Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

Abstract

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם לויקוציטים בוגרת לשרת תפקיד פיזיולוגי קריטיים כמו phagocytes מקצועי המסוגל סליקה מגוון של חלקיקים. בדרך כלל, BMDMs שנאסרת על מערכת העצבים המרכזית (CNS), אך בעקבות פציעה, הם בקלות יכולים לחדור. פעם אחת בתוך הרקמה הפצועים CNS, BMDMs הם סוג התא הראשי אחראי האישור של פציעה, נגזר הסלולר פסולת, כולל כמויות גדולות של פסולת המיאלין עשיר השומנים. ההשלכות neuropathological של BMDM חדירה של המיאלין פסולת phagocytosis בתוך מערכת העצבים הן מורכבות לא הבין היטב. הפרוטוקולים המתוארים כאן, לאפשר לחקר ישירה במבחנה BMDMs בהקשר של פגיעה CNS. אנחנו מכסים בידוד BMDM מאתר ואת התרבות המיאלין פסולת הכנה, מבחני להעריך BMDM מיאלין פסולת phagocytosis. טכניקות אלה לתוצאות לכימות חזקים ללא צורך משמעותי ציוד מיוחד או חומרים, עדיין ניתן בקלות להתאים אישית לצרכים של החוקרים.

Introduction

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם חוליה חשובה בין מערכות החיסון מולדים, מסתגלת. כמו אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים), הם יכולים לתקשר עם לימפוציטים באמצעות מצגת אנטיגן שני ולשחרר ציטוקין1,2,3. עם זאת, כמו המקצועי phagocytes, התפקיד העיקרי שלהם היא לנקות פתוגנים, תאים בגילאי ופסולת הסלולר1,4. בעקבות פגיעה בחוט השדרה (מדע), כמויות ניכרות של פסולת המיאלין נוצר מתוך oligodendrocytes גוסס, סוג התא אחראי על מערכת העצבים המרכזית האקסון myelination5. אנחנו ואחרים הראו כי סיווג של המיאלין פסולת הוא בראש ובראשונה באחריות שחדר BMDMs5,6,7. עם זאת, תוך פגיעה בחוט השדרה הוצע היבלעות באתרים של פסולת המיאלין להעביר תאים בדרך כלל אנטי דלקתיות אלה לכיוון מדינת פרו דלקתיים5,8,9. כמתווכים מרכזיים של נוירו-דלקת חוט השדרה נפגע, BMDMs הם מטרות קליני חשוב.

כדי לסייע לחקור את השפעת BMDMs בחוט השדרה הפגוע, פיתחנו מודל במבחנה ללמוד ישירות איך BMDMs להגיב המיאלין פסולת. כדי לשפר את הרלוונטיות ביולוגי, BMDMs מאתר ראשי ופסולת המיאלין מבודד טריים משמשים האלה החקירות. ככזה, השיטות המובאות כאן פירוט גם את הבידוד והתרבות של BMDMs מאתר ראשי, טכניקה הדרגתיות סוכרוז ששונה המשמשת כדי לבודד CNS מאתר נגזר המיאלין פסולת10,11,12. המיאלין פסולת יכול להיקרא בקלות עם תיוג הפלורסנט, אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), כדי מעקב אחר שלה הפנמה מאת BMDMs. CFSE מתאים היטב עבור יישום זה כי זה הלא-ציטוטוקסיות, היתרים ספקטרום פלורסנט הצר שלה ריבוב עם פלורסנט אחרים רגשים13,14. בעקבות phagocytosis, המיאלין פסולת שומנים מועברים דרך lysosomes, כחבילה ליפידים נייטרלי לתוך השומנים תאיים טיפות5. כדי לכמת את הצטברות השומנים תאיים, נציג של שמן אדום O (אורו) צביעת שיטת ממוטבים לניתוח תמונה כמותית. שיטה מכתימים פשוטה זו מייצרת תוצאות לשחזור חזקים כימות15. שיטות אלה להקל על המחקר של המיאלין פסולת השמירה phagocytosis ו ליפיד עם ציוד מיוחד מוגבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השיטות המתוארות כאן, בסעיף 2 אושרו על ידי פלורידה המדינה אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC), מנחים שנקבעו עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה, 8th מהדורה מדריך . כל זה בשימוש פרוטוקול זה בעלי הבית במתקן חיות מעבדה ייעודית עד השימוש. אין ויוו ניסוי היה לפני שבוצעו כדי להקריב. מספרים בעלי חיים היו מבוססים על הצורך ניסיוני באמצעות תא הממוצע ואוספים המיאלין כמדריך על מנת למזער את השימוש.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הדור של מח עצם-derived מקרופאגים (BMDMs) (סעיף 1), הכנת מיאלין במוח, נגזר fluorescently שכותרתו פסולת (סעיף 2), נוהל כללי ניתוח phagocytosis פסולת מיאלין (סעיף 3), ו ההליך כללי לניתוח של הצטברות השומנים פסולת מיאלין (סעיף 4). ריאגנט הכנה, קציר תאים, מניפולציה, אוסף המיאלין, תיוג וביצועים assay צריכות להסתיים ב אבטחה למינריות זרימת האוויר ארון.

1. דור של מקרופאגים הנגזרות מח העצם העיקרי

  1. הכנת מקרופאג מלאה תרבות בינוני (CMCM)
    הערה:     הדור מקרופאג ממח העצם מחייב השימוש של גורם מגרה המושבה מקרופאג (M-CSF). הכנת מנצל L929 מאתר פיברובלסט ממוזגים מדיה כמקור של M-CSF.
    1. הפקת מדיה מאתר פיברובלסט ממוזגים L929 על ידי תאים culturing במנות 145 מ מ 50 מ של גלוקוז גבוהות (4500 mg/L L-גלוקוז) Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 5% נולד עגל סרום (רכיבי NC) ו פניצילין/סטרפטומיצין במשך 7 ימים.
    2. לאסוף את המדיה מתרבויות לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 3500 x g, 4 מעלות צלזיוס.
    3. לסנן supernatants דרך מסנן מזרק 0.2 µm לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל חדש. ניתן לאחסן מדיה ממוזגים ב-80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
    4. כדי גלוקוז גבוהות DMEM, להוסיף 5% vol/כרך רכיבי NC, 15% vol/כרך L929 מאתר פיברובלסט ממוזגים DMEM ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין. ניתן לאחסן מדיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים. חם עד 37 ° C לפני השימוש.
  2. אוסף של תאים במח העצם העיקרי מקרופאג אינדוקציה
    הערה: באמצעות העכבר הזה פרוטוקול אחד יפיק כ-20 מיליון הנגזרות מח עצם מקרופאגים (BMDMs).
    1. המתת חסד המספר בשבוע 8-10 עכברים הישן באמצעות CO2 חנק לקווים מנחים סטנדרטיים ואחריו נקע בצוואר הרחם הרצוי.
    2. לחטא את החיה באמצעות 70% אתנול (vol/כרך): H2O, קולח הפרווה.
    3. לחתוך חור קטן בבטן, בזהירות להפשיל את העור כדי לחשוף את הרקמה הבסיסית. לטפל כדי לא לנקב חלל הצפק.
    4. הסר את שתי הרגליים האחוריות החל הירך ואת הסוף על הקרסול. המקום הרקמה שנאספו לתוך צלחת פטרי 100 מ מ המכיל פוספט סטרילי 5-10 מ ל תמיסת מלח (PBS) בתוספת 1% buffered פניצילין/סטרפטומיצין.
      הערה: כאשר עיבוד מספר חיות ודא לשמור מנות על קרח כדי להגביל את רקמת השפלה.
    5. הסר העצם באמצעות אזמל משרירים ורקמות. רק את עצם הירך ואת שוקה משמשים לאוסף תא, השוק יכול להימחק.
    6. לחשוף את חלל מח העצמות שנאספו על ידי קיצוץ קטע קטן משני הצדדים עם אזמל.
    7. באמצעות מחט 25 גרם, לרוקן את חללים מח עם CMCM לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. העצמות יופיעו לבן ברגע שהם. יש כבר מספיק סמוקות.
    8. עם סיום איסוף, להתסיס aspirates עם מחט 18 גרם 30-90 שס. שנוצר השעיה תא בודד.
      הערה: ניתן לבצע צעד פירוק תאי הדם האדומים (RBC) אופציונלי בשלב זה. לאחרונה הוצע כי תוכן תאיים ברזל עשויים להשפיע את ההשפעות של המיאלין פסולת על קיטוב מקרופאג16. לקבלת מידע אודות הכללת צעד פירוק RBC מתייחסים Trouplin et al. 17.
    9. לסנן את המתלים דרך מסננת סטרילית תא מיקרומטר 70 לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל חדש.
    10. זרע נאסף תאים באופן שווה לתוך 145 מ מתא-תרבות-מנות המכיל 15-20 מ ל CMCM. השתמש בערך שלושה תרבות מנות לכל העכבר הקריב. דגירה תרבויות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    11. לאחר 72 שעות לשטוף צלחות פעם אחת עם PBS סטרילי כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, ואז להוסיף 15-20 מ"ל CMCM טריים. תקופת דגירה תרבויות של 4 ימים נוספים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. לאחר 7 ימים של תרבות הכולל, תאי מח עצם hematopoietic בתחילה מבודד יהיה בוגר BMDMs (איור 1).

2. דור של מיאלין במוח, נגזר Fluorescently שכותרתו פסולת

הערה: ניתן לאחסן כל ריאגנטים ב 4 ° C עד כחודש.

  1. הכנה של המיאלין פסולת אוסף ריאגנטים
    1. הכנת Tris· Cl בופר.
      1. 800 מ ל מזוקקים יונים H2O (ddiH2O) להוסיף 20 מ של 1 מ' Tris· קלרנית, pH 7.45 (ריכוז סופי של 20 מ מ) ו- 20 מ ל 100 מ מ נה2EDTA (ריכוז סופי 2 מ מ).
      2. להתאים את ה-pH ל 7.45. לכוון את עוצמת הקול עד 1000 מ"ל עם ddiH2O. מסנן פתרון באמצעות יחידת סינון 0.2 µm.
    2. להכין פתרון סוכרוז 1 מ'.
      1. 100 מ של Tris· Cl מאגר פתרון, להוסיף 68.46 גר' סוכרוז. להתאים את עוצמת הקול כדי 200 מ עם Tris· Cl בופר. לסנן פתרון באמצעות יחידת סינון 0.2 µm.
    3. להכין 200 מ של 0.32 M סוכרוז פתרון על ידי דילול הפתרון 1 מ' עם Tris· Cl מאגר פתרון 0.83:0.16 (vol/כרך).
    4. הכן 150 מ ל 0.83 M סוכרוז פתרון על ידי דילול הפתרון 1 מ' עם Tris· Cl מאגר פתרון 0.83:0.16 (vol/כרך).
  2. אוסף של המוח-derived המיאלין גולמי פסולת
    הערה: שיטת איסוף המתוארים כאן מיועדת הבידוד של פסולת גסה מיאלין.
    1. המתת חסד עכברים 10-12 8-10 שבועות של גיל באמצעות CO2 חנק לקווים מנחים סטנדרטיים ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. לנתח את המוח ומניחים בצלחת 100 מ מ המכיל 10 מ"ל של 0.32 M סוכרוז פתרון.
שמור את המנה על קרח.
  • באמצעות מספריים כירורגיים סטרילי לחתוך את המוח לתוך חתיכות כ 5 מ מ3 בגודל.
  • להעביר את הרקמה שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ"ל ולהוסיף כ 30 מ של 0.32 M סוכרוז פתרון.
  • Homogenize עם מהמגן סטרילי ידניים סיבוביים, עד פתרון חלקה מושגת.
  • לדלל את המוח homogenized לאמצעי הסופי של 90 מ עם 0.32 M סוכרוז פתרון.
  • כדי שש דקות קיר ultracentrifuge פוליפרופילן 38.5-mL צינורות, להוסיף 20 מ של 0.83 M סוכרוז פתרון.
  • להוסיף בעדינות הפתרון הומוגני המוח העליון של הפתרון סוכרוז 0.83 מ', מקפיד לא לערבב את שתי השכבות.
  • איזון כל שפופרת עם הפתרון 0.32 M סוכרוז.
  • צנטריפוגה ב g 100,000 x למשך 45 דקות ב 4° C שימוש נאות של טרום מקורר רוטור ultracentrifuge. הגדר הרוטור האצה והאטה לערכי המינימום כדי להפחית את אובדן פסולת מיאלין.
  • לאסוף את הלכלוך המיאלין הממשק של שתי הצפיפויות סוכרוז.
    הערה: פסולת אמור להופיע כלהקה לבנה לכיוון המרכז של הצינור.
  • לשלב את הלכלוך המיאלין גולמי לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל ולכוונן את העוצמה כ 35 מ ל באמצעות Tris· Cl בופר.
  • Homogenize ההריסות המיאלין גולמי עם מהמגן סטרילי רוטרי ידניים עבור s 30-60.
  • לחלק באופן שווה את המתלים בין 6 צינורות ultracentrifuge נקי ואיזון עם אמצעי אחסון המתאים של Tris· Cl בופר.
  • צנטריפוגה ב g 100,000 x למשך 45 דקות ב 4° C שימוש נאות של טרום מקורר רוטור ultracentrifuge. הגדר הרוטור האצה והאטה את הערכים המרבי שלהם.
  • כמו כדורי לבן מוצק עכשיו יהיה גלוי, למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את כדורי ב 10-15 מ ל Tris· Cl בופר.
  • לחלק באופן שווה את המתלים בין 2 צינורות ultracentrifuge נקי ואיזון עם אמצעי אחסון המתאים של Tris· Cl בופר.
  • צנטריפוגה שוב ב g 100,000 x למשך 45 דקות ב 4 ° C שימוש נאות של טרום מקורר רוטור ultracentrifuge. הגדר הרוטור האצה והאטה את הערכים המרבי שלהם.
  • למחוק את תגובת שיקוע resuspend כדורי ב- 5-6 מ"ל של PBS סטרילי, לחלק את המתלים בין מספר מתאים של mL 1.5 מראש שנשקל מיקרו-צנטריפוגה צינורות.
  • צנטריפוגה-22,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
  • למחוק את תגובת שיקוע ולקבוע את המשקל של כדורי פסולת מיאלין.
  • מחדש להשעות את כדורי ב- PBS כדי ריכוז סופי של 100 מ"ג/מ"ל.
    הערה: 10-12 המוח מספיקה כדי לייצר 10-15 מ של 100 מ"ג/מ"ל המיאלין פסולת. המיאלין פסולת ניתן לחנות ב-80 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
  • המיאלין פסולת תיוג פלורסנט
    1. הכינו את הפתרון אסתר (CFSE) 50 מיקרומטר succinimidyl carboxyfluorescein מיד לפני השימוש.
      1. באמצעות PBS סטרילי, לדלל 5 מ מ פתרון מניות של CFSE מוכן עם 100% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ריכוז העבודה הסופית של 50 מיקרומטר.
      2. לסנן פתרון דרך מסנן מזרק 0.2 µm.
    2. להפשיר את הכמות הרצויה של 100 מ"ג/מ"ל המיאלין פסולת והשהה מחדש עם מחט סטרילית ג'י 29.
      הערה: הקפאת ההריסות המיאלין יגרום לו לעזוב הפתרון המחייב resuspension לפני השימוש.
    3. העברת פסולת המיאלין שפופרת מיקרו-צנטרפוגה mL 1.5 שנשקל מראש.
    4. צנטריפוגה ב 14,800 x g 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    5. Resuspend ההריסות מיאלין ב 200 µL של CFSE פתרון לכל 100 µL מיאלין פסולת מגורען.
    6. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מוגן מפני אור.
    7. צנטריפוגה ב 14,800 x g 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    8. Resuspend בגדר ב- 600-800 µL שטיפת מאגר (0.2 µm מסנן לעקר גליצין 100 מ מ ב- PBS).
    9. צנטריפוגה ב 14,800 x g 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    10. חזור על צעדים 2.3.8-2.3.9 עוד פעמיים.
    11. לאחר השטיפה הסופית לקבוע את משקל בגדר פסולת המיאלין, להשהות מחדש כדי 100 מ"ג/מ"ל עם PBS סטרילי.
      הערה: המיאלין שכותרתו פסולת יכולה להיות חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.

    • 3. מיאלין פסולת Phagocytosis Assay

    הערה: הרשימה הבאה היא השיטה הבסיסית להבחנה phagocytosis של המיאלין שכותרתו fluorescently פסולת. תוספת של טיפולים אחרים ותנאים ניסיוני צריך להיות מותאם על ידי החוקר.

    1. הכנת לוחות טיפול
      1. על כל צלחת 145 מ מ, לאסוף BMDMs בוגרת לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל באמצעות 5-6 מ"ל של 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ב- saline פוספט באגירה של Dulbecco (dPBS) (pH 7.4).
        הערה: אל תשתמש/י טריפסין כמו זה עשוי לשנות את מצב ההפעלה תאים18.
      2. להוסיף אמצעי שווה של CMCM מראש ומחוממת כל שפופרת של תאים שנאספו.
      3. צנטריפוגה ב 180 x g במשך 8 דקות ב 20 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
      4. להשעות מחדש תאים CMCM וספירה.
      5. על כל טוב של צלחת התרבות התא 24-ובכן, להוסיף 1 x 105 תאים 1 מ"ל של CMCM.
      6. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
    2. ניתוח וטיפול פסולת של המיאלין
      1. להוסיף 10 µL של 100 מ"ג/מ"ל CFSE שכותרתו המיאלין פסולת מכל קידוח (הריכוז הסופי של 1 מ"ג/מ"ל).
      2. תקופת דגירה של 1-3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      3. לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר את המיאלין שפוקדת ללא פסולת.
      4. להוסיף 400 µL של 4% paraformaldehyde כל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
      5. לשטוף צלחת 2 פעמים עם PBS סטרילי.
      6. להוסיף 400 µL של פתרון Hoechst 33258 כל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות ב RT מוגן מפני אור.
      7. לשטוף צלחות 2 פעמים עם PBS סטרילי.
      8. להוסיף 200 µL של פטור-ג'ל עם מאגר טריס בכל טוב כדי להפחית את photobleaching.
      9. התמונה תאים באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת epi-פלורסנט הפוכה.
        הערה: אורכי הגל עירור, פליטה של CFSE הם 494 nm ו 521 nm, בהתאמה.
      10. מחלקים את מספר התאים חיובי CFSE לפי מספר גרעינים לקביעת יחסי המיאלין פסולת ספיגת.
      11. לפני הדמיה, לשמור על לוחות עד 7 ימים ב 4 ° C מוגן מפני אור.

    4. כימות של ליפידים תאיים באמצעות שמן מכתים אדום-O

    הערה: הרשימה הבאה היא השיטה הבסיסית להבחנה ליפידים מיאלין-פסולת-derived תאיים.השימוש CFSE שכותרתו המיאלין פסולת אינה מומלצת פלורסנט כימות של אורו מכתים בשל חפיפה ספקטרלי. תוספת של טיפולים אחרים ותנאים ניסיוני צריך להיות מותאם על ידי החוקר.

    1. הכנת מכתים פתרונות
      1. להכין פתרון מוכתמים בשמן האדום-O (אורו) 0.5%.
        1. לאט לאט להוסיף 100 מ של 100% פרופילן גליקול (1, 2-Propanediol) ל- 0.5 גר' אורו (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) תוך כדי ערבוב.
        2. מחממים את הפתרון ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, או עד כל חלקיקים גדולים הם התפרקה.
          הערה: לא מחממים מעל 100 מעלות צלזיוס.
        3. לסנן פתרון באמצעות פיסת נייר סינון בזמן עדיין חם לתוך מיכל חדש.
        4. לאפשר פתרון לילה מגניב-RT. פתרון שניתן לאחסן עד 1 שנה ב- RT.
      2. להכין 85% פרופילן גליקול פתרון.
        1. להוסיף מ 85 ל 100% פרופילן גליקול 15 מ"ל של ddiH2O. מערבבים עד מעורב. הפתרון ניתן לאחסן עד 1 שנה ב- RT.
    2. הכנת לוחות טיפול
      1. להכין צלחת 24-ובכן בעקבות השיטה המתוארים בסעיף 3.
      2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
    3. טיפול פסולת המיאלין
      1. להוסיף 10 µL של 100 מ"ג/מ"ל המיאלין פסולת מכל קידוח (הריכוז הסופי של 1 מ"ג/מ"ל).
      2. תקופת דגירה של 1-3 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      3. לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS סטרילי כדי הסרת לכלוך שאינו מתעכל מיאלין.
        הערה: בשלב הזה, צלחות ניתן גם לעבור קיבוע מיידית או CMCM טריים ניתן להוסיף וחזר תאי הדגירה נקודות זמן נוסף.
      4. להוסיף 400 µL של 4% paraformaldehyde כל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
      5. לשטוף צלחת 2 פעמים עם PBS ואז procced כדי להכתים סטרילי.
    4. אורו מכתים וניתוח
      1. לשטוף צלחת קבוע 3 פעמים עם ddiH2O.
      2. להוסיף 400 µL של 100% פרופילן גליקול מכל קידוח, תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
        הערה: פעולה זו תקטין דחויים של ddiH2O.
      3. האחות של פרופילן גליקול ולהוסיף 400 µL של אורו פתרון כל טוב.
      4. תקופת דגירה של 8 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.
      5. האחות הפתרון אורו. לאחר מכן, להוסיף µL 400 של 85% פרופילן גליקול מכל קידוח, תקופת דגירה של minumintes 5-RT.
      6. לשטוף צלחת 3 פעמים עם ddiH2O.
      7. להוסיף 400 µL של פתרון Hoechst 33258 כל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות-RT, מוגן מפני אור.
      8. לשטוף צלחות 2 פעמים עם PBS סטרילי.
      9. להוסיף 200 µL של פטור-ג'ל עם טריס מאגר כל טוב.
      10. התמונה תאים באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת epi-פלורסנט הפוכה. אורו יכול לדימות באמצעות ערכת מסנן סטנדרטי, טקסס אדום או DsRed.
      11. לכמת השומנים היחסי השמירה על ידי קביעת אזור חיובי אורו בכל שדה תמונה חילוק זה המספר של גרעין האטום.
      12. לשמור על לוחות עבור 7 ימים ב 4 ° C מוגן מפני אור.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    טיפול של BMDMs עם CFSE שכותרתו המיאלין פסולת אמור להניב ברור הפנמה (איור 2). בעוד זמן האינטראקציה 3 שעות מספיקה עבור BMDMs phagocytose מספיק פסולת המיאלין נוסף לגילוי במורד הזרם חזקים, הצטברות תאיים יכול להיות שנצפו עם מעט ככל 1 שעה של אינטראקציה. עם זאת, יש שרידים המיאלין עדיין ייתכן בהווה על פני התא לאחר הרחצה. זה יכול להיות בגלל כביסה לא מספיק, או לא להיות מלא הפנימו כבר בשלבים המוקדמים של phagocytosis חלקיקים.

    בעוד BMDMs במהירות יכול להפנים את המיאלין פסולת, עיבוד lysosomal נדרש לפני אורו השומנים מלאכת יד טיפות טופס. להפגין, BMDMs היו מודגרות עם מיאלין פסולת במשך 90 דקות, לשטוף, תרבותי עבור סכומים נוספים של זמן לפני קיבוע, מכתים (איור 3). איור 4 מראה שיש עיכוב בין טיפול חניכה והמראה השומנים נייטרלי. יש גם לציין כי השומנים השמירה אינה יציבה במהלך תרבות. BMDMs יתחיל לעכל שומנים שהצטברו זמן קצר לאחר היווצרות droplet. ככזה, אנו ממליצים על ההמתנה. לא יותר מ-24 שעות בין כביסה משם שפוקדת ללא מיאלין פסולת קיבעון.

    כימות של אורו צבעונית אזור מדגים את קצב חילוף החומרים של השומנים מיאלין ב- BMDMs (איור 5). לאחר תקופה של 90 דקות אינטראקציה, תאים הוחזרו הדגירה ב CMCM טריים. במהלך התקופה הקדומה צ'ייס בינוני טריים, BMDMs לעכל הרכיב השומנים מיאלין phagocytosed פסולת לתוך נייטרלי אורו ליפידים מלאכת יד. עלייה מתמדת באזור חיובי אורו הוא אופייני בשעות בעקבות המפגש. לאחר 24 שעות אולם, BMDMs יהיו effluxed או מטבוליזם ניכר של ליפידים תאיים.

    Figure 1
    איור 1 : נציג BMDM תרבויות. כמה תאים חסיד יתקיימו בתחילה. יום 3 תאים שאינם מחסידי יוסרו. על ידי 7 יום, מקרופאגים הנגזרות מח עצם בוגרת שנצפו. סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 2
    איור 2 : נציג תמונות של BMDM מיאלין פסולת Phagocytosis Assay. תאים שטופלו 1 מ"ג/מ"ל CFSE שכותרתו המיאלין פסולת למשך שעה לפני כביסה, קיבעון עם 4% מחברים. למביטה המיאלין פסולת ניתן לאבחן באמצעות מערכות סינון GFP רגיל על מיקרוסקופ בעל יכולת epi-פלורסנט. סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 3
    איור 3 : תרשים של שמן אדום O (אורו) תכנון ניסויים. BMDM מטופלים עם פסולת המיאלין 1 מ"ג/מ"ל (דילול מטריים) במשך 90 דקות, ואחריו כביסה ותרבות בינוני טריים לפני קיבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 4
    איור 4 : אורו כתמים BMDM בעקבות המיאלין פסולת Phagocytosis. קיבוע הבאים עם 4% PFA המצוין הזמן-נקודות, BMDMs היו מוכתמים אורו, Hoechst 33258. מוצגות תמונות נציג עבור כל הזמן-נקודה. סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 5
    איור 5 : ניתוח תמונה כמותית של אורו מכתים. על כימות של אורו מכתים, 3 בארות היו צילמו בגיל 20 X עם 5 תמונות לכל טוב. כל ההגדרות רכישת התמונה היו זהים. קווי שגיאה = ב- SEM (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    ההליכים המתוארים כאן לנצל טרי מבודד פסולת המיאלין גולמי של CNS והן מקרופאגים הנגזרות מח העצם העיקרי. כדי לצמצם את ההוצאה על בעלי חיים, אנו ממליצים כי שני המוח, תאי מח העצם להיות שנקטפו כל עכבר בזמנו של הקרבה. שני החוקרים עובדים ביחד יכולים להכין שני חומרים בו זמנית. לחלופין, ניתן לאחסן את המוח ב- 80 ° C ב- PBS בתוספת אנטיביוטיקה לפני המיאלין פסולת בידוד. זה היה הניסיון שלנו זה המוח יכול להישמר בתנאים אלו במשך עד חודש ללא אובדן ניכר של המיאלין פסולת דור פוטנציאל.

    CFSE משמש להוספת תווית המיאלין פסולת בשל קלות השימוש ואת עוצמת נמכרות. לצבוע נשאר quenched עד esterases הסלולר קליב הקבוצה אצטט המולקולה14. הקבוצה אסתר succinimidyl פריד יכול להגיב עם amides העיקרי, וכתוצאה מכך מצורף קוולנטיות החלבונים14. בעוד CFSE הוא מתרגש באמצעות ערוצי ניאון ירוק רגיל, יש מספר נגזרות זמינים מסחרית עם תכונות ספקטרליות שונים. לכן ניתן לתכנן וזמינותו phagocytosis דומה באמצעות צבעי פלורסנט מרובים. יש גם לציין כי כי לצבוע חוצה בקלות ממברנות פלזמה, זה יכול לשמש תווית בתאים אפופטוטיים להיפגע באופן דומה המיאלין פסולת19. יתר על כן, בעוד השיטה שלנו נשענת על ניתוח תמונה רגילה, עם אופטימיזציה למשתמש, כימות ניתן לבצע באמצעות cytometry זרימה או צלחת תפוקה גבוהה מערכת הדמיה.

    O אדום שמן (הידוע גם בשם הממס אדום 27 או סודאן אדום 5B) הוא צבע מסיס בשומן, שבו נעשה שימוש נרחב כתם ליפידים ניטרלי, בדגימות היסטולוגית. פיגמנטציה אדום עמוק שלה מאפשר הדמיה של ליפידים תאיים באמצעות שדה בהיר וגם מיקרוסקופ פלואורסצנטי5,20. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר כימות הדמיה וחזק ערוץ אחד של אורו צבעונית השומנים טיפות. בעוד השיטה צביעת מאוד לשחזור ופשוט, יש לנקוט במהלך הכנת הדוגמא. זה קריטי כי אלכוהול או כתות ומייצבים מבוססי חומצה אין להשתמש, כפי שהם יכול להמיס שומנים תאיים, המוביל לירידה משמעותית מכתים בעוצמה. בנוסף, כמו עם כל ניתוח תמונה כמותית, החשיבות של הגדרות לכידת תמונה סטנדרטית ודגימה לא משוחד מספיק לא תהיה מופחתת. השימוש של צביעת פקדים מומלץ לקחת בחשבון כל דגימה אוטומטית-זריחה. פקדים מכתימים כגון יש להתייחס באופן זהה, אבל שמאל מוכתם. עם אורו כדי למדוד את רמת רקע אוטומטי-זריחה. למרות זאת, שיטת ניתוח התמונה שלנו דורש אופטימיזציה פחות מאשר טכניקות כימות השומנים אחרות, כגון אורו החילוץ שיטת21, אשר דורש הכנה עיקול רגיל, הוא נוטה יותר השתנות ניסיוני, מחייבת הרס של המדגם. השימוש של התמונה לפי ניתוח יש מספר יתרונות על השיטות המסורתיות של מיצוי אורו בזה זה שאינו הרסני והוא תואם עם21,immunostaining22 .

    לבסוף, בעוד ההליכים המתוארים הם יחסית ישר קדימה, זה קריטי כי טכניקה נכונה aseptic לשמש, שכן המקרופאגים מבטאים קולטנים מרובים מזהה הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPS) כגון אנדוטוקסין ליפופוליסכריד (LPS)23. אינטראקציה עם בקטריאלי מזהם הרצון לגרום מקרופאג ההפעלה והוא יכול שינוי דרמטי שלהם פונקציה24,25. לגבי ההריסות המיאלין שנאספו, בדיקת זיהום מומלץ. אנדוטוקסין שיטות זיהוי כמו amebocyte limulus lysate וזמינותו (LAL) יש רגישות גבוהה, שימשו בעבר עבור יישום זה,5,19.

    מקרופאגים יש תפקיד חשוב על בריאות ומחלה, אך תפקידו של BMDMs בהקשר של מערכת העצבים המרכזית פציעה הוא כיום נושא חשוב של החקירה. שימוש בשיטות המתוארות כאן, חוקרים יכולים להתחיל להבין טוב יותר את המנגנון של המיאלין פסולת phagocytosis על-ידי BMDMs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים יש אין גילויים.

    Acknowledgments

    המחברים רוצה להודות גלן סנגר-הודג'סון, מומחה בתקשורת במכללה לרפואה של בריה"מ לשעבר על כל העבודה הפקות וידאו, עריכה, ואת הקריינות.

    עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM100474 ו- R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    מדעי המוח גיליון 130 מקרופאג הנגזרות מח עצם phagocytosis המיאלין פסולת שמן אדום O carboxyfluorescein succinimidyl אסתר פגיעה בחוט השדרה neurotrauma
    <em>במבחנה</em> Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter