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Neuroscience

In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Nous présentons des méthodes pour évaluer la capacité phagocytaire des primaires macrophages dérivés de la moelle osseuse murines utilisant des débris de la myéline fluorescent étiquetés et coloration de gouttelettes de lipides intracellulaires.

Abstract

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont des leucocytes matures qui servent un rôle physiologique essentiel comme les phagocytes professionnels capable d’effacer une variété de particules. Normalement, les BMDMs sont restreints de système nerveux central (CNS), mais suite à une blessure, ils peuvent facilement s’infiltrer. Une fois dans le tissu lésé de CNS, BMDMs sont le type de cellules primaires responsable de l’apurement des débris cellulaires dérivées de blessures, y compris de grandes quantités de débris de myéline riche de lipides. Les ramifications neuropathologiques de l’infiltration et la myéline phagocytose de débris BMDM dans le système nerveux central sont complexes et pas bien compris. Les protocoles décrits ici, permettent l’étude directe in vitro de BMDMs dans le contexte des blessures de la CNS. Nous couvrons murin BMDM isolement et culture, préparation de débris de la myéline et tests pour évaluer la phagocytose de débris BMDM la myéline. Ces techniques produisent des résultats quantifiables robustes sans le besoin d’équipement spécialisé significatif ou matériaux, mais peuvent être facilement personnalisés pour répondre aux besoins des chercheurs.

Introduction

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont un lien important entre le système immunitaire inné et adaptatif. Comme antigène présentant des cellules (CPA), ils peuvent communiquer avec via les deux présentation de l’antigène, les lymphocytes et cytokine release1,2,3. Cependant, comme les phagocytes professionnels, leur fonction principale est de clairement pathogènes, cellules âgées et les débris cellulaires1,4. Suite à une blessure de la moelle épinière (SCI), des quantités considérables de débris de la myéline est généré à partir des oligodendrocytes mourants, le type de cellule responsable de la CNS axon myélinisation5. Nous et autres avons montré que dégagement des débris de la myéline est avant tout la responsabilité d’infiltration de BMDMs5,6,7. Toutefois, au sein de la moelle épinière engouffrement de sites des débris de la myéline a été suggéré de transférer ces cellules normalement anti-inflammatoires vers un état pro-inflammatoire5,8,9. Comme des médiateurs clés de la neuro-inflammation de la moelle épinière lésée, BMDMs sont des objectifs cliniques importants.

Afin d’étudier l’influence de BMDMs dans la moelle épinière lésée, nous avons développé un modèle in vitro pour étudier directement comment BMDMs répondre aux débris de la myéline. Afin d’améliorer la pertinence biologique, tant primaires BMDMs murins et les débris de la myéline fraîchement isolées sont utilisées dans ces enquêtes. Par conséquent, les méthodes présentées ici également détaillent l’isolement et la culture de BMDMs murins primaires et une technique de dégradé mis à jour le saccharose utilisée pour isoler les CNS murin dérivé myéline débris10,11,12. Débris de la myéline peut porter facilement avec un colorant fluorescent, carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE), pour suivre que son internalisation par CFSE BMDMs. est bien adaptée pour cette application, car il est non cytotoxiques et son permis étroit spectre de fluorescence multiplexage avec autre fluorescent sondes13,14. Après la phagocytose, la myéline débris lipides sont transportés à travers les lysosomes et empaquetées comme les lipides neutres dans les gouttelettes de lipides intracellulaires5. Afin de quantifier cette accumulation de lipides intracellulaires, nous présentons un O huile de rouge (ORO) coloration méthode optimisée pour l’analyse quantitative d’image. Cette méthode de coloration simple produit des résultats reproductibles robustes et15de la quantification. Ces méthodes facilitent l’étude de la myéline débris phagocytose et lipides rétention de matériel spécialisé limitée.

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Protocol

Les méthodes décrites ici et à l’article 2 ont été approuvés par la Florida State University institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) et suit les lignes directrices énoncées dans le Guide du pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire, 8ème édition . Tous les animaux utilisés dans le présent dans le présent protocole sont maison dans une animalerie de laboratoire dédié jusqu'à utilisation. Aucune expérimentation in vivo a été réalisé avant de sacrifier. Nombre d’animaux axées sur les besoins expérimentaux utilisant la moyenne des cellules et des collections de la myéline comme guide afin de minimiser la consommation.

Remarque : Ce protocole décrit la génération des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) (Section 1), la préparation des débris de myéline d’encéphales fluorescent étiquetés (Section 2), la procédure générale pour analyser la phagocytose de débris de la myéline (Section 3), et procédure générale d’analyse de l’accumulation de lipides débris de myéline (Section 4). Préparation du réactif, cellule récolte et manipulation, collection de la myéline et étiquetage et performances du test devraient être achevés dans un flux d’air laminaire biosafety armoire.

1. génération des Macrophages primaires de moelle osseuse

  1. Préparation du milieu de culture de macrophage complet (CMCM)
    Remarque :     génération de macrophages de la moelle osseuse nécessite l’utilisation d’and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Cette préparation utilise L929 médias de fibroblastes murins conditionné comme source de M-CSF.
    1. Générer des médias des fibroblastes murins conditionné L929 par culture de cellules dans les plats de 145 mm avec 50 mL de forte concentration de glucose (4 500 mg/L, L-glucose) Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de sérum de veau né le nouveau 5 % (NCS) et pénicilline/streptomycine pendant 7 jours.
    2. Recueillir des médias provenant de cultures dans des tubes à centrifuger coniques 50 mL et centrifuger pendant 30 minutes à 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtrer les surnageants sur un filtre de seringue 0,2 µm dans un tube à centrifuger conique 50 mL nouveau. Milieux conditionnés peut être stockées à-80 ° C pendant 6 mois.
    4. À forte concentration de glucose DMEM, ajouter 5 % vol/vol NCS, 15 % vol/vol L929 fibroblastes murins conditionné DMEM et 1 % la pénicilline/streptomycine. Médias peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 à 3 mois. Chaud à 37 ° C avant utilisation.
  2. Collection de cellules de moelle primaire et induction macrophage
    Remarque : L’utilisation de cette un souris protocole générera environ 20 millions macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs).
    1. Euthanasier le nombre désiré de 8 à 10 semaine vieilles souris en utilisant les directives standard CO2 asphyxie suivies par dislocation cervicale.
    2. Désinfectez l’animal à l’aide de 70 % (vol/vol) éthanol : H2O, saturant la fourrure.
    3. Coupez une petite ouverture dans l’abdomen et tirez délicatement la peau pour révéler les tissus sous-jacents. Prenez soin de ne pas perforer la cavité péritonéale.
    4. Enlever les deux pattes arrière à partir de la hanche et se terminant à la cheville. Place les tissus prélevés dans un 100 mm boîte de Pétri contenant du phosphate stérile 5-10 mL solution saline tamponnée (PBS) additionnée de 1 % la pénicilline/streptomycine.
      Remarque : Lorsque plusieurs animaux de traitement Assurez-vous garder la vaisselle sur la glace pour limiter la dégradation des tissus.
    5. Retirer les muscles et du tissu conjonctif de l’os à l’aide d’un scalpel. Seulement le fémur et le tibia sont utilisés pour le prélèvement de cellules, le péroné peut être mis au rebut.
    6. Exposer la cavité de la moelle des os prélevés en taillant une petite section de chaque extrémité avec un scalpel.
    7. À l’aide d’une aiguille 25g, rincer les cavités de la moelle osseuse avec CMCM dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Les os apparaîtront blancs une fois qu’ils ont été suffisamment rincées.
    8. Une fois que la collection soit effectuée, agiter ponction avec une aiguille 18g pour 30-90 s à généré une suspension monocellulaire.
      Remarque : Une étape de lyse facultatif des globules rouges (RBC) peut être effectuée à ce stade. Récemment, il a été suggéré que la teneur en fer intracellulaire peut influencer les effets des débris de la myéline à macrophage polarisation16. Pour plus d’informations au sujet de l’inclusion d’une étape de lyse RBC veux parler Trouplin et al. 17.
    9. Filtrer la suspension à travers un tamis de cellule stérile 70 µm dans un nouveau tube à centrifuger conique 50 mL.
    10. Graines prélevées des cellules uniformément dans les récipients de culture de cellules de 145 mm contenant 15 à 20 mL CMCM. Utilisez environ trois récipients de culture par souris sacrifiées. Incuber les cultures à 37 ° C, 5 % de CO2.
    11. Après 72 heures laver les plaques une fois avec du PBS stérile pour enlever les cellules non adhérentes, puis ajouter 15 à 20mL CMCM fraîche. Incuber les cultures pour une période supplémentaire de 4 jours à 37 ° C, 5 % de CO2. Après 7 jours de culture totale, les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse isolées au départ sera matures BMDMs (Figure 1).

2. génération de débris fluorescent étiquetés encéphales myéline

Remarque : Tous les réactifs peuvent être stockés à 4 ° C pendant environ 1 mois.

  1. Préparation des réactifs de la myéline débris collection
    1. Préparer Tris· Solution tampon de cl.
      1. Pour 800mL distillée désionisée H2O (ddiH2O) ajouter 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentration finale de 20 mM) et 20 mL de 100 mM Na2EDTA (concentration finale de 2 mM).
      2. Ajuster le pH à 7,45. Régler le volume à 1 000 mL avec de le ddiH2solution O. filtre à travers une unité de filtration 0,2 µm.
    2. Préparer une solution de saccharose 1 M.
      1. Dans 100 mL de Tris· CL solution tampon, ajouter 68,46 g de saccharose. Régler le volume à 200 mL avec Tris· Solution tampon de cl. Filtrer la solution à travers une unité de filtration de 0,2 µm.
    3. Préparer 200 mL de solution de saccharose de 0,32 M en diluant la solution 1 M avec la Tris· CL 0.83:0.16 de solution tampon (vol/vol).
    4. Préparer 150 mL de solution de saccharose de 0,83 M en diluant la solution 1 M avec la Tris· CL 0.83:0.16 de solution tampon (vol/vol).
  2. Collecte des débris de la myéline brut encéphales
    Remarque : La méthode de collection décrite ici est pour l’isolement des débris de la myéline brut.
    1. Euthanasier 10-12 souris 8-10 semaines d’âge à l’aide de directives standard CO2 asphyxie suivies par dislocation cervicale.
    2. Disséquer les cerveaux et les placer dans un plat de 100 mm contenant 10 mL de solution de saccharose de 0,32 M.
Garder le plat sur la glace.
  • À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, couper le cerveau en pièces environ 5 mm3 en taille.
  • Transvaser le tissu dans un tube à centrifuger conique 50 mL et ajouter environ 30 mL de solution de saccharose de 0,32 M.
  • Homogénéiser avec un homogénéisateur rotatif à main stérile, jusqu'à l’obtention d’une solution sans heurt.
  • Diluer le cerveau homogénéisé pour un volume final de 90 mL avec une solution de saccharose de 0,32 M.
  • À six tubes de 38,5-mL à parois minces en polypropylène ultracentrifugeuse, ajouter 20 mL de solution de saccharose de 0,83 M.
  • Ajouter doucement la solution cerveau homogénéisé au sommet de la solution de saccharose de 0,83 M, prenant soin de ne pas pour mélanger les deux couches.
  • Équilibre entre chaque tube avec la solution de saccharose de 0,32 M.
  • Centrifuger à 100 000 x g pendant 45 min à 4° C à l’aide appropriée préalablement refroidi rotor ultracentrifugeuse. Rotor accélération et décélération sur leur valeur minimale pour réduire les pertes de débris de la myéline.
  • Recueillir les débris de la myéline dans l’interface des deux densités de sucrose.
    NOTE: débris doit apparaître sur une bande blanche vers le centre du tube.
  • Combiner les débris de la myéline brut dans un tube à centrifuger conique 50 mL et ajuster le volume à environ 35 mL à l’aide de Tris· Solution tampon de cl.
  • Homogénéiser les débris de la myéline brut avec un homogénéisateur rotatif à main stérile pendant 30-60 s.
  • Répartir uniformément la suspension entre 6 tubes ultracentrifugeuse propre et équilibre avec un volume approprié de Tris· Solution tampon de cl.
  • Centrifuger à 100 000 x g pendant 45 min à 4° C à l’aide appropriée préalablement refroidi rotor ultracentrifugeuse. Rotor accélération et décélération sur leurs valeurs maximales.
  • Comme pellets blancs solides sera maintenant visibles, éliminer le surnageant et remettre en suspension les pellets dans 10 à 15 mL de Tris· Solution tampon de cl.
  • Répartir uniformément la suspension entre 2 tubes ultracentrifugeuse propre et équilibre avec un volume approprié de Tris· Solution tampon de cl.
  • Centrifugeuse à nouveau à 100 000 x g pendant 45 min à 4 ° C à l’aide adéquate préalablement refroidi rotor ultracentrifugeuse. Rotor accélération et décélération sur leurs valeurs maximales.
  • Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules en 5 à 6 mL de PBS stérile et diviser la suspension entre un nombre approprié de tubes de micro-centrifugeuse pré-pesés 1,5 mL.
  • Centrifuger à 22 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  • Jeter le surnageant et déterminer le poids des myéline débris pellets.
  • Remettre en suspension les boulettes dans du PBS à une concentration finale de 100 mg/mL.
    NOTE: dizaine de cerveaux est suffisant pour produire 10 à 15 mL de débris de myéline de 100 mg/mL. Débris de la myéline peut être conserver à-80 ° C pendant 6 mois.
  • Marquage fluorescent de débris de la myéline
    1. Préparer la 50 µM carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) solution immédiatement avant l’emploi.
      1. À l’aide de PBS stérile, diluer une solution mère de 5 mM de CFSE préparé avec 100 % diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de travail de 50 µM.
      2. Filtrer la solution à travers un filtre de seringue 0,2 µm.
    2. Décongeler la quantité désirée de débris de myéline de 100 mg/mL et une nouvelle suspension avec une aiguille stérile de 29 g.
      NOTE: les débris de la myéline de congélation entraînera sa abandonnent solution nécessitant une remise en suspension avant utilisation.
    3. Transférer les débris la myéline dans un tube de micro-centrifugeuse pré-pesés 1,5 mL.
    4. Centrifuger à 14 800 x g pendant 10 min à 4° C. Jeter le surnageant.
    5. Remettre en suspension les débris de la myéline dans 200 µL de solution CFSE par 100 débris de myéline µL granulée.
    6. Incuber 30 min à température ambiante (RT) abrie de la lumière.
    7. Centrifuger à 14 800 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    8. Resuspendre le culot dans 600-800 µL de tampon de lavage (0,2 µm filtre stérilisé glycine 100 mM dans du PBS).
    9. Centrifuger à 14 800 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    10. Répétez les étapes 2.3.8-2.3.9 deux fois plus.
    11. Après le lavage final, déterminer le poids de la pastille de débris de la myéline et remettre en suspension à 100 mg/mL avec du PBS stérile.
      Remarque : Débris de myéline marqué peut être conserver à-80 ° C pendant 6 mois.

    • 3. la myéline débris phagocytose Assay

    Remarque : Voici la méthode de base pour l’observation de phagocytose des débris de la myéline fluorescent étiquetés. Ajout d’autres traitements et conditions expérimentales devra être optimisé par l’enquêteur.

    1. Préparation des plaques de traitement
      1. Pour chaque plaque 145 mm, recueillir des matures BMDMs dans un tube à centrifuger conique 15 mL à l’aide de 5 à 6 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) (pH 7,4).
        Remarque : Ne pas utiliser la trypsine car il peut modifier l’état d’activation des cellules18.
      2. Ajouter un volume égal de CMCM préchauffé dans chaque tube de cellules recueillies.
      3. Centrifuger à 180 x g pendant 8 min à 20 ° C. Jeter le surnageant.
      4. Remettre en suspension les cellules CMCM et comte.
      5. Ajouter à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits, 1 x 105 cellules dans 1 mL de la CMCM.
      6. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
    2. Analyse et traitement de débris de la myéline
      1. Ajouter 10 µL de 100 mg/mL CFSE étiqueté les débris de la myéline dans chaque cupule (concentration finale de 1 mg/mL).
      2. Incuber pendant 1 à 3 heures à 37 ° C, 5 % de CO2.
      3. Laver la plaque 3 fois avec du PBS stérile pour enlever les débris de la myéline non englouti.
      4. Ajouter 400 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
      5. Laver la plaque 2 fois avec du PBS stérile.
      6. Ajouter 400 µL de solution de Hoechst 33258 dans chaque puits. Incuber pendant 5 min à l’abri de la lumière de RT.
      7. Laver les plaques 2 fois avec du PBS stérile.
      8. Ajouter 200 µL de Fluoro-gel avec tampon Tris dans chaque puits pour réduire le photoblanchiment.
      9. Cellules d’image à l’aide d’un microscope inversé à epi-fluorescente capable.
        Remarque : Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de CFSE sont 494 nm et 521 nm, respectivement.
      10. Divisez le nombre de cellules positives CFSE par le nombre de noyaux afin de déterminer l’absorption relative de la myéline débris.
      11. Avant l’imagerie, maintiennent les plateaux jusqu'à 7 jours à 4 ° C, abri de la lumière.

    4. quantification des lipides intracellulaires par une coloration rouge-O huile

    Remarque : Voici la méthode de base pour l’observation des lipides intracellulaires de la myéline-débris-dérivé.L’utilisation de CFSE étiqueté les débris de la myéline n’est pas recommandée pour quantification fluorescente de ORO coloration en raison du chevauchement spectrale. Ajout d’autres traitements et conditions expérimentales devra être optimisé par l’enquêteur.

    1. Préparation de solutions de coloration
      1. Préparer la solution colorante de 0,5 % huile rouge-O (ORO).
        1. Ajouter lentement 100 mL de 100 % propylène glycol (1, 2-Propanediol) à 0,5 g d’ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) tout en remuant.
        2. Chauffer la solution à 95 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que toutes les grosses particules sont dissolvent.
          NOTE: ne pas chauffer à plus de 100 ° C.
        3. Filtrer la solution à travers un morceau de papier filtre quand elles sont encore tièdes dans un nouveau conteneur.
        4. Laisser la solution refroidir jusqu’au lendemain à RT. Solution peut être conservée pendant 1 an à température ambiante.
      2. Préparer la solution de propylène glycol 85 %.
        1. Ajouter 85 mL de 100 % propylène glycol dans 15 mL de ddiH2O. remuer jusqu'à ce que le mélange. Solution peut être conservée pendant 1 an à température ambiante.
    2. Préparation des plaques de traitement
      1. Préparer une plaque 24 puits suivant la méthode décrite à la Section 3.
      2. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
    3. Traitement de débris de la myéline
      1. Ajouter 10 µL de débris de myéline de 100 mg/mL dans chaque cupule (concentration finale de 1 mg/mL).
      2. Incuber pendant 1-3 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
      3. Laver la plaque 3 fois avec du PBS stérile pour enlever les débris non digérés de la myéline.
        Remarque : À ce stade, plaques peuvent subir la fixation immédiate ou CMCM frais peut être ajouté et cellules retournées pour une incubation de points dans le temps additionnel.
      4. Ajouter 400 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
      5. Laver la plaque 2 fois avec stérile PBS puis rencontrée aux taches.
    4. Coloration de ORO et analyse
      1. Laver la plaque fixe 3 fois avec ddiH2O.
      2. Ajouter 400 µL de 100 % propylène glycol dans chaque puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.
        NOTE: cela va réduire les reports de ddiH2O.
      3. Aspirer le propylène glycol et ajouter 400 µL de solution ORO dans chaque puits.
      4. Incuber pendant 8 min à 60 ° C.
      5. Aspirer la solution ORO. Ensuite, ajouter 400 µL de 85 % de propylène glycol dans chaque puits et incuber pendant 5 minumintes à température ambiante.
      6. Laver la plaque 3 fois avec ddiH2O.
      7. Ajouter 400 µL de solution de Hoechst 33258 dans chaque puits. Incuber 5 min à ta, abri de la lumière.
      8. Laver les plaques 2 fois avec du PBS stérile.
      9. Ajouter 200 µL de Fluoro-gel avec tampon Tris dans chaque puits.
      10. Cellules d’image à l’aide d’un microscope inversé à epi-fluorescente capable. ORO peut être photographiée à l’aide d’un ensemble standard de filtre Texas Red ou DsRed.
      11. Quantifier la rétention relative de lipides en déterminant la zone positive de ORO dans chaque champ de l’image et en divisant par le nombre de noyaux.
      12. Maintenir les plaques pendant 7 jours à 4 ° C abri de la lumière.

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    Representative Results

    Traitement des BMDMs avec CFSE étiqueté les débris de la myéline devrait produire une internalisation claire (Figure 2). Un temps de 3 heures interaction est suffisant pour BMDMs à phagocyter assez débris de myéline supplémentaire pour la détection en aval robuste, accumulation intracellulaire peut être observée avec aussi peu que 1 heure d’interaction. Cependant, quelques débris de la myéline peut toujours être présent à la surface des cellules après le lavage. Ceci peut être dû lavage insuffisant, ou n’étant ne pas pleinement intégrés durant les premiers stades de la phagocytose de particules.

    Tandis que BMDMs peut rapidement assimiler les débris de la myéline, traitement lysosomale est nécessaire avant la forme de gouttelettes lipidiques colorables ORO. Pour démontrer, BMDMs ont été incubées avec des débris de la myéline pendant 90 minutes, lavés et mis en culture pour des montants supplémentaires avant la fixation et coloration (Figure 3). La figure 4 montre qu'il y a un délai entre le début du traitement et l’aspect de lipides neutres. Il est à noter également que la rétention de lipides n’est pas stable au cours de la culture. BMDMs commencera à métaboliser les lipides accumulés peu après la formation de gouttelettes. À ce titre, nous recommandons d’attente ne dépasse pas les 24 heures entre les débris loin non englouti la myéline de lavage et de la fixation.

    Quantification de ORO teinté zone montre le taux de métabolisme lipidique de la myéline dans BMDMs (Figure 5). Après une période d’interaction de 90 minutes, les cellules ont été retournés à incubation dans le CMCM fraîche. Au cours de la période de chasse au début dans un milieu frais, les BMDMs métabolisent le composant lipidique de myéline phagocytés débris dans les lipides colorables ORO neutres. Une augmentation constante de la zone positive de ORO est typique dans les heures qui suivent l’interaction. Après 24 heures, les BMDMs auront est ou métabolisé une partie importante des lipides intracellulaires.

    Figure 1
    Figure 1 : Représentant BMDM Cultures. Quelques cellules adhérentes seront initialement observées. Le jour 3, toutes les cellules non adhérentes sont supprimés. Jour 7, matures macrophages dérivés de la moelle osseuse sont observées. Scale = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2 : Dosage des Images représentant des débris de la myéline BMDM phagocytose. Les cellules ont été traitées avec 1mg/mL CFSE étiqueté les débris de la myéline pendant 1 heure avant le lavage et la fixation avec 4 % PFA. Débris de myéline intériorisée peut être visualisée à l’aide de jeux de filtres standard GFP sur un microscope capable de l’épi-fluorescence. Scale = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 : Diagramme de conception expérimentale de l’huile rouge O (ORO). BMDM sont traités avec des débris de la myéline de 1mg/mL (dilution 1 : 100) pendant 90 minutes, suivie de lavage et de la culture dans un milieu frais avant la fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 : ORO coloration de BMDM suite à la myéline débris phagocytose. Après fixation avec 4 % PFA à temps-points indiqués, BMDMs ont été colorées avec ORO et Hoechst 33258. Des images représentatives pour chaque point de temps sont affichés. Scale = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5 : Analyse d’Image quantitative de ORO coloration. Pour la quantification d’ORO coloration, 3 puits ont été projetés à 20 X avec 5 images par puits. Tous les paramètres d’acquisition image étaient identiques. Barres d’erreur = SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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    Discussion

    Les procédures décrites ici utilisent des fraîchement isolées débris de myéline CNS brut ou les macrophages primaires de moelle osseuse. Pour réduire les dépenses de l’animales, il est recommandé que les deux cerveaux et les cellules de la moelle osseuse être cueillie dans chacune des souris au moment du sacrifice. Deux chercheurs travaillant ensemble peuvent préparer ces deux matériaux en même temps. Alternativement, les cerveaux peut être stockées à-80 ° C dans du PBS additionné d’antibiotiques avant l’isolement de débris de la myéline. Il a été notre expérience que cerveaux peut être maintenu dans ces conditions pendant jusqu'à un mois sans perte appréciable de potentiel de production de débris de la myéline.

    CFSE est utilisé pour étiqueter des débris de la myéline en raison de sa facilité d’utilisation et intensité fluorescente. Le colorant reste trempé jusqu'à estérases cellulaires clivent le groupe acétate sur la molécule14. Le groupe de libérés succinimidyl ester peut ensuite réagir avec des amides primaires, ayant pour résultat covalente à des protéines cellulaires14. CFSE est excitable à l’aide de canaux fluorescent vert standard, il y a plusieurs dérivés disponibles dans le commerce avec des propriétés spectrales différentes. Ainsi, il est possible de concevoir un test de phagocytose semblables à l’aide de plusieurs colorants fluorescents. Il est à noter aussi que parce que le colorant traverse facilement les membranes plasmiques, il peut être utilisé pour marquer les cellules apoptotiques de façon semblable comme la myéline débris19. En outre, alors que notre méthode s’appuie sur l’analyse d’image standard, avec optimisation de l’utilisateur, quantification peut être effectuée à l’aide de la cytométrie en flux ou une plaque à haut débit, système d’imagerie.

    Huile rouge O (également connu sous le nom de Solvent Red 27, ou rouge Soudan 5 b) est un colorant soluble dans la graisse qui a été largement utilisé pour colorer les lipides neutres dans les échantillons histologiques. Sa pigmentation rouge profond permettant la visualisation des lipides intracellulaires champ lumineux et microscopie fluorescente5,20par. À l’aide de la microscopie fluorescente permet monocanal robuste et imagerie quantification de ORO teinté de gouttelettes lipidiques. Alors que la méthode de coloration est simple et très reproductible, il faut au cours de la préparation de l’échantillon. Il est essentiel que l’alcool ou des fixateurs à base d’acide ne pas servir, car ils peuvent dissoudre les lipides intracellulaires, conduisant à une réduction significative de l’intensité de coloration. En outre, comme pour toute analyse quantitative d’image, l’importance des paramètres de capture d’image normalisée et l’échantillonnage non biaisé suffisante ne peut être sous-estimée. L’utilisation de contrôles de coloration est recommandée pour tenir compte de n’importe quel échantillon auto-fluorescence. Ces contrôles coloration doivent être traitées à l’identique, mais la gauche non souillées enregistré avec ORO pour mesurer le niveau d’auto-fluorescence de fond. Malgré cela, notre méthode d’analyse image exige moins optimisation que les autres techniques de quantification des lipides, comme le ORO extraction méthode21, qui exige la préparation de la courbe d’étalonnage, est plus enclin à la variabilité expérimentale et nécessite destruction de l’échantillon. L’utilisation de l’analyse d’images basée a plusieurs avantages sur les méthodes traditionnelles d’extraction ORO en ce que c’est non destructif et est compatible avec l’immunomarquage21,22 .

    Enfin, alors que les procédures décrites sont relativement simples, il est essentiel d’utiliser une technique aseptique appropriée, puisque les macrophages expriment plusieurs récepteurs qui reconnaissent les agents pathogènes associés profils moléculaires (PAMPS) tels que l’endotoxine lipopolysaccharide (LPS)23. Interaction avec bactéries contamine volonté résulter dans l’activation des macrophages et changement radical ne peut leur fonction24,25. En ce qui concerne les débris recueillis de la myéline, il est recommandé de dépistage de la contamination. Méthodes de détection d’endotoxines telles que le test limulus amebocyte lysat (LAL) ont une sensibilité élevée et ont été utilisés auparavant pour cette application5,19.

    Les macrophages jouent un rôle important dans la santé et la maladie, mais le rôle de BMDMs dans le contexte des blessures de CNS est actuellement un sujet important de l’enquête. En utilisant les méthodes décrites ici, les chercheurs peuvent commencer à mieux comprendre le mécanisme de phagocytose de débris de la myéline par BMDMs.

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    Disclosures

    Les auteurs n’ont aucune divulgation.

    Acknowledgments

    Les auteurs tiennent à remercier Glenn Sanger-Hodgson, spécialiste des médias à la faculté de médecine de l’ex-URSS pour tout son travail dans la production vidéo, l’édition et Voice-over.

    Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01GM100474 et R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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    References

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    Tags

    Numéro 130 macrophages dérivés de la moelle osseuse phagocytose Neuroscience débris de la myéline huile rouge O carboxyfluorescéine succinimidyl ester traumatisme médullaire neurotraumatologie
    <em>In Vitro</em> Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse
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    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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