vid 120 ° C och 1.2 bar för 20 min och UV-bestråla dem samt eller anställa ready-to-use gamma bestrålat rör.

2. beredning av ämnen

Obs: Erhölls skriftligt informerat samtycke från barnet och hennes förälder före inskrivning i studien.

  1. Applicera på läpparna kakaosmör.
  2. Montera kinden och tungan upprullare för full tillgång till båda dental valv.
  3. Färga placken med plack utlämnande.
  4. Ta bort torra fält apparaten.
  5. Skölj munnen med vatten tills vattnet är färglös.
  6. Borsta tänderna noggrant med en elektrisk tandborste på 45 ° vinkling. Tillämpa vatten bara men ingen tandkräm, som detta skulle förändra den oral biofilmen.
  7. Montera torra fält apparaten igen, inklusive det tunga gardet för att hålla munnen öppen och torr.
  8. Ren och torr index tänderna med sterila tops att undvika absorption av supragingival vätska under papper punkt provtagning.

3. Biofilm provtagning

  1. Papper punkt provtagning av subgingival sulcus
    1. Förstå de papper punkterna med steril pincett för tandvård.
    2. Vill du infoga papper punkter tangentiellt upp för en definierad längd 4 mm. Var särskilt försiktig att inte traumatize Junktional epitel (figur 3).
    3. Ta bort papper pekar efter 20 s.
    4. Samla papper poäng direkt in beredda rören: placera papper punkt spetsen direkt i en steril och DNA-gratis flaska, och skär den i tredje märket till en standardiserad längd av 4 mm (figur 4).
    5. Om indicerat protokollen från studie, infoga två papper punkter parallellt och samtidigt på samma plats (figur 5A).
    6. Alternativt, samla papper Poäng från flera platser om studieprotokollet kräver ”samlingsprover” (figur 5B).
    7. Ta bort torra fält apparaten för slemhinnor och saliv provtagning.
  2. Slemhinnor papper peka provtagning
    1. Tillämpa papper punkter till vestibulära fållan av övre kinden (figur 6).
    2. Nära kinden och massera det kortfattat.
    3. Öppna kinden och ta bort de papper punkterna efter 20 s.
    4. Skär papper punkter vid tredje märket och placera dem i ett sterilt rör som anges för subgingival provtagning.
  3. Saliv provtagning
    1. Låt barnet spotta ostimulerade saliv i en steriliserad uppsamlingskärlet (figur 7).

4 överföring och lagring

  1. Samla papper Poäng som enda, poolade eller parallella prover beroende på studiedesign (figur 8).
  2. Applicera en färgkodad lagringssystem för att underlätta ytterligare prov förvaltningen (figur 9).
  3. Slutligen, lagra proverna på −80 ° C i avvaktan mikrobiomet analys.

Representative Results

I den aktuella publikationen demonstreras DNA-provtagning för NGS som ett exempel på en eventuell tillämpning för tandreglering forskning. Bakteriella DNA extraheras direkt från papper punkt proverna. Detta DNA kan sedan användas i studier av mikrobiella sammansättningen för kliniska eller forskning frågor (som sammanfattas i figur 10).

Moderna molekylära analysmetoder såsom den NGS metod 454-pyrosekvensering ger en överblick av den kompletta bakterieflora ett urval. DNA i tusentals bakterier identifieras samtidigt på olika fylogenetiska nivåer över 16s rRNA sekvens skillnader. Bioinformatiska plattformar behöver genereras som ett sätt att strukturera i kluster informationen Hämtad från de stora datamängder. Statistisk analys kan sedan tillämpas på bakterieflora datamängder.

Det totala relativa överflödet av vissa bakteriearter kan analyseras som kan förskjutningar i bakterieflora på grund av förändrade livsmiljöer villkor. Stapeldiagram (figur 11) och heatmaps (figur 12) visar den subgingivala bakteriell sammansättningen på stam eller beställa nivå. Olika individer och behandlingar kan jämföras av beskrivande och inferential statistik. Figur 13 visar ett histogram jämförelse av två lägen av subgingival papperspoint provtagning på olika taxonomiska nivåer. Tabell 1 visar övergången i biofilm sammansättning under en in vitro- studie som jämförde två tidpunkter (T1 och T3). Statistiskt signifikanta förändringar beräknades med Wilcoxon undertecknat-rank-test och följande Bonferroni korrigering från 454-pyrosekvensering data.

Slutligen, rektor Coordinate analys (PCoA) kan direkt 3D jämförelse på operativa taxonomiska enheten (OTU) nivå som identifieras i olika prover. De PCoA tomterna i figur 14 visar intra - och inter - individual skillnader av den subgingivala mikrobiomet i en case serie av fem barn. Figur 15 visar resultaten av en tandreglering fall-kontroll studie: rosa till röda prickar är fallen är ljust till mörkt blå prickar kontroller, alla samplade upprepade gånger under en period av fyra månader. En tydlig klustring av fallen efter tandreglering ingripande (röda prickar) innebär en förändring i mikrobiomet. Blå prickar, som företräder kontrollgruppen fördelas jämnt.

Figure 1
Figur 1 : Förbereda papper pekar av standardiserade längd. Sterila kalibrerad papper punkter skärs i första ringen märket att standardisera sin längd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Sterilize och gratis paper points från DNA. Standardiserade papper punkter är steriliserade och UV bestrålning i en ren bänk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Subgingival papper punkt införande. Sterila kalibrerad papper punkter infogas tangentiellt i den subgingivala sulcus tills 4 mm ring markeringen för 20 s.

Figure 4
Figur 4 : Skär papper punkt i röret. Direkt efter provtagningen, papper punkter skärs vid tredje ringen mark (4 mm) i en steril och DNA-fria 1,5 mL injektionsflaska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Poolade och parallella provtagning. Två papper punkter infogas samtidigt i den subgingivala sulcus av en tand (A) eller flera papper pekar in i den subgingivala sulci av flera tänder (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Slemhinnor provtagning. Sterila kalibrerad papper punkter läggs in i slemhinnan i vestibulära luckan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Saliv samling. Ostimulerade saliv är spotta i en steril bägare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Stickprovsprogram. Prover kan samlas som singel (vänster sida, en tand varje), poolade (flera till alla ränder i en injektionsflaska) eller parallell (blå ränder, två papper punkter på en tand) prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 : Färgkodade lagring. En hänskjutande färgkod för lakan och injektionsflaskor underlättar ytterligare prov hantering.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10 : Subgingival biofilm analys. Schematisk presentation av kliniska biofilm provtagning (A), DNA-extraktion (B) och olika NGS tekniker (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11 : Stapeldiagram. Visar relativa överflöd av bakterier på stam nivå analyseras med 454-pyrosekvensering. Bild modifierad från Santigli et al. 22 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12 : Heatmap. Visar relativa förekomsten av bakteriell order analyseras med 454-pyrosekvensering. Mörkröd representerar en hög relativ överflöd (> 10%). Mörk blå representerar en mycket låg till ingen relativa överflöd av respektive bakteriell order. Bild modifierad från Santigli et al. 22 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 13
Figur 13 : Histogram. Jämförelse av två lägen papper punkt provtagning (lägena A och B) på olika taxonomiska nivåer. Data som genereras med 454-pyrosekvensering. Bild modifierad från Santigli et al. 22 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 14
Figur 14 : 2D PCoA tomt. En case serie (n = 5) visar inom enskilda och interindividuella skillnader till följd av två subgingival provtagningsmetoder (1 färg är 1 ämne). Data som genereras med 454-pyrosekvensering. Bild modifierad från Santigli et al. 22 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 15
Figur 15 : Ögonblicksbild av en 3D PCoA tomt animation. Visar subgingival mikrobiomet skiftar i en tandreglering fall-kontrollstudie (n = 16; varje grupp, 3 Poäng i tid; fall: rosa till röd, kontroller: ljus till mörk blå). Data som genereras med 454-pyrosekvensering.Opublicerade data från arbetsgruppen Santigli. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Grupp: Bacteriae Tidpunkt 1 [%] Tidpunkt 3 [%] Wilcoxon undertecknat-rank-test
Stam/släkte 25 Median 75: e 25 Median 75: e p-värde p-värde justerat #
Andra
Andra 0,70 1,07 1.28 1,32 1.63 1,93 .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces 0.00 0,04 0,13 0,06 0,30 0,97 .001 .021
Rothia 0.00 0.00 0,05 0.00 0,13 0,32 .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0.00 0,01 0,22 0,15 1,02 2,44 .000 .006
Firmicutes
Andra (baciller) 0.00 0,01 0,06 0.00 0,04 0,10 .706 1.000
Staphylococcus 0.00 0,01 0,12 0.00 0,07 0,17 .548 1.000
(Gemellaceae) 0.00 0.00 0,07 0,12 0,77 1.24 .005 .091
(Lactobacillales) 0.00 0.00 0,04 0.00 0,12 1,50 .004 .073
Granulicatella 0,09 0,23 0,37 0,64 1,59 2.28 .000 .003
Lactobacillus 0.00 0.00 0,18 0.00 0.00 0,04 .700 1.000
Andra (Streptococcaceae) 0.00 0,04 0,13 0.00 0,10 0,19 .768 1.000
(Streptococcaceae) 0,04 0,10 0,23 0,12 0,37 0,69 .005 .083
Streptokocker till 53,42 61.96 88.38 48,44 60.83 73.97 .055 .930
Andra (Lachnospiraceae) 0.00 0.00 0,01 0.00 0.00 0,11 .003 .058
Dialister 0.00 0.00 0,04 0.00 0.00 0,04 .240 1.000
Veillonella 3.43 27.15 42.78 6,69 13,38 27,05 .157 1.000
Proteobacteria
Haemophilus 0.00 0.00 0,03 0,31 0.84 2,38 .000 .008
#p-värde Wilcoxon undertecknat-rank test justerat enligt Bonferroni korrigering
En p < 0,0026 ansågs betydande

Tabell 1: Statistisk analys. Skillnader i den muntliga mikrobiomet av friska barn vid två punkter i tid. Data som genereras med 454-pyrosekvensering. Bild modifierad från Klug o.a. 23

Discussion

Bakterier finns på alla platser inom munhålan24,25,26. Många studier har fokuserat på användningen av saliv som provtagning medium att mappa muntliga kolonisering som det enkelt kan avsmakas genom spotta27,28,29,30,31, 32. Saliv biofilm återspeglar dock inte subgingival biofilm sammansättning. Således, användningen av andra provtagningsmetoder är avgörande för att skapa hela bilden, och kommer att framkalla nya diskussioner i odontologisk forskning. Flera artiklar jämföra användningen av Skrapningarna och paper points för subgingival provtagning av periodontally sjuka försökspersoner8,33,34. Ännu är ingen forskargrupp känt för att ha fokuserat på tillämpningen av standardiserad provtagning enheter för olika åldersgrupper, särskilt för barn19.

I det här videoklippet presenteras oral biofilm provtagning av tre muntliga livsmiljöer i friska barn.

Modifieringar och felsökning:

Syftet med manuskriptet fokuserar på det kliniska protokollet för subgingival biofilm provtagning av friska barn. Metoden för val avser ljud subgingival sulci där begränsat utrymme gör provtagning särskilt utmanande. I denna video var metoden tillämpas tidiga permanent tanduppsättning. Det kan också användas till blandade eller mogen tanduppsättning och till barn eller vuxna. Våra urvalsmetoden möjliggör ändringar, till exempel enkel eller poolade prover. Denne kan bli en avgörande faktor för molekylära analyser på grund av den lilla mängden DNA indrivningsbar från den friska subgingival sulcus. Valet av index tänderna kan ändras på begäran; i synnerhet, kanske en annan tand urvalet som ett alternativ när epitelet är traumatiserade och blödande, vilket gör papperspoint oanvändbar. Parallella provtagning med två papper pekar samtidigt på en plats gör provet replikat i ett steg, förutom förkorta tiden stol för barn.

Diseased parodontala fickor kan provtas med smärre ändringar. Här kommer papper punkter måste införas till fickan, som kan nå upp till 10 mm full längd. Längd och conus papper punkter samt djupet av införande måste anpassas till den intraorala livsmiljöen av intresse, men bör alltid standardiseras av material och dimensioner. Prover kan också tas från slemhinnan med hjälp av papper punkter. Identiska protokoll tillåter jämförelser av olika muntliga livsmiljöer och olika dentala material. Patientförberedelse och förvaringen kan utföras som beskrivs i den här videon. För metatranscriptome forskning, kunde RNA provtas med samma metod. Efter provtagningen, bör således papper punkter införas direkt i RNA stabilisering lösning.

Begränsningar av tekniken:

Oavsett ändringar är kliniska urvalsmetoden beskriver vi begränsad till sund subgingival sulcus. Inte ingick andra provtagningspunkterna, som för anföra som exempel periodontally sjuka fickor, i vår studiedesign. Som provtagning på hela djupet av sådan fickor behövs, kanske papper punkter inte tillräckligt stor för att samla in prover tillräckligt. Om den experimentella mål är att jämföra data från sund subgingival sulci och periodontally sjuka fickor, är det viktigt att vara medveten om den inneboende bias som associeras med olika kliniska provtagningsmetoder. Det är därför inte lämpligt att jämföra sådana uppgifter.

En begränsning av den metod som presenteras här provtagning utan efterföljande användning av propidium monoazide. Lägga till denna agent direkt efter provtagningen möjliggör specifik analys av endast levande celler i den biofilm som analyseras. Urvalsmetoden beskrivas här återspeglar antalet levande och döda celler. För forskning av allvarlig parodontit, kommer papper punkter förmodligen behöva ersättas med skrapningarna, som biofilm bildning i djupa fickor är stark. Papperspoint provtagning inte kanske återspeglar hela mikrobiell spektrumet i dessa fall som deras yta kan vara mättad för snabbt.

Betydelse med avseende på befintliga metoder:

Föreslagna manuskriptet är först i sitt slag att standardisera subgingival provtagning i den friska sulcus med papper poäng. Andra rapporter har avses användning av metall skrapningarna35,36 eller papper pekar 37,38,39, men inte beskriva de processer som äger rum före provtagningen, sådana plack kontroll, rengöring av tand, tand isolering och torkning, samt processerna som följd av otillräckliga specifikationer på provtagningsledningarna teknik och tid.

I två tidigare artiklar visar vi att användningen av papper punkter är en reproducerbar metod för subgingival biofilm provtagning i barn22,40. På grund av deras design är skrapningarna för stor för den grunda sulcus med begränsat utrymme och för skarp för anbud Junktional epitel. Det är viktigt att komma åt den subgingivala sulcus utan traumatizing epitel. På detta sätt undviks bias uppkommer blödningar. Användning av slim och anbud papper pekar alltså föredra för detta område. Papper är funktionell för att övervaka förändringar i biofilm sammansättning under tandreglering21,41. De är smal och tillräckligt flexibel för att passa mellan elementen i fasta ortodontiska hjälpmedel. Detta är en stor fördel till andra provtagningsmetoder som skrapningarna. Atraumatiska provtagning är förenklad och provtagning av små mängder DNA är möjligt.

Framtida tillämpningar:

I denna video visat vi metoden på icke-sjuka, tidig, permanent tanduppsättning. Det kan också tillämpas på blandade eller mogen tandbildning. Med vissa anpassningar är det möjligt att prova periodontally sjuka sajter som tänder eller implantat och andra nischer på grund av dentala material genom att följa samma protokoll. Karies forskning kunde dra nytta av detta standardiserade protokoll, särskilt undersökningar på roten karies. Den viktigaste föreläsningen från vår provtagning video är standardisering av protokollen att göra uppgifterna jämförbara, oavsett vad och hur prover mäts.Framtida videodemonstrationer kunde förbättra fältet klinisk provtagning i allmänhet.

Oral biofilm framställs som visas i videon används på kliniker och för vetenskapliga undersökningar. Detta in vivo -Metod utgör ett bra komplement till in vitro- molekylära tekniker såsom fluorescens i situ hybridisering och confocal microscopy15för laserscanning. NGS metoder, möjliggör som de pyrosekvensering som visas här, tillämpas på de insamlade biofilmen, analys av den fullständiga bakterieflora. Beräkning av de relativa förekomsten av vissa bakteriearter kan användas för att stödja behandlingar eller att jämföra olika patienter eller olika behandlingar. Tillsammans med en standardiserad sekvensering protokoll och sekvens analys arbetsflöde att vi tidigare har beskrivit40, här urvalsmetoden tillåter sekvensanalys slutmottagarnivå släkte. Ytterligare ”meta”-studier såsom metatranscriptomic eller metabolomiska studier är möjligt baserat på protokollet provtagning som presenteras i denna video.

Kritiska steg:

Att undvika kontaminering är ett kritiskt steg: sterila instrument måste tillämpas i en icke-sterila i vivo -miljö. Överföringen från munnen till bänken måste utföras snabbt och säkert av en erfaren examinator att hålla stol tiden för studiedeltagare så kort som möjligt. Det mest kritiska steget i protokollet är atraumatiska införandet av papper pekar in i den subgingivala sulcus. Störningar av Junktional epitelet och blödning absolut måste undvikas. Ytterligare försiktighet måste vidtas för att inte förorena papperet punkter och förvaring flaskor med exogent DNA eller RNA. Själva lagringen sedan är också ett viktigt steg. Prover måste frysas direkt, i bästa −80 ° C. Detta undviker förändringar i bakteriell sammansättning post stickprovsundersökningar, som skulle förfalska sekvensering resultat.

Disclosures

Författarna rapportera inga intressekonflikter som relaterade till detta vetenskapliga videoproduktion.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma att Joachim Theussl (Center för medicinsk forskning, medicinska universitetar av Graz) för utmärkta tekniska bistånd i video produktionen och Monica Farrell (forskning Management, medicinsk universitetar av Graz) som röst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
Oral Biofilm provtagning för mikrobiomet analys hos friska barn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter