Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

في المختبر البلعمه حطام المايلين التي الضامة المشتقة من نخاع العظام

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

نقدم أساليب لتقييم قدرة متجولة الضامة مورين الأولية المشتقة من نخاع العظم استخدام الحطام المسمى فلوريسسينتلي المايلين وتلطيخ الحبرية داخل الخلايا الدهنية.

Abstract

المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) هي الكريات البيضاء الناضجة التي تخدم دور حاسم فسيولوجية البالعات المهنية قادرة على مسح مجموعة متنوعة من الجسيمات. عادة، يتم تقييد بمدمس من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ولكن بعد إصابة، سهولة التسلل. مرة واحدة داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي المصابين، بمدمس هي نوع الخلية الابتدائية المسؤولة عن الإزالة الحطام الخلوية المستمدة من الأذى، بما في ذلك كميات كبيرة من الحطام المايلين الغنية الدهن. تداعيات لاثيل بمدم التسلل والمايلين البلعمه الحطام داخل الجهاز العصبي المركزي معقدة وليست مفهومة جيدا. تسمح البروتوكولات المذكورة هنا، لدراسة مباشرة في المختبر من بمدمس في سياق إصابة الجهاز العصبي المركزي. نحن تغطي مورين بمدم العزلة والثقافة وإعداد الحطام المايلين، وفحوصات لتقييم بمدم المايلين الحطام البلعمه. هذه التقنيات إلى نتائج قابلة للقياس الكمي قوية دون الحاجة إلى معدات متخصصة هامة أو المواد، ولكن يمكن تخصيصها بسهولة لتلبية احتياجات الباحثين.

Introduction

المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) حلقة وصل هامة بين نظم المناعة الفطرية والتكيف. مستضد تقديم الخلايا (Apc)، يمكنهم الاتصال مع الخلايا الليمفاوية عن طريق عرض كل مستضد وسيتوكين الإصدار1،،من23. ومع ذلك، وظيفتها الأساسية البالعات المهنية، لمسح مسببات الأمراض، والذين تتراوح أعمارهم بين الخلايا والحطام الخلوية1،4. بعد إصابة حبل الشوكي (علوم)، يتم إنشاء كميات كبيرة من الحطام المايلين من oligodendrocytes يحتضر، نوع الخلية مسؤولة عن الجهاز العصبي المركزي إكسون مييلينيشن5. نحن وآخرون أظهرت أن إزالة الحطام المايلين تقع أساسا على عاتق من التسلل إلى بمدمس5،،من67. ومع ذلك، ضمن إصابات النخاع الشوكي قد اقترح الإحاطة مواقع الحطام المايلين إزاحة هذه الخلايا للالتهابات عادة نحو8،5،دولة برو تحريضية9. وتعتبر بمدمس الوسطاء الرئيسيون لالتهاب الأعصاب في الحبل الشوكي المصاب، أهداف السريرية الهامة.

للمساعدة في التحقيق في تأثير بمدمس في الحبل الشوكي المصاب، قمنا بتطوير نموذج في المختبر لمباشرة دراسة كيفية الاستجابة بمدمس للحطام المايلين. تحسين أهمية بيولوجية، تستخدم كل من بمدمس مورين الأولية والحطام المايلين طازجة معزولة في هذه التحقيقات. على هذا النحو، بالتفصيل الأساليب المعروضة هنا أيضا بالعزلة وثقافة بمدمس موريني الأولية، وأسلوب تدرج سكروز معدلة المستخدمة لعزل الجهاز العصبي المركزي موريني المستمدة المايلين الحطام10،،من1112. الحطام المايلين يمكن أن توصف بسهولة مع صبغة فلورسنت، إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين (CFSE)، إلى المسار في استيعاب بمدمس. كفسي هو مناسبة تماما لهذا التطبيق لأنه غير-السامة للخلايا، ولها تصاريح الطيف الفلورسنت ضيقة الإرسال المتعدد مع غيرها الفلورسنت يسبر13،14. بعد البلعمه، تنقل عن طريق ليسوسوميس الدهون الحطام المايلين والمعلبة كمحايد الدهون داخل الخلايا الدهنية قطرات5. لتحديد مقدار هذا التراكم داخل الخلايا الدهنية، نقدم النفط الأحمر يا (أورو) تلطيخ الأسلوب الأمثل لتحليل الصورة الكمية. ينتج هذا الأسلوب المصبوغة بسيطة النتائج استنساخه قوية وتقدير حجم15. هذه الطرق تسهيل دراسة الحطام المايلين البلعمه والدهن الاحتفاظ مع محدودية المعدات المتخصصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الأساليب الموصوفة هنا وفي القسم 2 وافق عليها "رعاية الحيوان فلوريدا دولة جامعة المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) والمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، الطبعةال 8 . جميع الحيوانات المستخدمة في هذا في هذا البروتوكول هي البيت في منشأة حيوانات مختبرية مخصصة حتى الاستخدام. وكان لا التجريب في فيفو السابقة المنجزة للتضحية. إعداد الحيوانات استندت إلى ضرورة تجريبية باستخدام متوسط الخلية ومجموعات المايلين كدليل من أجل الحد من استخدام.

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول توليد الضامة المشتقة من نخاع العظم (بمدمس) (الجزء 1)، إعداد الحطام المايلين المستمدة من الدماغ المسمى فلوريسسينتلي (الفرع 2)، الإجراء العام لتحليل المايلين الحطام البلعمه (الفرع 3)، و الإجراء العام لتحليل تراكم الدهن الحطام المايلين (القسم 4). يجب أن يكتمل إعداد كاشف وحصاد الخلية والتلاعب وجمع المايلين ووسم وأداء الفحص في السلامة الأحيائية تدفق الهواء الصفحي مجلس الوزراء.

1-توليد الضامة الأولية المستمدة من نخاع العظام

  1. إعداد بلعم كاملة الثقافة المتوسطة (كمكم)
    ملاحظة:     جيل بلعم من نخاع العظام يتطلب استخدام عامل تحفيز مستعمرة بلعم (م-CSF). ويستخدم هذا الإعداد L929 مورين تنتجها الخلايا الليفية مكيفة وسائل الإعلام كمصدر للخدمات القطرية م.
    1. توليد L929 مورين تنتجها الخلايا الليفية مكيفة وسائل الإعلام بتثقيف الخلايا في أطباق 145 مم مع 50 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم ارتفاع الجلوكوز (4500 مغ/لتر لتر-الجلوكوز) دولبيكو) تستكمل مع 5% مصل العجل المولود الجديد (سي إس) والبنسلين/ستربتوميسين لمدة 7 أيام.
    2. جمع وسائل الإعلام من الثقافات إلى 50 مل الأنابيب المخروطية أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 3500 x ز، 4 درجة مئوية.
    3. تصفية سوبيرناتانتس من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي جديدة. ويمكن تخزين الوسائط مكيفة في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    4. إضافة إلى ارتفاع الجلوكوز دميم، 5% المجلد/المجلد سي إس، 15% المجلد/المجلد L929 موريني تنتجها الخلايا الليفية مكيفة دميم، و 1% البنسلين/ستربتوميسين. يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أشهر. الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. مجموعة من خلايا نخاع العظام الأولية وتحريض بلعم
    ملاحظة: استخدام الماوس واحد هذا البروتوكول سوف تولد حوالي 20 مليون المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس).
    1. Euthanize العدد المطلوب من الأسبوع 8-10 الفئران القديمة باستخدام المبادئ التوجيهية الموحدة للخنق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. تطهير الحيوان باستخدام 70% إيثانول (المجلد/المجلد): ح2س، وتشبع الفراء.
    3. قص فتحه صغيرة في البطن وسحب الجلد لتكشف عن الأنسجة الكامنة بعناية. الحرص على عدم ثقب التجويف الصفاقى.
    4. قم بإزالة كلا الخلفيتين بدءاً من الورك وتنتهي في الكاحل. مكان الأنسجة التي تم جمعها في طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على 5-10 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتستكمل مع 1% البنسلين/ستربتوميسين.
      ملاحظة: عند تجهيز العديد من الحيوانات تأكد للحفاظ على الأطباق على الجليد للحد من تدهور الأنسجة.
    5. إزالة العضلات والنسيج الضام من العظام باستخدام مشرط. عظم الفخذ والساق فقط تستخدم لجمع الخلايا، يمكنك تجاهل الشظية.
    6. كشف تجويف نخاع العظام التي تم جمعها عن طريق قطع جزء صغير من كل نهاية مع مشرط.
    7. باستخدام إبرة ز 25، تدفق تجاويف نخاع مع كمكم في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. سوف تظهر العظام بيضاء مرة واحدة وقد تم مسح بما فيه الكفاية.
    8. وبمجرد الانتهاء من جمع، تحرض تبين مع إبرة ز 18 ل 30-90 s إنشاء تعليق خلية مفردة.
      ملاحظة: ويمكن تنفيذ خطوة تحلل اختياري من خلايا الدم الحمراء (RBC) عند هذه النقطة. قد اقترح مؤخرا أن محتوى الحديد داخل الخلايا قد تؤثر على آثار الحطام المايلين على بلعم الاستقطاب16. للحصول على معلومات بشأن إدراج خطوة تحلل ربك الرجوع إلى تروبلين وآخرون. 17.
    9. تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية عقيمة 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي جديدة.
    10. البذور التي جمعت الخلايا بالتساوي إلى 145 مم خلية ثقافة الأطباق التي تحتوي على 15-20 مل كمكم. استخدم حوالي ثلاثة أطباق الثقافة الواحدة والتضحية بالماوس. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    11. بعد 72 ساعة من غسل الأطباق مرة واحدة مع PBS العقيمة لإزالة الخلايا غير ملتصقة، ثم إضافة 15-20 مل كمكم الطازجة. احتضان الثقافات لمدة 4 يوما إضافيا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. بعد 7 أيام من مجموع الثقافة، سوف تكون الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام في البداية عزل بمدمس الناضجة (الشكل 1).

2-جيل حطام المسمى فلوريسسينتلي المايلين المستمدة من الدماغ

ملاحظة: يمكن تخزين جميع المواد الكاشفة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

  1. إعداد الكواشف جمع الحطام المايلين
    1. إعداد Tris· Cl المخزن المؤقت الحل.
      1. إلى 800 مل مقطر منزوع ح2س (دية2س) إضافة 20 مل من 1 م Tris· Cl، مل الأس الهيدروجيني 7.45 (تركيز النهائي 20 مم) و 20 مم 100 غ2يدتا (تركيز نهائي 2 مم).
      2. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.45. ضبط حجم الصوت إلى 1000 مل بدية2تصفية O. الحل عن طريق وحدة ترشيح 0.2 ميكرون.
    2. تحضير محلول السكروز 1 متر.
      1. إلى 100 مل Tris· Cl المخزن المؤقت الحل، أضف ز 68.46 السكروز. ضبط حجم الصوت إلى 200 مل مع Tris· Cl المخزن المؤقت الحل. تصفية الحل عن طريق وحدة ترشيح 0.2 ميكرون.
    3. إعداد 200 مل محلول السكروز 0.32 M بتمييع الحل م 1 مع Tris· Cl المخزن المؤقت الحل 0.83:0.16 (المجلد/المجلد).
    4. إعداد 150 مل محلول السكروز 0.83 م بتمييع الحل م 1 مع Tris· Cl المخزن المؤقت الحل 0.83:0.16 (المجلد/المجلد).
  2. جمع الحطام المايلين الخام المستمدة من الدماغ
    ملاحظة: جمع الأسلوب الموصوفة هنا لعزل الحطام المايلين الخام.
    1. Euthanize الفئران 10-12 8-10 أسابيع عمر استخدام CO2 الخنق المبادئ التوجيهية الموحدة متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. تشريح الأدمغة ووضعها في طبق 100 ملم التي تحتوي على 10 مل محلول السكروز 0.32 م.
يبقى الطبق على الجليد.
  • استخدام مقص الجراحية المعقمة قص العقول إلى قطع حوالي 5 مم3 في الحجم.
  • نقل الأنسجة إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وإضافة حوالي 30 مل محلول السكروز 0.32 م.
  • تجانسه مع الخالطون روتاري اليد عقيمة، حتى يتم تحقيق حل سلس.
  • تمييع العقول المتجانس لوحدة تخزين نهائي 90 مل مع محلول السكروز 0.32 م.
  • لستة 38.5 مل ultracentrifuge البوليبروبيلين رقيقة الجدران أنابيب، بإضافة 20 مل محلول السكروز 0.83 م.
  • إضافة حل المخ المتجانس بلطف إلى الأعلى من محلول السكروز 0.83 متر، مع الحرص على عدم خلط الطبقتين.
  • تحقيق التوازن بين كل أنبوبة مع محلول السكروز 0.32 م.
  • أجهزة الطرد المركزي في س 100,000 ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام مناسب قبل تبريده دوار أولتراسينتريفوجي. تعيين تسريع الدوار والتباطؤ إلى القيم الدنيا الحد من فقدان المايلين الحطام.
  • جمع الحطام المايلين من واجهة كثافات السكروز اثنين.
    ملاحظة: الحطام يجب أن تظهر كعصابة بيضاء نحو المركز الأنبوبة.
  • الجمع بين الأنقاض المايلين الخام في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وضبط مستوى الصوت إلى ما يقرب من 35 مل باستخدام Tris· Cl المخزن المؤقت الحل.
  • مجانسة الحطام المايلين الخام مع الخالطون روتاري اليد عقيمة ل 30-60 ثانية.
  • تقسم بالتساوي بتعليق بين 6 ultracentrifuge تنظيف الأنابيب والتوازن مع حجم مناسب من Tris· Cl المخزن المؤقت الحل.
  • أجهزة الطرد المركزي في س 100,000 ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام مناسب قبل تبريده دوار أولتراسينتريفوجي. تعيين تسريع الدوار والتباطؤ إلى قيمها كحد أقصى.
  • كما الآن ستكون مرئية الكريات البيضاء الصلبة، تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الكريات في 10-15 مل Tris· Cl المخزن المؤقت الحل.
  • تقسم بالتساوي التعليق بين 2 ultracentrifuge تنظيف الأنابيب والتوازن مع حجم مناسب من Tris· Cl المخزن المؤقت الحل.
  • أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في س 100,000 ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام مناسب قبل تبريده دوار أولتراسينتريفوجي. تعيين تسريع الدوار والتباطؤ إلى قيمها كحد أقصى.
  • تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات في 5-6 مل PBS العقيمة وتقسيم التعليق بين عدد مناسب من أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي قبل وزنه 1.5 مل.
  • أجهزة الطرد المركزي في 22,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  • تجاهل المادة طافية وتحديد وزن الكريات الحطام المايلين.
  • إعادة تعليق الكريات في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 100 ملغ/مل.
    ملاحظة: أدمغة عشرة إلى اثني عشر بما فيه الكفاية لإنتاج 10-15 مل حطام المايلين 100 ملغ/مل. يمكن أن يكون الحطام المايلين مخزن في-80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  • المايلين الحطام وسم نيون
    1. إعداد 50 ميكرون كاربوكسيفلوريسسين سوكسينيميديل إستر (CFSE) الحل فورا قبل الاستخدام.
      1. باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، تمييع حل أسهم 5 مم من كفسي أعد مع 100% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لتركيز عمل نهائي من 50 ميكرومتر.
      2. تصفية الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون.
    2. ذوبان الجليد المبلغ المطلوب من 100 مغ/مل المايلين الحطام وإعادة تعليق بإبرة معقمة ز 29.
      ملاحظة: تجميد الحطام المايلين يؤدي إلى الانقطاع عن الحل يتطلب استثارة قبل الاستخدام.
    3. نقل الحطام المايلين إلى أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي قبل وزنه 1.5 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 14,800 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    5. ريسوسبيند الحطام المايلين في 200 ميليلتر لحل كفسي الواحد 100 ميليلتر المايلين الحطام القريبون.
    6. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) محمية من الضوء.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 14,800 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    8. ريسوسبيند بيليه في 600-800 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.2 ميكرون فلتر تعقيم 100 مم جليكاين في برنامج تلفزيوني).
    9. أجهزة الطرد المركزي في 14,800 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    10. كرر الخطوات 2.3.8-2.3.9 أكثر من مرتين.
    11. وبعد الغسيل النهائي، تحديد وزن بيليه الحطام المايلين وتعليق إعادة إلى 100 مغ/مل مع PBS العقيمة.
      ملاحظة: يمكن الحطام المسمى المايلين مخزن في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

    • 3-المايلين الحطام البلعمه الإنزيم

    ملاحظة: ما يلي هو الطريقة الأساسية لمراقبة البلعمه حطام المسمى فلوريسسينتلي المايلين. بالإضافة للعلاج والظروف التجريبية الأخرى ستحتاج إلى تكون الأمثل من قبل المحقق.

    1. إعداد لوحات العلاج
      1. لكل لوحة 145 مم، جمع بمدمس ناضجة في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل مل 5-6 من 10 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) باستخدام في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) (الرقم الهيدروجيني 7.4).
        ملاحظة: لا تستخدم التربسين كما أنها قد تغير حالة تنشيط الخلايا18.
      2. إضافة وحدة تخزين متساوية من كمكم المعالجون مسبقاً لكل أنبوبة من الخلايا التي يتم جمعها.
      3. أجهزة الطرد المركزي في 180 x ز لمدة 8 دقائق في 20 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية.
      4. إعادة تعليق الخلايا في كمكم والعد.
      5. لكل بئر من لوحة الثقافة خلية 24-حسنا، إضافة 1 × 105 خلايا في 1 مل كمكم.
      6. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 ل 24 ساعة.
    2. العلاج الحطام المايلين والتحليل
      1. إضافة 10 ميليلتر من 100 مغ/مل كفسي المسمى الحطام المايلين لكل بئر (تركيز 1 ملغ/مل النهائي).
      2. احتضان لمدة 1-3 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
      3. أغسل لوحة 3 مرات مع PBS العقيمة لإزالة الحطام غير اجتاحت المايلين.
      4. إضافة 400 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
      5. أغسل لوحة 2 مرات مع PBS العقيمة.
      6. إضافة 400 ميليلتر من هويشت 33258 الحل لكل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت محمية من الضوء.
      7. غسل الأطباق 2 مرات مع PBS العقيمة.
      8. إضافة 200 ميليلتر من جل مخفضات مع تريس المخزن المؤقت لكل بئر للحد من فوتوبليتشينج.
      9. صورة الخلايا باستخدام مجهر قادرة على مقلوب برنامج التحصين الموسع-فلوري.
        ملاحظة: هي موجات الإثارة والانبعاثات من كفسي 494 نانومتر و 521 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي.
      10. القسمة عدد الخلايا إيجابية كفسي عدد الأنوية لتحديد امتصاص الحطام المايلين النسبية.
      11. قبل التصوير، والحفاظ على لوحات لمدة تصل إلى 7 أيام في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

    4-التحديد الكمي للدهون داخل الخلايا عن طريق النفط تلطيخ الأحمر-O

    ملاحظة: ما يلي هو الطريقة الأساسية لمراقبة الدهون داخل الخلايا المستمدة من الحطام المايلين.لا ينصح استخدام كفسي المسمى الحطام المايلين نيون التقدير الكمي لاورو تلطيخ بسبب التداخل الطيفي. بالإضافة للعلاج والظروف التجريبية الأخرى ستحتاج إلى تكون الأمثل من قبل المحقق.

    1. إعداد تلطيخ الحلول
      1. إعداد الحل المصبوغة النفط الأحمر-O (أورو) 0.5%.
        1. إضافة 100 مل من 100% بروبيلين غليكول (1، 2-بروبانيديول) ببطء إلى 0.5 غرام الذهب (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) أثناء التحريك.
        2. الحرارة الحل عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، أو حتى يتم حل جميع الجزيئات الكبيرة.
          ملاحظة: لا حرارة أكثر من 100 درجة مئوية.
        3. تصفية الحل عن طريق قطعة من ورق الترشيح في حين لا يزال حارا في حاوية جديدة.
        4. السماح بحل للمبيت بارد في حل الرايت يمكن تخزينها لمدة تصل إلى سنة واحدة في الرايت
      2. إعداد حل 85% بروبيلين غليكول.
        1. إضافة مل 85 من 100% بروبيلين غليكول إلى 15 مل دية2إثارة O. حتى مختلطة. حل يمكن تخزينها لمدة تصل إلى سنة واحدة في الرايت
    2. إعداد لوحات العلاج
      1. إعداد لوحة 24-كذلك اتباع الطريقة المبينة في الفرع 3.
      2. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 ل 24 ساعة.
    3. العلاج الحطام المايلين
      1. إضافة 10 ميليلتر من الحطام المايلين 100 مغ/مل لكل بئر (تركيز 1 ملغ/مل النهائي).
      2. احتضانها ح 1-3 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
      3. أغسل لوحة 3 مرات مع PBS العقيمة لإزالة الحطام المايلين غير هضمها.
        ملاحظة: عند هذه النقطة، لوحات يمكن الخضوع أما للتثبيت الفوري أو كمكم جديدة يمكن أن تضاف، والخلايا وعاد إلى حضانة للنقاط الزمنية الإضافية.
      4. إضافة 400 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
      5. أغسل لوحة 2 مرات مع برنامج تلفزيوني ثم بروكسيد لتلطيخ العقيمة.
    4. تلوين أورو والتحليل
      1. أغسل لوحة ثابتة 3 مرات بدية2o.
      2. إضافة 400 ميليلتر من جليكول 100% لكل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
        ملاحظة: هذا سوف يقلل من ترحيل دية2o.
      3. نضح البروبيلين غليكول وإضافة 400 ميليلتر من حل أورو لكل بئر.
      4. احتضان لمدة 8 دقائق في 60 درجة مئوية.
      5. نضح الحل أورو. ثم إضافة 400 ميليلتر من 85% بروبيلين غليكول لكل بئر واحتضانها مينومينتيس 5 في الرايت
      6. لوحة الغسيل 3 مرات مع دية2o.
      7. إضافة 400 ميليلتر من هويشت 33258 الحل لكل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت، محمية من الضوء.
      8. غسل الأطباق 2 مرات مع PBS العقيمة.
      9. إضافة 200 ميليلتر من جل مخفضات مع تريس المخزن المؤقت لكل بئر.
      10. صورة الخلايا باستخدام مجهر قادرة على مقلوب برنامج التحصين الموسع-فلوري. يمكن تصويرها أورو باستخدام تصفية مجموعة قياسية تكساس الأحمر أو دسريد.
      11. التحديد الكمي للاحتفاظ بالدهن النسبي بتحديد منطقة أورو إيجابية في كل حقل صورة وتقسيمه بعدد الأنوية.
      12. الحفاظ على لوحات لمدة 7 أيام في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    علاج بمدمس مع كفسي المسمى الحطام المايلين ينبغي أن تسفر عن استيعاب واضح (الشكل 2). في حين وقت تفاعل 3 ساعات غير كافية من أجل بمدمس البلعمه الحطام المايلين وأضاف كافية للكشف عن المصب قوية، يمكن ملاحظة تراكم داخل الخلايا مع أقل من 1 ساعة للتفاعل. ومع ذلك، بعض الحطام المايلين قد يكون موجودة على سطح الخلية بعد الغسيل. قد يكون هذا بسبب الغسيل غير كافية، أو جسيمات لا يجري استيعابه تماما خلال المراحل المبكرة من البلعمه.

    بينما يمكن استيعاب بمدمس سرعة الحطام المايلين، مطلوب تجهيز الليزوزومية قبل شكل قطرات الدهن المستدامة أورو. إلى إثبات، كانت بمدمس المحتضنة مع الحطام المايلين لمدة 90 دقيقة وغسلها ومثقف لكميات إضافية من الوقت قبل التثبيت وتلطيخ (الشكل 3). ويبين الشكل 4 هناك تأخير بين بدء المعاملة والمظهر الدهني محايدة. كما تجدر الإشارة إلى أن الاحتفاظ بالدهون ليست مستقرة خلال الثقافة. سوف تبدأ بمدمس على استقلاب الدهون المتراكمة قريبا بعد تشكيل الحبرية. على هذا النحو، نوصي بالانتظار لم يعد أكثر من 24 ساعة بين الحطام بعيداً المايلين غير اجتاحت الغسيل والتثبيت.

    التحديد الكمي لاورو الملون المنطقة يوضح معدل الأيض الدهني المايلين في بمدمس (الشكل 5). بعد فترة تفاعل 90 دقيقة، أعيدت خلايا للحضانة في كمكم الطازجة. خلال الفترة المبكرة تشيس في المتوسط الطازجة، استقلاب بمدمس المكون الدهني الحطام المايلين فاجوسيتوسيد إلى الدهون المستدامة أورو محايدة. زيادة مطردة في منطقة أورو الإيجابي نموذجي في الساعات التالية للتفاعل. بعد 24 ساعة بيد بمدمس سوف يكون افلوكسيد أو استقلاب جزء كبير من الدهون داخل الخلايا.

    Figure 1
    الشكل 1 : الممثل الثقافات بمدم. وسيتبع في البداية بعض الخلايا ملتصقة. في يوم 3، تتم إزالة أي من الخلايا غير ملتصقة. قبل 7 يوم، لوحظت الضامة الناضجة المشتقة من نخاع العظام. الحجم = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    الشكل 2 : صور الممثل بمدم المايلين الحطام البلعمه الاعتداء. الخلايا تعامل مع 1 ملغ/مل كفسي المسمى المايلين الحطام لمدة ساعة قبل الغسيل والتثبيت مع 4% منهاج عمل بيجين. يمكن تصور الحطام المايلين المدخلة باستخدام مجموعات التصفية بروتينات فلورية خضراء القياسية على مجهر فلوري برنامج التحصين الموسع قادرة على. الحجم = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3 : الرسم التخطيطي للنفط س أحمر (أورو) تصميم تجريبي- بمدم تعامل مع الحطام المايلين 1 ملغ/مل (تخفيف 1: 100) لمدة 90 دقيقة، تليها الغسيل والثقافة في المتوسط الطازجة قبل التثبيت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 4
    الشكل 4 : تلطيخ أورو من بمدم عقب المايلين الحطام البلعمه. التالي للتثبيت مع 4% منهاج عمل بيجين في الوقت المشار إليه-النقاط، بمدمس كانت ملطخة باورو وهويشت 33258. تظهر الصور التمثيلية لكل الوقت نقطة. الحجم = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 5
    الشكل 5 : تحليل الصورة الكمية لتلطيخ أورو- للتحديد الكمي لاورو تلطيخ، تم تصويرها 3 آبار في 20 X مع الصور 5 كل بئر. وكانت كافة إعدادات اقتناء الصورة متطابقة. أشرطة الخطأ = sem. (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    استخدام الإجراءات المذكورة هنا CNS الخام الطازج معزولة المايلين الحطام والضامة الأولية المستمدة من نخاع العظام. لتقليل النفقات الحيوانية، نوصي بأن كلا العقول وأن تحصد خلايا نخاع العظام من كل الماوس في وقت التضحية. ويمكن إعداد اثنين من الباحثين يعملون معا كل من المواد في نفس الوقت. وبدلاً من ذلك، يمكن تخزين العقول في-80 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع المضادات الحيوية قبل عزلة الحطام المايلين. وكان يمكن الحفاظ على تجربتنا أن العقول في مثل هذه الظروف لمدة تصل إلى شهر واحد مع عدم فقدان ملحوظ لإمكانات توليد الحطام المايلين.

    كفسي تستخدم لتسمية الحطام المايلين نظراً لسهولة الاستخدام وشدة الفلورسنت. الصبغ يبقى كوينتشيد حتى الخلوية esterases تنشق مجموعة خلات في جزيء14. ثم يمكن أن تتفاعل مجموعة إستر سوكسينيميديل تم الإفراج عنهم مع والأميدات الأولية، أسفر عن مرفق التساهمية للبروتينات الخلوية14. بينما كفسي منفعل استخدام قنوات الفلورية الخضراء القياسية، هناك عدة مشتقات المتاحة تجارياً مع الخصائص الطيفية المختلفة. وبالتالي، فمن الممكن تصميم الإنزيم البلعمه مماثلة استخدام الأصباغ الفلورية متعددة. كما تجدر الإشارة إلى أن نظراً لسهولة الصلبان الصبغ الأغشية البلازمية، يمكن استخدامه لتسمية apoptotic الخلايا بطريقة مماثلة ك الحطام المايلين19. وعلاوة على ذلك، بينما لدينا أسلوب يعتمد على تحليل الصورة القياسية، مع التحسين المستخدم، والتقدير الكمي يمكن أن يؤديها استخدام التدفق الخلوي أو إنتاجية عالية طبق نظام التصوير.

    O الأحمر النفط (يعرف أيضا باسم 27 الأحمر المذيب، أو 5B الأحمر السودان) هو صبغة تذوب وقد استخدمت على نطاق واسع وصمة عار الدهون محايدة في عينات نسيجية. يسمح به تصبغ أحمر عميق لتصور الدهون داخل الخلايا عن طريق حقل مشرق ومجهر فلوري5،20. يسمح استخدام مجهر فلوري قناة وحيدة للتصوير وقوية التقدير الكمي لاورو الملون قطرات الدهن. أن الأسلوب المصبوغة بسيطة واستنساخه بدرجة عالية، فيجب الحرص أثناء إعداد عينة. من الأهمية بمكان أن الكحول أو على أساس حمض المصفف عدم استخدامها، كما أنها يمكن أن تذوب الدهون داخل الخلايا، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في تلطيخ كثافة. بالإضافة إلى ذلك، كما هو الحال مع أي تحليل الصورة الكمية، لا يمكن التقليل من إعدادات التقاط الصورة الموحدة وأخذ العينات غير متحيزة كافية الأهمية. ينصح بالاستخدام لتلطيخ ضوابط لمراعاة أي نموذج تلقائي-الأسفار. ينبغي أن تعامل هذه الضوابط المصبوغة مطابق تماما، ولكن اليسار أونستاينيد مع أورو لقياس مستوى الخلفية التلقائي-الأسفار. وحتى مع ذلك، يتطلب أسلوب تحليل الصورة لدينا الأمثل أقل من غيرها من تقنيات القياس الكمي الدهن، مثل أورو استخراج أسلوب21، الأمر الذي يتطلب إعداد المنحنى المعياري، هو أكثر عرضه لتقلب التجريبية، ويستلزم تدمير العينة. استخدام تحليل الصورة بناء على عدة مزايا أكثر أساليب الاستخراج أورو التقليدية في أن أنها غير مدمرة ومتوافق مع إيمونوستاينينج21،22 .

    وأخيراً، بينما الإجراءات المذكورة نسبيا على التوالي إلى الأمام، من الأهمية بمكان أن تستخدم الأسلوب العقيم السليم، حيث الضامة المستقبلات المتعددة التي تعترف بمسببات الأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس) مثل الذيفان التعبير عن lipopolysaccharide (لبس)23. التفاعل مع البكتريا يلوث سوف يؤدي إلى تنشيط بلعم ويمكن تغيير جذري على الدالة24،25. في ما يتعلق بالحطام المايلين التي تم جمعها، من المستحسن اختبار للتلوث. أساليب الكشف عن الذيفان مثل المقايسة (ال) ليمولوس أميبوسيتي ليستي حساسية عالية، وقد استخدمت سابقا لهذا التطبيق5،19.

    الضامة تلعب دوراً مهما في الصحة والمرض، ولكن دور بمدمس في سياق الإصابة الجهاز العصبي المركزي حاليا موضوع مهم للتحقيق. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، يمكن أن يبدأ الباحثون فهم إليه البلعمه الحطام المايلين التي بمدمس.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب قد لا الكشف.

    Acknowledgments

    الكتاب يود أن يشكر جلين سانغر-هودجسون، "أخصائي وسائط الإعلام" في "كلية طب الاتحاد السوفياتي السابق" لكل عمله في إنتاج الفيديو وتحريرها والتعليق الصوتي.

    وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (R01GM100474 و R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    البلعمه، بلعم المشتقة من نخاع العظام، والحطام المايلين،، علم الأعصاب، 130 قضية النفط يا أحمر، إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين، وإصابات النخاع الشوكي، نيوروتراوما
    <em>في المختبر</em> البلعمه حطام المايلين التي الضامة المشتقة من نخاع العظام
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter