Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.

Abstract

Beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) zijn rijpe leukocyten, die een essentiële fysiologische rol als professionele fagocyten staat van clearing een scala aan deeltjes te dienen. Normaal BMDMs zijn beperkt van het centrale zenuwstelsel (CNS), maar na een blessure, ze gemakkelijk kunnen infiltreren. Eenmaal binnen de gewonde weefsel van de CNS, BMDMs zijn de primaire celtype verantwoordelijk voor de goedkeuring van letsel-afgeleide cellulaire puin, met inbegrip van grote hoeveelheden van lipide-rijke myeline puin. De neuropathologische vertakkingen van BMDM infiltratie en myeline puin fagocytose binnen de CNS zijn complex en niet goed begrepen. De protocollen die hier beschreven, toestaan voor de studie direct in vitro van BMDMs in het kader van CNS letsel. We dekken lymfkliertest BMDM isolatie en cultuur, myeline puin voorbereiding en testen om te beoordelen BMDM myeline puin fagocytose. Deze technieken robuuste kwantificeerbare resultaten zonder de noodzaak van aanzienlijke gespecialiseerde apparatuur of materialen, maar kunnen gemakkelijk worden aangepast aan de behoeften van onderzoekers.

Introduction

Beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) zijn een belangrijke schakel tussen de aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Als antigeen presentatie van cellen (APCs), ze kunnen communiceren met lymfocyten via beide antigeen presentatie en cytokine release1,2,3. Echter als professionele fagocyten is hun primaire functie om ziekteverwekkers, leeftijd cellen, en cellulaire puin1,4te ontruimen. Na een dwarslaesie (SCI), aanzienlijke hoeveelheden van myeline puin is gegenereerd op basis van stervende oligodendrocyten, het celtype verantwoordelijk voor CNS axon myelinisering5. Wij en anderen hebben aangetoond dat Goedkeuringvande myeline puin primair de verantwoordelijkheid is van het BMDMs5,6,7te infiltreren. Echter binnen dwarslaesie is sites engulfment van myeline puin gesuggereerd deze normaal anti-inflammatoire cellen naar een pro-inflammatoire staat5,8,9moeten worden verschoven. Als belangrijkste bemiddelaars van neuro-ontsteking in het ruggenmerg gewonde zijn BMDMs belangrijke klinische doelstellingen.

Om te helpen onderzoeken van de invloed van BMDMs in het gewonde ruggenmerg, hebben we een in vitro model direct bestuderen hoe BMDMs reageren op myeline puin. Ter verbetering van biologische relevantie, worden zowel primaire lymfkliertest BMDMs en vers geïsoleerde myeline puin gebruikt in deze onderzoeken. Als zodanig, de methoden die hier gepresenteerd detail ook de isolatie en de cultuur van primaire lymfkliertest BMDMs, en een gemodificeerde sacharose kleurovergang techniek die gebruikt wordt om te isoleren lymfkliertest CNS afgeleid myeline puin10,11,12. Myeline puin kan gemakkelijk worden aangeduid met een fluorescente kleurstof, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), te volgen die de internalisering door BMDMs. CFSE is geschikt voor deze toepassing omdat het niet-cytotoxische, en de smalle fluorescerende spectrum vergunningen multiplexing met andere tl sondes13,14. Na fagocytose, myeline puin lipiden zijn de lysosomen vervoerd en verpakt als neutrale lipiden in intracellulaire lipide druppels5. Om te kwantificeren deze intracellulaire lipide-accumulatie, presenteren we een olie Red O (ORO) kleuring van de methode die is geoptimaliseerd voor kwantitatieve beeldanalyse. Deze eenvoudige kleuringstechniek produceert robuuste reproduceerbare resultaten en kwantificering15. Deze methoden vergemakkelijken de studie van myeline puin fagocytose en lipide retentie met beperkte gespecialiseerde apparatuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De methoden die hier worden beschreven en in deel 2 zijn goedgekeurd door de Florida State University institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en volgt de richtsnoeren uiteengezet in de gids voor zorg en gebruik van proefdieren, 8th edition . Alle dieren die worden gebruikt in dit in dit protocol zijn huis in een speciaal laboratorium dier faciliteit tot gebruik. Geen in vivo experimenten werd uitgevoerd vóór de offeren. Dierlijke nummers waren gebaseerd op experimentele behoefte met behulp van gemiddelde cel- en myeline collecties als een gids om het gebruik te minimaliseren.

Opmerking: Dit protocol beschrijft de generatie van het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) (afdeling 1), de voorbereiding van fluorescently geëtiketteerde hersenen-afgeleide myeline puin (sectie 2), de algemene procedure voor het analyseren van myeline puin fagocytose (sectie 3), en de algemene procedure voor analyse van myeline puin lipide accumulatie (afdeling 4). Bereiding van het reagens, cel oogsten en manipulatie, myeline collectie en labeling en assay prestaties moeten worden ingevuld in een laminaire luchtstroming bioveiligheid kabinet.

1. generatie van primaire beenmerg-afgeleide macrofagen

  1. Voorbereiding voor volledige macrofaag kweekmedium (CMCM)
    Opmerking:     Macrophage generatie uit beenmerg vereist het gebruik van macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF). Deze voorbereiding maakt gebruik van L929 lymfkliertest fibroblast geconditioneerd media als bron van M-CSF.
    1. Genereren L929 lymfkliertest fibroblast geconditioneerd media door kweken cellen in 145 mm gerechten met 50 mL van de hoge glucose (4500 mg/L L-glucose) Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% nieuwe geboren voor kalfsserum (NCS) en penicilline/streptomycine voor 7 dagen.
    2. Media van culturen in 50 mL conische centrifuge buizen en centrifuge verzamelen gedurende 30 minuten bij 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtreer supernatant door een 0,2 µm spuit filter in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 mL. Geconditioneerde media kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden.
    4. Te hoge glucose DMEM, het toevoegen van 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 lymfkliertest fibroblast geconditioneerd DMEM en 1% penicilline/streptomycine. Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 2-3 maanden. Warm tot 37 ° C vóór gebruik.
  2. Verzameling van primaire beenmergcellen en macrofaag inductie
    Opmerking: Met dit protocol een muis genereert ongeveer 20 miljoen beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs).
    1. Het gewenste aantal van 8-10 week oude muizen met behulp van standaard CO2 verstikking richtsnoeren gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren.
    2. Het zuiveren van het dier met behulp van 70% (vol/vol) ethanol: H2O, verzadigen van de vacht.
    3. Snijd een kleine opening in de buik en terug Trek voorzichtig de huid te onthullen van het onderliggende weefsel. Zorg niet doorprikken de peritoneale holte.
    4. Verwijder beide achterpoten op de heup begint en eindigt bij de enkel. Plaats de verzamelde weefsel in een petrischaal van 100 mm met 5-10 mL steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine.
      Opmerking: Verwerking van verschillende dieren zorg er bij te houden van de gerechten op het ijs te beperken van de aantasting van het weefsel.
    5. Spier- en bindweefsel verwijderen door het bot met behulp van een scalpel. Alleen het bovenbeen en het onderbeen worden gebruikt voor het verzamelen van de cel, het kuitbeen kan worden weggegooid.
    6. Bloot de holte van het merg van de verzamelde botten door het trimmen van een klein deel van elk uiteinde met een scalpel.
    7. Met behulp van een 25g naald, spoel de holtes van de beenmerg met CMCM in een tube van 50 mL conische centrifuge. De botten zal verschijnen witte zodra ze hebben voldoende gespoeld is.
    8. Zodra collectie is voltooid, doorroeren aangeblazen met een naald 18g voor 30-90 s tot een enkele celsuspensie gegenereerd.
      Opmerking: Een optionele rode bloedcellen (RBC) lysis stap kan op dit moment worden uitgevoerd. Het is onlangs gesuggereerd dat intracellulaire ijzergehalte invloed op de effecten van myeline puin op macrophage polarisatie16 hebben kan. Voor informatie over het opnemen van een stap van de lysis van de RBC verwijzen naar Trouplin et al. 17.
    9. Filtreer de schorsing door een 70 µm steriele cel zeef in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 mL.
    10. Zaad verzameld cellen gelijkmatig in 145 mm cel cultuur gerechten met 15-20 mL CMCM. Gebruik ongeveer drie cultuur gerechten per muis opgeofferd. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2culturen.
    11. Na 72 uur platen eenmaal met steriel PBS wassen tot niet-aanhanger cellen verwijderen, voeg dan 15-20mL verse CMCM. Incubeer culturen voor extra 4 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. Na 7 dagen van totale cultuur zullen de hematopoietische beenmergcellen aanvankelijk geïsoleerd volwassen BMDMs (Figuur 1).

2. productie van Fluorescently geëtiketteerde hersenen-afgeleide myeline puin

Opmerking: Alle reagentia kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.

  1. Voorbereiding van myeline puin collectie reagentia
    1. Bereiden van Tris· Cl-bufferoplossing.
      1. Tot 800mL Voeg gedestilleerd gedeïoniseerd H2O (ddiH2van O) 20 mL 1 M Tris· Cl, pH 7,45 (20 mM eindconcentratie) en 20 mL 100 mM nb2EDTA (definitieve concentratie van 2 mM).
      2. Breng de pH op 7,45. Stel volume tot 1000 mL met ddiH2O. Filter oplossing via een 0,2 µm filtratie eenheid.
    2. Bereiden 1 M sacharoseoplossing.
      1. Tot 100 mL van Tris· Cl buffer oplossing, voeg 68.46 g van sucrose. Draai volume om 200 mL met Tris· Cl-bufferoplossing. Filtreer de oplossing door middel van een 0,2 µm filtratie unit.
    3. 200 mL 0.32 M sacharoseoplossing bereid door verdunning van de 1 M-oplossing met de Tris· Cl buffer oplossing 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. 150 mL 0,83 M sacharoseoplossing bereid door verdunning van de 1 M-oplossing met de Tris· Cl buffer oplossing 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. Collectie van hersenen-afgeleide ruwe myeline puin
    Opmerking: De hier beschreven methode van de collectie is voor de isolatie van ruwe myeline puin.
    1. Euthanaseren 10-12 muizen 8-10 weken oud met behulp van standaard CO2 verstikking richtsnoeren gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Ontleden van de hersenen en plaats ze in een schaal van 100 mm met 10 mL 0.32 M sacharoseoplossing.
Houd de schotel op het ijs.
  • Met behulp van steriele chirurgische schaar gesneden van de hersenen in stukken van ongeveer 5 mm3 in grootte.
  • Het weefsel overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge en voeg ongeveer 30 mL 0.32 M sacharoseoplossing.
  • Meng met een steriele hand-held roterende homogenizer, tot een goede oplossing is bereikt.
  • Verdun de gehomogeniseerde hersenen tot een eindvolume van 90 mL met 0.32 M sacharoseoplossing.
  • Zes polypropyleen ultracentrifuge 38,5-mL dunwandige buizen, Voeg 20 mL 0,83 M sacharoseoplossing.
  • Zachtjes de gehomogeniseerde hersenen oplossing aan de bovenkant van de sacharoseoplossing 0,83 M, verzorgen zich niet te mengen de twee lagen toevoegen.
  • Evenwicht van elke buis met de sacharoseoplossing 0.32 M.
  • Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 45 min bij 4° C met behulp van een geschikte gekoeld vooraf ultracentrifuge rotor. Rotor versnelling en vertraging instelt door hun minimumwaarden om myeline puin verlies.
  • Het myeline puin van de interface van de twee sacharose dichtheden verzamelen.
    Opmerking: puin moet worden weergegeven als een witte band naar het midden van de buis.
  • Het ruwe myeline puin te combineren in een tube van 50 mL conische centrifuge en pas het volume aan ongeveer 35 mL met behulp van Tris· Cl-bufferoplossing.
  • Meng het ruwe myeline puin met een steriele hand-held roterende homogenizer voor 30-60-s.
  • Gelijkmatig verdelen de schorsing tussen 6 schone ultracentrifuge buizen en evenwicht met een juiste hoeveelheid Tris· Cl-bufferoplossing.
  • Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 45 min bij 4° C met behulp van een geschikte gekoeld vooraf ultracentrifuge rotor. Rotor versnelling en vertraging aan hun maximale waarden instellen
  • Aangezien effen witte pellets nu zichtbaar zijn zal, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 10-15 mL Tris· Cl-bufferoplossing.
  • Gelijkmatig verdelen de schorsing tussen 2 schone ultracentrifuge buizen en evenwicht met een juiste hoeveelheid Tris· Cl-bufferoplossing.
  • Centrifuge weer bij 100.000 x g voor 45 min bij 4 ° C met behulp van een geschikte vooraf gekoeld ultracentrifuge rotor. Rotor versnelling en vertraging aan hun maximale waarden instellen
  • Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 5-6 mL steriele PBS en verdeel de schorsing tussen een passend aantal vooraf gewogen 1,5 mL micro-centrifuge buizen.
  • Centrifuge op 22.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  • Verwijder het supernatant en bepalen het gewicht van de myeline puin pellets.
  • Resuspendeer de pellets in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg/mL.
    Opmerking: tien tot twaalf hersenen is genoeg voor de productie van 10-15 mL 100 mg/mL myeline puin. Myeline puin kunnen winkel bij-80 ° C voor 6 maanden.
  • Myeline puin fluorescerende labeling
    1. Bereid de 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) oplossing vlak voor gebruik.
      1. Met behulp van steriele PBS, Verdun een 5 mM stockoplossing van CFSE bereid met 100% dimethylsulfoxide (DMSO) naar een werkende eindconcentratie van 50 µM.
      2. Filtreer de oplossing door een 0,2 µm spuit filter.
    2. Ontdooi het gewenste bedrag van 100 mg/mL myeline puin en resuspendeer met een steriele 29 g naald.
      Opmerking: bevriezing van het myeline puin zal daardoor afhaken oplossing vereisen resuspensie vóór gebruik.
    3. Myeline puin overbrengen in een vooraf gewogen 1,5 mL micro-centrifuge buis.
    4. Centrifugeer bij 14.800 x g gedurende 10 minuten bij 4° C. Verwijder het supernatant.
    5. Resuspendeer de myeline puin in 200 µL van CFSE oplossing per 100 µL myeline puin Ingehuld.
    6. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) beschermd tegen licht.
    7. Centrifugeer bij 14.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    8. Resuspendeer de pellet in 600-800 µL van was buffer (0,2 µm filter gesteriliseerde 100 mM glycine in PBS).
    9. Centrifugeer bij 14.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    10. Herhaal stappen 2.3.8-2.3.9 tweemaal meer.
    11. Na de definitieve wash, bepalen van het gewicht van de myeline puin pellet en resuspendeer tot 100 mg/mL met steriel PBS.
      Opmerking: Gelabelde myeline puin kunnen winkel bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden.

    • 3. myeline puin fagocytose Assay

    Opmerking: Het volgende is de basismethode voor het observeren van fagocytose van fluorescently geëtiketteerde myeline puin. Toevoeging van andere behandelingen en experimentele omstandigheden moet worden geoptimaliseerd door de onderzoeker.

    1. Voorbereiding van behandeling platen
      1. Voor elke 145 mm plaat, door volwassen BMDMs in een conische centrifugebuis van met 5-6 mL 10 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 15 mL in de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (dPBS) (pH 7.4) te verzamelen.
        Opmerking: Gebruik geen trypsine aangezien het de activeringsstatus van de cellen18 veranderen kan.
      2. Voeg een gelijk volume voorverwarmde CMCM aan elke buis van verzamelde cellen.
      3. Centrifugeer bij 180 x g gedurende 8 minuten bij 20 ° C. Verwijder het supernatant.
      4. Resuspendeer de cellen in de CMCM en graaf.
      5. Voeg aan elk putje van de plaat van een 24-well cel cultuur, 1 x 105 cellen in 1 mL CMCM.
      6. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
    2. Myeline puin behandeling en analyse
      1. Voeg toe 10 µL van 100 mg/mL CFSE label myeline puin aan elk putje (definitieve concentratie van 1 mg/mL).
      2. Incubeer gedurende 1-3 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
      3. Wassen plaat 3 keer met steriel PBS niet-overspoeld myeline puin te verwijderen.
      4. Voeg 400 µL van 4% paraformaldehyde toe aan elk putje. Incubeer gedurende 30 min op RT.
      5. Wassen plaat 2 keer met steriel PBS.
      6. Voeg 400 µL van Hoechst 33258 oplossing aan elk putje. Incubeer gedurende 5 min op RT beschermd tegen licht.
      7. Spoel de platen 2 keer met steriel PBS.
      8. Voeg 200 µL van gefluoreerde-gel met Tris buffer aan elk putje te verminderen photobleaching.
      9. Afbeelding cellen met behulp van een omgekeerde epi-belichting fluorescerende staat Microscoop.
        Opmerking: De excitatie en emissie golflengten van CFSE zijn 494 nm en 521 nm, respectievelijk.
      10. Het getal CFSE positieve cellen delen door het aantal kernen om te bepalen van de relatieve myeline puin opname.
      11. Voorafgaand aan de beeldvorming, platen voor maximaal 7 dagen bij 4 ° C beschermd tegen licht worden bijgehouden.

    4. kwantificering van intracellulaire lipiden Via olie rood-O kleuring

    Opmerking: Het volgende is de basismethode voor het observeren van intracellulaire myeline-puin-afgeleide lipiden.Het gebruik van CFSE het label van myeline puin wordt niet aanbevolen voor fluorescerende kwantificering van ORO vlekken als gevolg van spectrale overlap. Toevoeging van andere behandelingen en experimentele omstandigheden moet worden geoptimaliseerd door de onderzoeker.

    1. Voorbereiding van kleuringsvloeistoffen
      1. 0,5% olie rood-O (ORO) kleurstofoplossing voor te bereiden.
        1. Voeg langzaam 100 mL voor 100% propyleenglycol (1,2-propaandiol) à 0,5 g van ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) tijdens het roeren.
        2. Verwarm de oplossing bij 95 ° C gedurende 15 minuten of totdat alle grote deeltjes zijn opgelost.
          Opmerking: geen warmte meer dan 100 ° C.
        3. Filtreer de oplossing door een stuk papier van de filter terwijl nog warm in een nieuwe ontvanger.
        4. Toestaan oplossing voor cool overnachting in RT. oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 1 jaar op RT.
      2. 85% propyleenglycol oplossing voor te bereiden.
        1. Voeg 85 mL 100% propyleenglycol tot 15 mL ddiH2O. Roer tot het gemengd. Oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 1 jaar op RT.
    2. Voorbereiding van behandeling platen
      1. Voorbereiden van een plaat van de 24-well volgens de methode beschreven in punt 3.
      2. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
    3. Myeline puin behandeling
      1. Voeg 10 µL van 100 mg/mL myeline puin aan elk putje (definitieve concentratie van 1 mg/mL).
      2. Incubeer gedurende 1-3 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
      3. Wassen plaat 3 keer met steriel PBS tot het verwijderen van niet-verteerde myeline puin.
        Opmerking: Op dit punt, platen of onmiddellijke fixatie kunnen ondergaan of verse CMCM kan worden toegevoegd, en cellen terug naar incubatie voor extra tijd punten.
      4. Voeg 400 µL van 4% paraformaldehyde toe aan elk putje. Incubeer gedurende 30 min op RT.
      5. Wassen plaat 2 keer met steriel PBS dan procced te bevlekken.
    4. ORO kleuring en analyse
      1. Wassen van vaste plaat 3 keer met ddiH2O.
      2. Voeg 400 µL van 100% propyleenglycol aan elk putje en incubeer gedurende 5 min op RT.
        Opmerking: dit zal verminderen overdracht van ddiH2O.
      3. Gecombineerd de propyleenglycol en Voeg 400 µL van ORO oplossing aan elk putje.
      4. Incubeer gedurende 8 minuten bij 60 ° C.
      5. De ORO-oplossing gecombineerd. Vervolgens 400 µL van 85% propyleenglycol toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 5 minumintes op RT.
      6. Wash plaat 3 keer met ddiH2O.
      7. Voeg 400 µL van Hoechst 33258 oplossing aan elk putje. Incubeer gedurende 5 min op RT, beschermd tegen licht.
      8. Spoel de platen 2 keer met steriel PBS.
      9. Voeg 200 µL van gefluoreerde-gel met Tris buffer toe aan elk putje.
      10. Afbeelding cellen met behulp van een omgekeerde epi-belichting fluorescerende staat Microscoop. ORO kan worden beeld met behulp van een standaard Texas rood of DsRed filter set.
      11. Relatieve lipide retentie te kwantificeren door bepalen de ORO positieve gebied in elk afbeeldingsveld en het te delen door het aantal kernen.
      12. Handhaven platen voor 7 dagen bij 4 ° C beschermd tegen licht.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Behandeling van BMDMs met CFSE het label van myeline puin moet opleveren duidelijk internalisering (Figuur 2). Terwijl een tijd van 3 uur interactie voldoende voor BMDMs is om het phagocytose voldoende toegevoegde myeline puin voor robuuste downstream detectie, kan intracellulaire accumulatie worden waargenomen met zo weinig als 1 uur van interactie. Echter, sommige myeline puin kan nog wel aanwezig op het celoppervlak na het wassen. Dit kan worden veroorzaakt door onvoldoende wassen of deeltjes niet volledig worden geïnternaliseerd tijdens de vroege stadia van fagocytose.

    Terwijl BMDMs snel myeline puin internaliseren kan, is lysosomale verwerking vereist voordat ORO stainable lipide druppels formulier. Om aan te tonen, waren BMDMs met myeline puin gedurende 90 minuten geïncubeerd, gewassen en gekweekte voor extra hoeveelheden tijd voorafgaand aan de fixatie en kleuring (Figuur 3). Figuur 4 toont er een vertraging tussen behandeling initiatie en neutrale lipide verschijning. Ook opgemerkt moet worden dat lipide retentie niet stabiel tijdens cultuur is. BMDMs zal beginnen te metaboliseren geaccumuleerde lipiden kort na de vorming van de druppel. Als zodanig, is het raadzaam te wachten langer dan 24 uur tussen wassen weg niet-overspoeld myeline puin en fixatie.

    Kwantificering van ORO gekleurd gebied toont het percentage van myeline lipide metabolisme in BMDMs (Figuur 5). Na een periode van 90 minuten durende interactie, werden cellen terug naar incubatie in vers CMCM. Tijdens de vroege periode van de jacht op vers medium metaboliseren de BMDMs de phagocytosed myeline puin lipide component in neutrale ORO stainable lipiden. Een gestage toename van de ORO positieve gebied is typisch in de uren na de interactie. Na 24 uur is echter de BMDMs effluxed zal hebben, of een aanzienlijk deel van de intracellulaire lipiden gemetaboliseerd.

    Figure 1
    Figuur 1 : Vertegenwoordiger BMDM culturen. Paar Adherente cellen zal aanvankelijk worden waargenomen. Op dag 3, worden niet-aanhanger cellen verwijderd. Door dag 7, volwassen beenmerg-afgeleide macrofagen in acht worden genomen. Schaal = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 2
    Figuur 2 : Vertegenwoordiger beelden van BMDM myeline puin fagocytose Assay. Cellen werden behandeld met 1mg/mL CFSE myeline puin gelabeld voor 1 uur vóór het wassen en fixatie met 4% PFA. Verinnerlijkte myeline puin kan worden gevisualiseerd met behulp van standaard GFP filter sets op een epi-belichting fluorescerende staat Microscoop. Schaal = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 3
    Figuur 3 : Diagram van olie rood O (ORO) proefopzet. BMDM worden behandeld met 1mg/mL myeline puin (1:100 verdunning) voor 90 minuten, gevolgd door wassen en cultuur op vers medium voorafgaand aan de fixatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 4
    Figuur 4 : ORO kleuring van BMDM na myeline puin fagocytose. Volgende fixatie met 4% PFA op de aangegeven tijd-points, BMDMs werden gekleurd met ORO en Hoechst 33258. Representatieve beelden voor elk tijdstip worden weergegeven. Schaal = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 5
    Figuur 5 : Kwantitatieve beeldanalyse van ORO kleuring. Voor de kwantificering van ORO kleuring, werden op 20 X 3 wells beeld met 5 beelden per putje. Alle instellingen van de overname van de afbeeldingen waren identiek. Foutbalken = SEM. (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De hier beschreven procedures gebruiken zowel vers geïsoleerde ruwe CNS myeline puin en primaire beenmerg-afgeleide macrofagen. Verklein dierlijke uitgaven en raden we beide hersenen en beenmergcellen worden geoogst uit elke muis op het moment van offer. Twee onderzoekers samen te werken kunnen gelijktijdig beide materialen voorbereiden. U kunt ook kunnen hersenen worden opgeslagen bij-80 ° C in PBS aangevuld met antibiotica voorafgaand aan myeline puin isolatie. Het is onze ervaring dat de hersenen in deze voorwaarden voor maximaal 1 maand zonder merkbaar verlies van myeline puin generatie potentieel kan worden gehandhaafd.

    CFSE wordt gebruikt voor het etiketteren van myeline puin vanwege zijn gebruiksgemak en TL intensiteit. De kleurstof blijft gehard tot cellulaire esterasen de acetaat-groep op de molecule14 klieven. De vrijgekomen succinimidyl ester groep kan vervolgens reageren met primaire amiden, resulterend in het covalente gehechtheid aan cellulaire eiwitten14. Terwijl CFSE prikkelbaar met behulp van standaard groen fluorescent kanalen is, zijn er verscheidene derivaten commercieel verkrijgbaar met verschillende spectrale eigenschappen. Het is dus mogelijk om te ontwerpen een soortgelijke fagocytose assay met behulp van meerdere fluorescente kleurstoffen. Ook opgemerkt moet worden dat omdat de kleurstof gemakkelijk plasma membranen kruist, het kan worden gebruikt om label apoptotic cellen op een vergelijkbare manier als myeline puin19. Bovendien, terwijl onze methode is gebaseerd op standaard beeldanalyse, met gebruiker optimalisatie, kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van stroom cytometry of een plaat van de hoge doorvoer imaging systeem.

    Olie Red O (ook bekend als oplosmiddel Red 27 of Soedan Red 5B) is een vet oplosbare kleurstof, die uitvoerig is gebruikt om neutrale lipiden in histologische monsters vlek. Haar diep rood pigment zorgt voor visualisatie van intracellulaire lipiden via zowel heldere als fluorescent microscopie5,20. Met behulp van fluorescentie microscopie voorziet enkellijns beeldvorming en robuuste kwantificering van ORO gekleurd lipide druppels. Terwijl de kleuringstechniek eenvoudig en zeer reproduceerbaar is, wees voorzichtig tijdens de bereiding. Het is essentieel dat alcohol of zuur gebaseerde fixatives niet worden gebruikt, zoals ze intracellulaire lipiden, wat leidt tot een aanzienlijke vermindering van kleuring van intensiteit kunnen ontbinden. Bovendien, net als bij elke kwantitatieve beeldanalyse, kan niet het belang van de instellingen voor het vastleggen van gestandaardiseerde beeld en voldoende onbevooroordeelde bemonstering worden ondergewaardeerd. Het gebruik van de kleuring van besturingselementen wordt aanbevolen om de rekening voor elke steekproef auto-fluorescentie. Deze kleuring controles moeten identieke wijze worden behandeld, maar links onbevlekt met ORO voor het meten van het niveau van de achtergrond auto-fluorescentie. Zelfs zo, vereist de methode van de analyse van onze afbeelding minder optimalisatie dan andere lipide kwantificering technieken, zoals de ORO extractie methode21, die standaard curve voorbereiding vereist, gevoeliger voor experimentele variabiliteit is, en vergt vernietiging van het monster. Het gebruik van beeld gebaseerde analyse heeft verscheidene voordelen over traditionele ORO extractiemethoden in dat het niet-destructieve en is compatibel met immunokleuring21,22 .

    Tot slot, terwijl de procedures relatief rechttoe-rechtaan zijn, is het essentieel dat de juiste aseptische techniek worden gebruikt, aangezien macrofagen express meerdere receptoren die herkent pathogen verbonden moleculaire patronen (PAMPS) zoals het endotoxine lipopolysaccharide (LPS)23. Interactie met bacteriële verontreinigt zal resulteren in de macrofaag activering en dramatische verandering kunnen hun functie24,25. Met betrekking tot de verzamelde myeline puin, wordt testen voor besmetting aanbevolen. Endotoxine detectiemethoden zoals de limulus amebocyte lysate (LAL) test hebben hoge gevoeligheid, en eerder zijn gebruikt voor deze toepassing5,19.

    Macrofagen spelen een belangrijke rol in zowel de volksgezondheid als de ziekte, maar de rol van BMDMs in het kader van CNS letsel is momenteel een belangrijk onderwerp van onderzoek. Met behulp van de methoden beschreven hier kunnen onderzoekers beginnen om het mechanisme van myeline puin fagocytose door BMDMs beter te begrijpen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

    Acknowledgments

    De auteurs bedank Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist bij de FSU College of Medicine voor al zijn werk in videoproductie, bewerken en voice-over.

    Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01GM100474 en R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Neurowetenschappen kwestie 130 beenmerg-afgeleide macrofaag fagocytose myeline puin rode O carboxyfluorescein succinimidyl ester dwarslaesie neurotrauma olie
    <em>In Vitro</em> Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter