Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Fagocytose af Myelin resterne af knoglemarv-afledte makrofager

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Vi præsentere metoder til at vurdere den fagocyterende kapacitet af primære murine knoglemarv-afledte makrofager ved hjælp af fluorescently mærket myelin debris og intracellulære lipid droplet farvning.

Abstract

Knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) er modne leukocytter, der tjener en kritisk fysiologisk rolle som professionelle fagocytter i stand til at rydde en bred vifte af partikler. Normalt BMDMs er begrænset fra centralnervesystemet (CNS), men efter en skade, kan de let infiltrere. Én gang inden for den tilskadekomne CNS væv, BMDMs er den primære type ansvarlig for regnskabsafslutning skade-afledte celleaffald, herunder store mængder lipid rige myelin debris. De neuropatologiske udløbere af BMDM infiltration og myelin vragrester fagocytose inden for CNS er komplekse og ikke godt forstået. De protokoller er beskrevet her, giver mulighed for direkte i in vitro -undersøgelse af BMDMs i forbindelse med CNS skade. Vi dækker murine BMDM isolation og kultur, myelin vragrester forberedelse og assays for at vurdere BMDM myelin vragrester fagocytose. Disse teknikker giver robust kvantificerbare resultater uden behov for betydelige specialiseret udstyr eller materialer, men let kan tilpasses til at imødekomme behovene hos forskere.

Introduction

Knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) er et vigtigt bindeled mellem de medfødte og adaptive immunforsvar. Som antigen præsentere celler (PMV'er), de kan kommunikere med lymfocytter via både antigen præsentation og cytokin frigive1,2,3. Men som professionelle fagocytter, deres primære funktion er at rydde patogener, alderen celler og celleaffald1,4. Efter en rygmarvsskade (SCI) genereres betydelige mængder af myelin vragrester fra døende oligodendrocytes, ansvarlig for CNS axon myelination5celletype. Vi og andre har vist, at clearance af myelin vragrester er primært ansvar infiltrerer BMDMs5,6,7. Men inden for rygmarvsskade websteder engulfment af myelin vragrester er blevet foreslået til at flytte disse normalt anti-inflammatoriske celler mod en pro-inflammatoriske tilstand5,8,9. Som centrale mediatorer af neuro-betændelse i såret rygmarven er BMDMs vigtige kliniske mål.

For at hjælpe med at undersøge BMDMs indflydelse i den skadede rygmarven, har vi udviklet en in vitro- model for at direkte studere hvordan BMDMs reagere på myelin debris. For at forbedre biologisk relevans, bruges både primære murine BMDMs og frisk isolerede myelin snavs i disse undersøgelser. Som sådan, de metoder, der præsenteres her også detaljeret isolation og kultur af primære murine BMDMs, og en modificeret saccharose gradient teknik bruges til at isolere murine CNS afledt myelin vragrester10,11,12. Myelin snavs kan let mærket med et fluorescerende farvestof, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), til at spore dens internalisering af BMDMs. CFSE er velegnet til dette program for det er ikke-cytotoksiske, og dens smalle fluorescerende spectrum tilladelser multiplexing med andre fluorescerende sonder13,14. Efter fagocytose, myelin vragrester lipider transporteres gennem lysosomer og pakkede som neutral lipider i intracellulære lipid dråber5. For at kvantificere denne intracellulære lipid ophobning, præsenterer vi en olie røde O (ORO) farvning metode optimeret til kvantitative billedanalyse. Denne enkle farvning metode producerer robuste reproducerbare resultater og kvantificering15. Disse metoder lette undersøgelsen af myelin vragrester fagocytose og lipid opbevaring med begrænset specialiseret udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metoderne beskrevet her og i afsnit 2 er blevet godkendt af Florida State University institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og følger i Guide retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr, 8th edition . Alle dyr, der anvendes i dette i denne protokol er hus i en dedikeret laboratorium animalsk facilitet indtil brug. Ingen i vivo eksperimenter blev udført før at ofre. Animalske numre var baseret på eksperimentel behov ved hjælp af gennemsnitlige celle og myelin samlinger som en guide for at minimere forbruget.

Bemærk: Denne protokol beskriver generation af knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) (afsnit 1), udarbejdelse af fluorescently mærket hjerne-afledte myelin vragrester (afsnit 2), den generelle fremgangsmåde til at analysere myelin vragrester fagocytose (afsnit 3), og den generelle procedure for analyse af myelin vragrester lipid ophobning (afsnit 4). Reagens, celle høst og manipulation, myelin samling og mærkning og analyse ydeevne bør være afsluttet i en laminar airflow biosikkerhed kabinet.

1. generation af primære knoglemarv-afledte makrofager

  1. Forberedelse af komplet makrofag næringssubstratet (CMCM)
    Bemærk:     makrofag generation fra knoglemarv kræver brug af makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF). Denne forberedelse udnytter L929 murine fibroblast aircondition medier som kilde til M-CSF.
    1. Generere L929 murine fibroblast aircondition medier af dyrkningsbaserede celler i 145 mm retter med 50 mL af høje glukose (4500 mg/L L-glucose) Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 5% nye født kalveserum (NCS) og Penicillin/Streptomycin i 7 dage.
    2. Indsamle medier fra kulturer i 50 mL konisk centrifugeglas, og der centrifugeres i 30 minutter på 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtrer analysere gennem en 0,2 µm sprøjte filter i en ny konisk 50 mL-centrifugerør. Konditioneret medier kan opbevares ved-80 ° C i op til 6 måneder.
    4. Høje glukose DMEM, tilføje 5% vol./vol. NCS, 15% vol/vol L929 murine fibroblast konditioneret DMEM og 1% Penicillin/Streptomycin. Medierne kan opbevares ved 4 ° C i 2-3 måneder. Varm til 37 ° C før brug.
  2. Indsamling af primære knoglemarv celler og makrofag induktion
    Bemærk: Ved hjælp af denne protokol en mus vil generere ca 20 millioner knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs).
    1. Aflive det ønskede antal 8-10 uge gamle mus ved hjælp af standard CO2 kvælning retningslinjer efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Desinficere dyret ved hjælp af 70% (vol/vol) ethanol: H2O, mætte pels.
    3. Skær en lille åbning i maven og træk forsigtigt tilbage i huden til at afsløre de underliggende væv. Passe på ikke punktere bughulen.
    4. Fjerne begge bagben starter ved hoften og slutter på anklen. Sted indsamlede vævet ind i en 100 mm petriskål indeholdende 5-10 mL sterilt phosphat bufferet saltvand (PBS) suppleret med 1% Penicillin/Streptomycin.
      Bemærk: Når behandlingen flere dyr Sørg for at holde retter på isen for at begrænse væv nedbrydning.
    5. Fjerne muskel og bindevæv fra knoglen ved hjælp af en skalpel. Kun femur og tibia bruges til celle samling, fibula kan kasseres.
    6. Udsætte marv hulrum af de indsamlede knogler ved at trimme et lille afsnit fra hver ende med en skalpel.
    7. Bruger en 25g kanyle, skylle marv hulrum med CMCM i en konisk 50 mL-centrifugerør. Knoglerne bliver vist hvide, når de har været tilstrækkeligt skyllet.
    8. Når indsamlingen er afsluttet, agitere aspirates med en 18g kanyle til 30-90 s der genereres et enkelt cellesuspension.
      Bemærk: En valgfri røde blodlegemer (RBC) lysis trin kan udføres på dette tidspunkt. Det er fornylig blevet foreslået, at intracellulære jernindhold kan påvirke effekten af myelin snavs på makrofag polarisering16. For oplysninger om optagelse af en RBC lysis skridt henvises til Trouplin mfl. 17.
    9. Filtrer suspension gennem en 70 µm sterile celle si i en ny konisk 50 mL-centrifugerør.
    10. Frø indsamlet celler jævnt i 145 mm celle kultur retter der indeholder 15-20 mL CMCM. Bruge ca tre kultur retter pr. mus ofret. Inkuber kulturer ved 37 ° C, 5% CO2.
    11. Efter 72 timer vaske pladerne engang med steril PBS til at fjerne ikke-tilhænger celler, derefter tilsættes 15-20mL frisk CMCM. Inkuber kulturer i yderligere 4 dage ved 37 ° C, 5% CO2. Efter 7 dage af samlede kultur bliver hæmatopoietisk knoglemarven cellerne oprindeligt isoleret modne BMDMs (figur 1).

2. generation af Fluorescently mærket hjerne-afledte Myelin vragrester

Bemærk: Alle reagenser kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.

  1. Forberedelse af myelin vragrester samling reagenser
    1. Udarbejde Tris· CL stødpudeopløsning.
      1. Til 800mL tilsættes destilleret deioniseret vand H2O (ddiH2O) 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7,45 (20 mM slutkoncentration) og 20 mL af 100 mM Na2EDTA (slutkoncentration 2 mM).
      2. Justere pH til 7,45. Justere lydstyrken til 1000 mL med ddiH2O. Filter løsning gennem en 0,2 µm filtrering enhed.
    2. Forberede 1 M rørsukkeropløsning.
      1. 100 ml Tris· CL buffer løsning, tilføje 68.46 g saccharose. Justere lydstyrken til 200 mL med Tris· CL stødpudeopløsning. Filtrer løsning gennem en 0,2 µm filtrering enhed.
    3. Forberede 200 mL 0.32 M rørsukkeropløsning ved at fortynde 1 M løsning med Tris· CL buffer løsning 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. Forberede 0,83 M rørsukkeropløsning. 150 mL ved at fortynde 1 M løsning med Tris· CL buffer løsning 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. Samling af hjerne-afledte rå myelin snavs
    Bemærk: Indsamlingsmetoden beskrevet her er til isolering af rå myelin debris.
    1. Aflive 10-12 mus 8-10 uger i aldersgrupper bruger standard CO2 kvælning retningslinjer efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Dissekere hjerner og placere dem i en 100 mm parabol indeholder 10 mL af 0.32 M rørsukkeropløsning.
Holde parabol på is.
  • Ved hjælp af steril kirurgiske saks klippe hjerner i stykker ca 5 mm3 i størrelse.
  • Overføre væv til en 50 mL konisk centrifugeglas og tilsæt ca. 30 mL 0.32 M rørsukkeropløsning.
  • Omrystes med en steril håndholdte roterende homogeniseringsapparat, indtil en glat løsning opnås.
  • Fortynd de homogeniseret hjerner til en endelige mængden af 90 mL med 0.32 M rørsukkeropløsning.
  • Seks 38,5-mL tyndvæggede polypropylen ultracentrifuge rør, der tilsættes 20 mL af 0,83 M rørsukkeropløsning.
  • Forsigtigt tilføje homogeniseret hjernen løsning til toppen af 0,83 M rørsukkeropløsning, pas på ikke for at blande de to lag.
  • Balance hver tube med 0.32 M rørsukkeropløsning.
  • Der centrifugeres ved 100.000 x g i 45 min. ved 4° C ved hjælp af en passende afkølet pre ultracentrifuge rotor. Sæt rotor acceleration og deceleration til deres mindste værdier at reducere myelin vragrester tab.
  • Indsamle myelin vragrester fra grænsefladen for de to saccharose tætheder.
    Bemærk: snavs skal vises som et hvidt bånd mod midten af røret.
  • Kombinere rå myelin vragrester i en 50 mL konisk centrifugeglas og justere lydstyrken til ca. 35 mL ved hjælp af Tris· CL stødpudeopløsning.
  • Homogeniseres rå myelin snavs med en steril håndholdte roterende homogeniseringsapparat til 30-60 s.
  • Jævnt opdele suspension mellem 6 ren ultracentrifuge rør og balance med et passende volumen af Tris· CL stødpudeopløsning.
  • Der centrifugeres ved 100.000 x g i 45 min. ved 4° C ved hjælp af en passende afkølet pre ultracentrifuge rotor. Sæt rotor acceleration og deceleration til deres maksimale værdier.
  • Som solid hvid pellets vil nu være synlig, supernatanten og genopslæmmes pellets i 10-15 mL af Tris· CL stødpudeopløsning.
  • Jævnt opdele suspension mellem 2 ren ultracentrifuge rør og balance med et passende volumen af Tris· CL stødpudeopløsning.
  • Der centrifugeres igen afkølet ved 100.000 x g i 45 min. ved 4 ° C ved hjælp af en passende pre ultracentrifuge rotor. Sæt rotor acceleration og deceleration til deres maksimale værdier.
  • Supernatanten og resuspend pellets i 5-6 mL steril PBS og opdele suspension mellem et passende antal pre vejede 1,5 mL micro-centrifugeglas.
  • Der centrifugeres ved 22.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
  • Supernatanten og vejning af myelin vragrester pellets.
  • Genopslæmmes pellets i PBS til en endelig koncentration på 100 mg/mL.
    Bemærk: ti til tolv hjerner er nok til at producere 10-15 mL 100 mg/mL myelin debris. Myelin vragrester kan være opbevares ved-80 ° C i 6 måneder.
  • Myelin vragrester fluorescerende mærkning
    1. Forberede 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) løsning umiddelbart før brug.
      1. Brug steril PBS, fortynde en 5 mM stamopløsning af CFSE tilberedt med 100% dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration 50 µM-arbejde.
      2. Filtrer løsning gennem en 0,2 µm sprøjte filter.
    2. Optø den ønskede mængde af 100 mg/mL myelin debris og genopslæmmes med en steril 29 g kanyle.
      Bemærk: frysning af myelin snavs vil få det til at droppe ud af løsning kræver resuspension før brug.
    3. Overføre myelin snavs til et præ vejede 1,5 mL micro-centrifugerør.
    4. Der centrifugeres ved 14,800 x g i 10 min. ved 4° C. Supernatanten.
    5. Resuspend myelin vragrester i 200 µL af CFSE opløsning pr. 100 µL myelin vragrester pelleted.
    6. Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur (RT) beskyttet mod lys.
    7. Der centrifugeres ved 14,800 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
    8. Resuspenderes i 600-800 µL af vaskebuffer (0,2 µm filter steriliseret 100 mM glycin i PBS).
    9. Der centrifugeres ved 14,800 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
    10. Gentag trin 2.3.8-2.3.9 to gange mere.
    11. Efter den sidste vask, vejning af myelin vragrester pellet og genopslæmmes til 100 mg/mL med steril PBS.
      Bemærk: Mærket myelin snavs kan opbevares ved-80 ° C i op til 6 måneder.

    • 3. myelin vragrester fagocytose Assay

    Bemærk: Nedenstående er den grundlæggende metode til observation fagocytose af fluorescently mærket myelin debris. Tilsætning af andre behandlinger og forsøgsbetingelser skal være optimeret investigator.

    1. Forberedelse af behandling plader
      1. For hver 145 mm plade, indsamle modne BMDMs i en 15 mL konisk centrifugeglas bruger 5-6 mL af 10 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (dPBS) (pH 7,4).
        Bemærk: Brug ikke trypsin, da det kan ændre aktiveringstilstanden celler18.
      2. Tilføje et lige saa stort volumen af pre varmede CMCM til hvert rør af indsamlede celler.
      3. Der centrifugeres ved 180 x g i 8 min ved 20 ° C. Supernatanten.
      4. Genopslæmmes celler i CMCM og count.
      5. Til hver brønd med en 24-godt celle kultur plade, skal du tilføje 1 x 105 celler i 1 mL CMCM.
      6. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer.
    2. Myelin vragrester behandling og analyse
      1. Tilsæt 10 µL af 100 mg/mL CFSE mærket myelin snavs til hver brønd (1 mg/mL endelige koncentration).
      2. Inkuber i 1-3 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
      3. Vask plade 3 gange med steril PBS til at fjerne ikke-opslugte myelin snavs.
      4. Tilsæt 400 µL af 4% PARAFORMALDEHYD til hver brønd. Inkuber i 30 min. ved RT.
      5. Vask plade 2 gange med steril PBS.
      6. Tilsæt 400 µL af Hoechst 33258 løsning til hver brønd. Inkuber i 5 min på RT beskyttet mod lys.
      7. Vaske tallerkener 2 gange med steril PBS.
      8. Tilføje 200 µL af Fluoro-gel med Tris buffer til hver brønd til at reducere photobleaching.
      9. Billede celler ved hjælp af en omvendt epi-fluorescerende habil mikroskop.
        Bemærk: CFSE excitations- og bølgelængder er 494 nm og 521 nm, henholdsvis.
      10. Dividere antallet af CFSE positive celler med antallet af kerner til at bestemme relative myelin vragrester optagelse.
      11. Før imaging, opretholde plader i op til 7 dage ved 4 ° C beskyttet mod lys.

    4. kvantificering af intracellulære lipider Via olie rød-O farvning

    Bemærk: Nedenstående er den grundlæggende metode til observation intracellulære myelin-vragrester-afledte lipider.Brugen af CFSE mærket myelin vragrester er ikke anbefalet til fluorescerende kvantificering af ORO farvning på grund af spektrale overlapning. Tilsætning af andre behandlinger og forsøgsbetingelser skal være optimeret investigator.

    1. Forberedelse af farvning løsninger
      1. Forberede 0,5% olie rød-O (ORO) Farvningsopløsningen.
        1. Langsomt tilsættes 100 mL 100% propylenglycol (1,2-propandiol) til 0,5 g af ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) under omrøring.
        2. Varme løsning på 95 ° C i 15 min, eller indtil alle store partikler er opløst.
          Bemærk: ikke opvarmes over 100 ° C.
        3. Filtrer løsning gennem et stykke filtrerpapir mens stadig varm i en ny beholder.
        4. Tillade løsning til cool overnatning på RT. løsning kan opbevares i op til 1 år på RT.
      2. Forberede 85% propylenglycol løsning.
        1. 85 mL 100% propylenglycol tilsættes 15 ml ddiH2O. rør indtil blandet. Opløsning kan opbevares i op til 1 år på RT.
    2. Forberedelse af behandling plader
      1. Forberede en 24-godt plade efter den metode, som beskrevet i afsnit 3.
      2. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer.
    3. Myelin vragrester behandling
      1. Tilsæt 10 µL af 100 mg/mL myelin snavs til hver brønd (1 mg/mL endelige koncentration).
      2. Inkuber i 1-3 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
      3. Vask plade 3 gange med steril PBS til at fjerne ikke-fordøjet myelin snavs.
        Bemærk: På dette punkt, plader kan enten undergår øjeblikkelig fiksation eller friske CMCM kan tilføjes, og cellerne tilbage til inkubation i ekstra tid point.
      4. Tilsæt 400 µL af 4% PARAFORMALDEHYD til hver brønd. Inkuber i 30 min. ved RT.
      5. Vask plade 2 gange med steril PBS så procced til farvning.
    4. ORO farvning og analyse
      1. Vaske fast plade 3 gange med ddiH2O.
      2. Tilsæt 400 µL af 100% propylenglycol til hver brønd og Inkuber i 5 min på RT.
        Bemærk: Dette vil reducere fremførsel af ddiH2O.
      3. Opsug propylenglycol og tilføje 400 µL af ORO løsning til hver brønd.
      4. Inkuber i 8 min. ved 60 ° C.
      5. Opsug ORO løsning. Derefter tilsættes 400 µL af 85% propylenglycol til hver brønd og Inkuber i 5 minumintes på RT.
      6. Vask plade 3 gange med ddiH2O.
      7. Tilsæt 400 µL af Hoechst 33258 løsning til hver brønd. Inkuber i 5 min på RT, beskyttet mod lys.
      8. Vaske tallerkener 2 gange med steril PBS.
      9. Tilføje 200 µL af Fluoro-gel med Tris buffer til hver brønd.
      10. Billede celler ved hjælp af en omvendt epi-fluorescerende habil mikroskop. ORO kan være afbildet ved hjælp af en standard Texas rød eller DsRed filtersæt.
      11. Kvantificere relative lipid opbevaring ved at fastlægge området ORO positive i hver billedfelt og dividere den med antallet af kerner.
      12. Vedligeholde plader i 7 dage ved 4 ° C beskyttet mod lys.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Behandling af BMDMs med CFSE mærket myelin vragrester bør give klare internalisering (figur 2). Mens en 3-timers interaktion tid er tilstrækkeligt for BMDMs til at phagocytosis nok tilføjet myelin vragrester for robust downstream påvisning, kan intracellulære ophobning observeres med så lidt som 1 time af interaktion. Dog kan nogle myelin vragrester stadig være til stede på cellens overflade efter vask. Dette kan skyldes utilstrækkelig vask eller partikler ikke at være fuldt internaliseret i de tidlige stadier af fagocytose.

    Mens BMDMs kan hurtigt internalisere myelin vragrester, er lysosomale behandling nødvendig før ORO SushiStainable lipid dråber form. For at demonstrere, var BMDMs inkuberes med myelin vragrester i 90 minutter, vasket og kulturperler for yderligere mængder af tid før fiksering og farvning (figur 3). Figur 4 viser, er der en forsinkelse mellem behandlingen indledning og neutral lipid udseende. Det bør også bemærkes, at lipid opbevaring ikke er stabil under kultur. BMDMs vil begynde at nedbryde akkumulerede lipider snart efter droplet dannelse. Som sådan, anbefaler vi venter længere end 24 timer mellem vask væk ikke opslugt myelin debris og fiksering.

    Kvantificering af ORO farves område viser antallet af myelin lipid metabolisme i BMDMs (figur 5). Efter en periode på 90 minutters interaktion celler blev returneret til inkubation i friske CMCM. I den tidlige chase periode i frisk medium metabolisere BMDMs phagocytosed myelin vragrester lipid komponent i neutral ORO SushiStainable lipider. En støt stigning i ORO positive område er typisk i timerne efter samspillet. Efter 24 timer men BMDMs vil have effluxed eller metaboliseres en betydelig del af de intracellulære lipider.

    Figure 1
    Figur 1 : Repræsentant BMDM kulturer. Få vedhængende celler vil observeres i første omgang. På dag 3, er enhver ikke-tilhænger celler fjernet. Dag 7 overholdes modne knoglemarv-afledte makrofager. Skala = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 : Repræsentant billeder af BMDM Myelin vragrester fagocytose Assay. Celler blev behandlet med 1mg/mL CFSE mærket myelin vragrester i 1 time før vask og fiksation med 4% PFA. Internaliseret myelin snavs kan visualiseres ved hjælp af standard normal god landbrugspraksis filter sæt på en epi-fluorescerende habil mikroskop. Skala = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 : Diagram over olie røde O (ORO) eksperimentelle Design. BMDM behandles med 1mg/mL myelin vragrester (1: 100 fortynding) i 90 minutter, efterfulgt af vask og kultur i frisk medium før fiksering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4 : ORO farvning af BMDM efter Myelin vragrester fagocytose. Følgende fiksering med 4% PFA på de angivne tidspunkter, BMDMs var plettet med ORO og Hoechst 33258. Repræsentative billeder til hvert tidspunkt er vist. Skala = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5 : Kvantitative billedanalyse af ORO farvning. Til kvantificering af ORO farvning, blev 3 wells afbildet på 20 X med 5 billeder pr. brønd. Alle billedindstillinger erhvervelse var identiske. Fejllinjer = SEM. (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De procedurer, der beskrives her udnytter både frisk isolerede rå CNS myelin debris og primære knoglemarv-afledte makrofager. For at reducere dyrs udgifter, anbefaler vi, at både hjerne og knoglemarv celler høstes fra hver musen på tidspunktet for offer. To forskere, der arbejder sammen kan udarbejde begge materialer samtidig. Alternativt, hjerner kan opbevares ved-80 ° C i PBS suppleret med antibiotika før myelin vragrester isolation. Det har været vores erfaring, at hjerne kan opretholdes i disse betingelser for op til 1 måned uden nævneværdig tab af myelin vragrester generation potentiale.

    CFSE bruges til at mærke myelin snavs på grund af sin brugervenlighed og fluorescerende intensitet. Farvestoffet forbliver quenched indtil cellulære esteraser kløver gruppen acetat på molekyle14. Frigivne succinimidyl ester gruppe kan derefter reagere med primære amider, resulterer i kovalente tilknytning til cellulære proteiner14. Mens CFSE er overgearet ved hjælp af standard grøn fluorescerende kanaler, er der flere derivater kommercielt tilgængelige med forskellige spektrale egenskaber. Det er således muligt at designe en lignende fagocytose analyse ved hjælp af flere fluorescerende farvestoffer. Det skal også bemærkes, at fordi farvestoffet krydser let plasma membraner, det kan bruges til at afmærke apoptotiske celler på en lignende måde som myelin vragrester19. Desuden, mens vores metode er afhængig af standard billedanalyse, med brugeren optimering, kvantificering kan udføres ved hjælp af flowcytometri eller en høj overførselshastighed plade imaging system.

    Olie røde O (også kendt som Solvent Red 27 eller Sudan Red 5B) er en fedtopløselige farvestof, som har været udbredt at plette neutral lipider i histologiske prøver. Sin dybe røde pigmentering giver mulighed for visualisering af intracellulære lipider via både lysfelt og fluorescerende mikroskopi5,20. Brug af fluorescerende mikroskopi giver mulighed for enkelt kanal billedbehandling og robust kvantificering af ORO farves lipid dråber. Mens metoden farvning er enkel og meget reproducerbar, skal pleje tages under forberedelse af prøver. Det er afgørende, at Alkohol eller syre-baserede fikseringsmidler ikke bruges, som de kan opløse intracellulære lipider, fører til en betydelig reduktion i farvning intensitet. Desuden, som med enhver kvantitativ billedanalyse, kan ikke betydningen af standardiserede image capture indstillinger og tilstrækkelig fordomsfri prøveudtagning undervurderes. Brugen af farvning kontrol anbefales at tage højde for enhver prøve auto-fluorescens. Kontrollen Farvningsopløsningen bør behandles ens, men venstre unstained med ORO at måle niveauet af baggrunden auto-fluorescens. Selv så, kræver vores billede analysemetode mindre optimering end andre lipid kvantificering teknikker, såsom de ORO ekstraktion metode21, som kræver standardkurven forberedelse, er mere udsat for eksperimentel variation, og nødvendiggør ødelæggelse af prøven. Brug af billede baseret analyse har flere fordele frem for traditionelle ORO udvindingsmetoder i at det ikke-destruktiv og er kompatibel med immunfarvning21,22 .

    Endelig, mens de beskrevne procedurer er relativt ligetil, er det kritisk, at korrekt aseptisk teknik anvendes, da makrofager express flere receptorer, som genkender patogen associeret molekylære mønstre (PAMPS) som endotoxin LPS (LPS)23. Interaktion med bakteriel forurener vil resultere i makrofag aktivering og kan dramatisk ændre deres funktion24,25. Med hensyn til de indsamlede myelin vragrester anbefales testning for smitte. Endotoxin påvisningsmetoder såsom limulus amebocyte lysate (LAL) Analysen har høj følsomhed, og tidligere har været anvendt til denne ansøgning5,19.

    Makrofager spiller en vigtig rolle i både sundhed og sygdom, men BMDMs rolle i forbindelse med CNS skade er i øjeblikket et vigtigt emne for undersøgelse. Ved hjælp af de metoder, der beskrives her, kan forskere begynde at forstå mekanismen af myelin vragrester fagocytose af BMDMs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingen oplysninger.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne takke Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist ved FSU College of Medicine for alle hans arbejde i video-produktion, redigering og voice-over.

    Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01GM100474 og R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Neurovidenskab spørgsmålet 130 knoglemarv-afledte makrofag fagocytose myelin snavs olie røde O carboxyfluorescein succinimidyl ester rygmarvsskader neurotrauma
    <em>In Vitro</em> Fagocytose af Myelin resterne af knoglemarv-afledte makrofager
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter