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Neuroscience

इन विट्रो अस्थि मज्जा द्वारा Myelin मलबे के Phagocytosis-व्युत्पंन मैक्रोफेज

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

हम वर्तमान विधियों प्राथमिक murine अस्थि मज्जा की phagocytic क्षमता का आकलन करने के लिए-फ्लोरोसेंट लेबल myelin मलबे और intracellular लिपिड छोटी बूंदों धुंधला का उपयोग मैक्रोफेज व्युत्पंन ।

Abstract

अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) परिपक्व ल्यूकोसाइट्स कि पेशेवर फ़ैगोसाइट कणों की एक किस्म समाशोधन में सक्षम के रूप में एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका की सेवा कर रहे हैं । आम तौर पर, BMDMs केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से प्रतिबंधित कर रहे हैं, लेकिन एक चोट के बाद, वे आसानी से घुसपैठ कर सकते हैं । एक बार घायल सीएनएस ऊतक के भीतर, BMDMs प्राथमिक कोशिका प्रकार चोट के क्लीयरेंस के लिए जिंमेदार है-सेलुलर मलबे व्युत्पंन, लिपिड अमीर myelin मलबे की बड़ी मात्रा सहित । BMDM घुसपैठ और myelin मलबे के neuropathological असर सीएनएस के भीतर phagocytosis जटिल है और अच्छी तरह से समझ में नहीं आता । प्रोटोकॉल यहां वर्णित, सीएनएस चोट के संदर्भ में BMDMs के प्रत्यक्ष इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । हम कवर murine BMDM अलगाव और संस्कृति, myelin मलबे की तैयारी, और परख BMDM myelin मलबे phagocytosis का आकलन करने के लिए । इन तकनीकों महत्वपूर्ण विशेष उपकरण या सामग्री के लिए की आवश्यकता के बिना मजबूत quantifiable परिणाम का उत्पादन, अभी तक आसानी से शोधकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी कर रहे हैं । antigen प्रस्तुत कक्षों (APCs) के रूप में, वे लिम्फोसाइटों के साथ दोनों antigen प्रस्तुति और cytokine रिलीज़1,2,3के माध्यम से संवाद कर सकते हैं । हालांकि, पेशेवर फ़ैगोसाइट के रूप में, उनके प्राथमिक समारोह रोगजनकों, वृद्ध कोशिकाओं, और सेलुलर मलबे1,4स्पष्ट करने के लिए है । एक रीढ़ की हड्डी की चोट (विज्ञान) के बाद, myelin मलबे की पर्याप्त मात्रा मरने oligodendrocytes से उत्पंन होता है, सेल प्रकार axon सीएनएस के लिए जिंमेदार5myelination । हम और दूसरों को पता चला है कि myelin मलबे की मंजूरी मुख्य रूप से BMDMs5,6,7घुसपैठ की जिंमेदारी है । हालांकि, रीढ़ की हड्डी में चोट साइटों myelin मलबे की समाई के भीतर एक समर्थक भड़काऊ राज्य5,8,9की ओर इन सामांय विरोधी भड़काऊ कोशिकाओं को शिफ्ट करने का सुझाव दिया गया है । घायल रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका-सूजन के प्रमुख मध्यस्थों के रूप में, BMDMs महत्वपूर्ण नैदानिक लक्ष्य हैं ।

घायल रीढ़ की हड्डी में BMDMs के प्रभाव की जांच करने में मदद करने के लिए, हम एक इन विट्रो मॉडल सीधे अध्ययन कैसे BMDMs myelin मलबे का जवाब करने के लिए विकसित किया है । जैविक प्रासंगिकता में सुधार करने के लिए, दोनों प्राथमिक murine BMDMs और हौसले से पृथक myelin मलबे इन जांचों में उपयोग किया जाता है । इस तरह के रूप में, यहां प्रस्तुत तरीके भी विस्तार अलगाव और प्राथमिक murine BMDMs की संस्कृति, और एक संशोधित सुक्रोज ढाल को murine myelin मलबे व्युत्पंन10,11,12को अलग इस्तेमाल किया तकनीक । Myelin मलबे आसानी से एक फ्लोरोसेंट डाई, carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ लेबल किया जा सकता है, internalization द्वारा अपने BMDMs को ट्रैक करने के लिए CFSE । यह गैर साइटोटोक्सिक है, और इसके संकीर्ण फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम परमिट है क्योंकि इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है अन्य फ्लोरोसेंट जांच के साथ division13,14. निम्नलिखित phagocytosis, myelin मलबे लिपिड lysosomes के माध्यम से ले जाया जाता है और intracellular लिपिड बूंदों में तटस्थ लिपिड के रूप में पैक5। इस intracellular लिपिड संचय यों तो, हम एक तेल लाल ओ (ओरो) दाग मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए अनुकूलित विधि प्रस्तुत करते हैं । यह सरल धुंधला विधि मजबूत प्रतिलिपि परिणाम और ठहराव15पैदा करता है । इन तरीकों myelin मलबे phagocytosis और लिपिड प्रतिधारण सीमित विशेष उपकरणों के साथ के अध्ययन की सुविधा ।

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Protocol

तरीकों यहां वर्णित है और खंड 2 में फ्लोरिडा राज्य विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं, 8वें संस्करण के उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित दिशा निर्देशों का पालन . इस प्रोटोकॉल में इस में प्रयुक्त सभी जानवरों का उपयोग करने तक एक समर्पित प्रयोगशाला पशु सुविधा में घर कर रहे हैं । vivo में कोई प्रयोग बलिदान करने से पहले किया गया था । पशु संख्या प्रायोगिक पर आधारित थे औसत सेल और एक गाइड के रूप में myelin संग्रह का उपयोग करने के लिए उपयोग को कम करने की जरूरत है ।

नोट: इस प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) की पीढ़ी का वर्णन (खंड 1), फ्लोरोसेंट मस्तिष्क लेबल की तैयारी myelin मलबे (खंड 2) व्युत्पंन, myelin मलबे phagocytosis विश्लेषण के लिए सामांय प्रक्रिया (धारा 3), और myelin मलबे लिपिड संचय (धारा 4) के विश्लेषण के लिए सामान्य प्रक्रिया. रिएजेंट तैयारी, सेल संचयन और हेरफेर, myelin संग्रह और लेबलिंग, और परख प्रदर्शन एक लामिना airflow में पूरा किया जाना चाहिए ।

1. प्राथमिक अस्थि मज्जा की पीढ़ी-व्युत्पंन मैक्रोफेज

  1. पूर्ण macrophage कल्चरल मीडियम (CMCM) की तैयारी
    नोट:     अस्थि मज्जा से Macrophage पीढ़ी Macrophage कॉलोनी के उपयोग की आवश्यकता है-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ). यह तैयारी एम सीएसएफ के स्रोत के रूप में L929 murine fibroblast वातानुकूलित मीडिया का इस्तेमाल करता है ।
    1. १४५ मिमी व्यंजन में संवर्धन कोशिकाओं द्वारा L929 murine fibroblast कंडीशन्ड मीडिया उत्पन्न उच्च ग्लूकोज की ५० मिलीलीटर के साथ (४५०० mg/l l-ग्लूकोज) Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 5% नई जंमे बछड़ा सीरम (एनसीएस) के साथ पूरक और 7 दिनों के लिए पेनिसिलिन/Streptomycin.
    2. ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों में संस्कृतियों से मीडिया लीजिए और ३५०० x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    3. एक नया ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से supernatants फिल्टर । वातानुकूलित मीडिया-८० ° c 6 महीनों के लिए पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. उच्च ग्लूकोज DMEM के लिए, जोड़ें 5% vol/एनसीएस, 15% vol/L929 murine fibroblast वातानुकूलित DMEM, और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin । मीडिया 2-3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । उपयोग करने से पहले ३७ ° c करने के लिए गर्म ।
  2. प्राथमिक अस्थि मज्जा कोशिकाओं और macrophage प्रेरण का संग्रह
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक माउस का प्रयोग लगभग २०,०००,००० अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) उत्पंन होगा ।
    1. Euthanize की वांछित संख्या 8-10 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग कर मानक सह2 asphyxiation दिशा-निर्देशों के बाद गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन ।
    2. ७०% (vol/इथेनॉल: H2O का उपयोग कर पशु साफ, फर संतृप्त ।
    3. पेट में एक छोटे से खोलने में कटौती और ध्यान से अंतर्निहित ऊतक प्रकट करने के लिए वापस त्वचा खींच । पेरिटोनियल गुहा पंचर नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
    4. दोनों हिंद कूल्हे पर शुरू करने और टखने में समाप्त पैर निकालें । एक १०० मिमी पेट्री डिश में एकत्र ऊतक प्लेस 5-10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट (पंजाब) के साथ पूरक 1% पेनिसिलिन/Streptomycin.
      नोट: जब प्रसंस्करण कई जानवरों बर्फ पर बर्तन रखने के लिए ऊतक क्षरण को सीमित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    5. एक स्केलपेल का उपयोग हड्डी से मांसपेशी और संयोजी ऊतक निकालें । केवल फीमर और टिबिया सेल संग्रह के लिए उपयोग किया जाता है, fibula छोड़ दिया जा सकता है ।
    6. एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक छोर से एक छोटे से अनुभाग trimming द्वारा एकत्र हड्डियों की मज्जा गुहा बेनकाब ।
    7. एक 25g सुई का प्रयोग, एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में CMCM के साथ मज्जा गुहाओं फ्लश । हड्डियों सफेद दिखाई देगा एक बार वे पर्याप्त फ्लश किया गया है ।
    8. एक बार संग्रह पूरा हो गया है, 30-90 एस के लिए एक 18g सुई के साथ आंदोलन tracheal एक एकल सेल निलंबन उत्पंन करने के लिए ।
      नोट: एक वैकल्पिक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis कदम इस बिंदु पर किया जा सकता है । यह हाल ही में सुझाव दिया गया है कि intracellular लौह सामग्री macrophage ध्रुवीकरण पर myelin मलबे के प्रभाव को प्रभावित कर सकते है16। एक आरबीसी lysis चरण के शामिल किए जाने के बारे में जानकारी के लिए Trouplin एट अलदेखें । 17.
    9. एक नया ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में एक ७० µm बाँझ सेल छलनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर ।
    10. बीज में समान रूप से १४५ mm सेल संस्कृति व्यंजन 15-20 मिलीलीटर CMCM युक्त कोशिकाओं को एकत्र किया । उपयोग लगभग तीन माउस प्रति संस्कृति व्यंजन बलि । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर संस्कृतियों की मशीन ।
    11. ७२ घंटे के बाद एक बार प्लेटें धो बाँझ पंजाबियों के साथ गैर अनुयाई कोशिकाओं को हटाने के लिए, तो 15-मिलीलीटर ताजा CMCM जोड़ें । ३७ ° c, 5% CO2पर एक अतिरिक्त 4 दिनों के लिए संस्कृतियों की मशीन । कुल संस्कृति के 7 दिनों के बाद, टेम अस्थि मज्जा कोशिकाओं शुरू में पृथक परिपक्व BMDMs (चित्रा 1) हो जाएगा ।

2. फ्लोरोसेंट लेबल मस्तिष्क की पीढ़ी-व्युत्पंन Myelin मलबे

नोट: सभी रिएजेंट 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

  1. myelin मलबा कलेक्शन रिएजेंट की तैयारी
    1. तैयार Tris · सीएल बफ़र समाधान ।
      1. को 800mL आसुत क H2हे (ddiH2o) जोड़ने के 20 मिलि 1 M Tris · सीएल, पीएच ७.४५ (20 मिमी अंतिम एकाग्रता) और १०० मिमी ना2EDTA (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) की 20 मिलीलीटर ।
      2. ७.४५ के लिए पीएच समायोजित करें । एक ०.२ µm निस्पंदन इकाई के माध्यम से ddiH2O. फ़िल्टर समाधान के साथ १००० मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम समायोजित करें ।
    2. 1 M सुक्रोज हल तैयार करें ।
      1. को १०० मिलीलीटर की Tris · सीएल बफर समाधान, सुक्रोज के ६८.४६ ग्राम जोड़ें । Tris के साथ २०० मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें · सीएल बफ़र समाधान । एक ०.२ µm निस्पंदन इकाई के माध्यम से फ़िल्टर समाधान ।
    3. Tris के साथ 1 m समाधान कमजोर द्वारा ०.३२ एम सुक्रोज सॉल्यूशन की २०० एमएल तैयार · सीएल बफर समाधान 0.83:0.16 (vol/
    4. Tris के साथ 1 m समाधान कमजोर द्वारा ०.८३ एम सुक्रोज सॉल्यूशन की १५० एमएल तैयार · सीएल बफर समाधान 0.83:0.16 (vol/
  2. ब्रेन के कलेक्शन से निकाला क्रूड myelin मलबा
    नोट: यहां वर्णित संग्रह विधि क्रूड myelin मलबे के अलगाव के लिए है ।
    1. Euthanize 10-12 चूहों 8-10 सप्ताह की आयु के मानक CO2 asphyxiation गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के बाद दिशा निर्देशों का उपयोग कर ।
    2. दिमाग को टुकड़े और उन्हें १०० एमएम डिश में जगह देते हैं जिसमें से 10 एमएल का ०.३२ मीटर सुक्रोज सॉल्यूशन होता है ।
डिश को बर्फ पर रखें ।
  • बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग टुकड़ों में दिमाग कट लगभग 5 मिमी आकार में3 .
  • एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए ऊतक स्थानांतरण और ०.३२ मीटर सुक्रोज समाधान के लगभग 30 मिलीलीटर जोड़ें ।
  • Homogenize एक बाँझ हाथ से आयोजित रोटरी homogenizer, जब तक एक चिकनी समाधान हासिल की है ।
  • ०.३२ मीटर सुक्रोज समाधान के साथ ९० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए homogenized दिमाग पतला ।
  • छह ३८.५ मिलीलीटर पतली दीवारों के ultracentrifuge ट्यूबों के लिए, ०.८३ मीटर सुक्रोज समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
  • धीरे ०.८३ मीटर सुक्रोज समाधान के शीर्ष करने के लिए homogenized मस्तिष्क समाधान जोड़ने के लिए, दो परतों मिश्रण करने के लिए ध्यान नहीं ले ।
  • ०.३२ मीटर सुक्रोज समाधान के साथ प्रत्येक ट्यूब संतुलन ।
  • एक उपयुक्त पूर्व ठंडा ultracentrifuge रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए १००,००० x g पर केंद्रापसारक । myelin मलबे हानि को कम करने के लिए उनके ंयूनतम मूल्यों के लिए रोटर त्वरण और मंदी सेट करें ।
  • दो सुक्रोज घनत्व के इंटरफेस से myelin मलबे लीजिए ।
    नोट: मलबे ट्यूब के केंद्र की ओर एक सफेद बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए ।
  • एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में कच्चे myelin मलबे का मिश्रण है और Tris का उपयोग कर लगभग ३५ मिलीलीटर करने के लिए मात्रा समायोजित करें · सीएल बफ़र समाधान ।
  • Homogenize ने कच्चे myelin मलबे को बाँझ हाथ से थामा रोटरी homogenizer फॉर 30-60 एस.
  • समान रूप से 6 साफ ultracentrifuge ट्यूबों और Tris के एक उचित मात्रा के साथ संतुलन के बीच निलंबन विभाजन · सीएल बफ़र समाधान ।
  • एक उपयुक्त पूर्व ठंडा ultracentrifuge रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए १००,००० x g पर केंद्रापसारक । रोटर त्वरण और मंदी उनके अधिकतम मूल्यों के लिए सेट करें ।
  • ठोस सफेद छर्रों अब दिखाई देगा के रूप में, supernatant को त्यागें और Tris के 10-15 मिलीलीटर में छर्रों फिर से निलंबित · सीएल बफ़र समाधान ।
  • समान रूप से 2 साफ ultracentrifuge ट्यूबों और Tris के एक उचित मात्रा के साथ संतुलन के बीच निलंबन विभाजन · सीएल बफ़र समाधान ।
  • एक उपयुक्त पूर्व ठंडा ultracentrifuge रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए १००,००० x g पर फिर से केंद्रापसारक । रोटर त्वरण और मंदी उनके अधिकतम मूल्यों के लिए सेट करें ।
  • supernatant त्यागें और बाँझ पंजाबियों के 5-6 मिलीलीटर में छर्रों reसस्पेंड और पूर्व तौला १.५ एमएल माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों की एक उचित संख्या के बीच निलंबन विभाजित ।
  • 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  • supernatant त्यागें और myelin मलबे छर्रों का वजन निर्धारित करते हैं ।
  • फिर से पंजाब में छर्रों निलंबित १०० मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए ।
    नोट: दस से बारह दिमाग १०० मिलीग्राम/एमएल myelin मलबे की 10-15 मिलीलीटर का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है । Myelin मलबे 6 महीने के लिए-८० ° c में स्टोर किया जा सकता है ।
  • Myelin मलबे फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    1. ५० µ m carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) समाधान तुरंत उपयोग करने से पहले तैयार करें ।
      1. बाँझ पंजाबियों का उपयोग करना, CFSE के एक 5 मिमी शेयर समाधान को पतला १००% dimethyl sulfoxide के साथ तैयार (DMSO) ५० µ एम के एक अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए.
      2. एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर ।
    2. १०० मिलीग्राम/एमएल myelin मलबे की वांछित राशि गल और एक बाँझ 29g सुई के साथ पुनः निलंबित ।
      नोट: ठंड myelin मलबे का उपयोग करने से पहले resuspension की आवश्यकता समाधान के बाहर ड्रॉप करने के लिए कारण होगा ।
    3. एक पूर्व तौला १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए myelin मलबे हस्तांतरण ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १४,८०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    5. २०० µ l में myelin मलबे को पुनर्स्थगित CFSE समाधान प्रति १०० µ एल myelin मलबे गोली ।
    6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन (आरटी) प्रकाश से सुरक्षित ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १४,८०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    8. 600-800 धोने बफर के µ एल में गोली reसस्पेंड (०.२ µm फ़िल्टर पंजाब में १०० mM glycine निष्फल) ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १४,८०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    10. दोहराएं चरण 2.3.8-2.3.9 दो बार अधिक ।
    11. अंतिम धोने के बाद, myelin मलबे गोली का वजन निर्धारित करने और फिर से निलंबित १०० मिलीग्राम/एमएल बाँझ पंजाबियों के साथ ।
      नोट: लेबल myelin मलबे पर स्टोर किया जा सकता है-८० ° c 6 महीनों के लिए ।

    • 3. Myelin मलबा Phagocytosis परख

    नोट: निंनलिखित फ्लोरोसेंट myelin मलबे लेबल के phagocytosis देख के लिए बुनियादी तरीका है । अंय उपचार और प्रयोगात्मक शर्तों के अलावा अंवेषक द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ।

    1. ट्रीटमेंट प्लेटों की तैयारी
      1. प्रत्येक १४५ mm प्लेट के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में 10 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (dPBS) (पीएच ७.४) के 5-6 मिलीलीटर का उपयोग कर में परिपक्व BMDMs इकट्ठा ।
        नोट: trypsin का उपयोग न करें क्योंकि यह कक्ष18की सक्रियण स्थिति को बदल सकता है ।
      2. एकत्र कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब के लिए पूर्व गर्म CMCM के एक बराबर मात्रा में जोड़ें ।
      3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए १८० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
      4. CMCM और गणना में पुन: निलंबित कक्ष ।
      5. एक 24-well सेल कल्चर प्लेट की एक अच्छी तरह से करने के लिए, CMCM के 1 मिलीलीटर में 1x105 कोशिकाओं को जोड़ें ।
      6. ३७ ° c, 5% सह2 पर मशीन 24 एच के लिए ।
    2. Myelin मलबे उपचार और विश्लेषण
      1. १०० मिलीग्राम/एमएल CFSE के 10 µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से myelin मलबे लेबल (1 mg/
      2. ३७ ° c, 5% CO2पर 1-3 घंटे के लिए मशीन ।
      3. गैर-घिरा myelin मलबे को हटाने के लिए बाँझ पंजाबियों के साथ 3 बार थाली धो.
      4. प्रत्येक कुआं को 4% paraformaldehyde के ४०० µ l को जोड़ें । आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
      5. धो थाली बाँझ पंजाबियों के साथ 2 बार ।
      6. जोड़ें ४०० µ एल के Hoechst ३३२५८ समाधान के लिए एक अच्छी तरह से । आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन प्रकाश से संरक्षित ।
      7. धो प्लेटें बाँझ पंजाबियों के साथ 2 बार ।
      8. photobleaching कम करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से Tris बफर के साथ Fluoro-जेल के २०० µ एल जोड़ें ।
      9. छवि एक औंधा महामारी-फ्लोरोसेंट सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं ।
        नोट: CFSE के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः ४९४ एनएम और ५२१ एनएम हैं ।
      10. नाभिक की संख्या से CFSE सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में विभाजित करने के लिए रिश्तेदार myelin मलबे का निर्धारण ।
      11. इमेजिंग करने से पहले, प्रकाश से सुरक्षित 4 ° c पर 7 दिनों तक के लिए प्लेट बनाए रखें ।

    ४. ठहराव च्या Intracellular रक्तदाब वाया तेल लाल-हे दाग

    नोट: निंनलिखित intracellular myelin-मलबे-व्युत्पंन लिपिड देख के लिए बुनियादी तरीका है ।CFSE का उपयोग myelin मलबे लेबल ओरो के फ्लोरोसेंट ठहराव के लिए अनुशंसित नहीं वर्णक्रमीय ओवरलैप के कारण धुंधला । अंय उपचार और प्रयोगात्मक शर्तों के अलावा अंवेषक द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ।

    1. दाग समाधान की तैयारी
      1. तैयार ०.५% तेल लाल-ओ (ओरो) धुंधला समाधान ।
        1. धीरे से १००% propylene ग्लाइकोल (1, 2-Propanediol) के १०० मिलीलीटर जोड़ने के लिए ओरो के ०.५ जी (1-([4-(Xylylazo) xylyl] डाइज) -2-naphthol) जबकि सरगर्मी ।
        2. 15 मिनट के लिए ९५ ° c पर गर्मी समाधान या जब तक सभी बड़े कणों को भंग कर रहे हैं ।
          नोट: १०० डिग्री सेल्सियस से अधिक गर्मी नहीं है ।
        3. फिल्टर कागज के एक टुकड़े के माध्यम से समाधान फ़िल्टर जबकि अभी भी एक नए कंटेनर में गर्म ।
        4. आर टी पर रात भर शांत समाधान की अनुमति के लिए आरटी पर 1 वर्ष के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
      2. तैयार ८५% propylene ग्लाइकोल हल ।
        1. जोड़ें ८५ एमएल के १००% propylene ग्लाइकोल को 15 मिलीलीटर की ddiH2ओ. मिश्रित जब तक हिलाओ । समाधान आरटी पर 1 वर्ष के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
    2. ट्रीटमेंट प्लेटों की तैयारी
      1. अनुभाग 3 में उल्लिखित विधि के बाद एक 24-well प्लेट तैयार करें ।
      2. ३७ ° c, 5% सह2 पर मशीन 24 एच के लिए ।
    3. Myelin मलबा ट्रीटमेंट
      1. एक अच्छी तरह से १०० मिलीग्राम/एमएल myelin मलबे के 10 µ एल जोड़ें (1 mg/
      2. ३७ ° c, 5% CO2पर 1-3 h के लिए मशीन ।
      3. गैर पचा myelin मलबे को हटाने के लिए बाँझ पंजाबियों के साथ 3 बार थाली धो.
        नोट: इस बिंदु पर, प्लेटें या तो तत्काल निर्धारण से गुजरना कर सकते है या ताजा CMCM जोड़ा जा सकता है, और कोशिकाओं अतिरिक्त समय अंक के लिए मशीन को लौट आए ।
      4. प्रत्येक कुआं को 4% paraformaldehyde के ४०० µ l को जोड़ें । आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
      5. धो थाली बाँझ पंजाबियों के साथ 2 बार तो धुंधला करने के लिए procced ।
    4. ओरो धुंधला और विश्लेषण
      1. ddiH2O के साथ 3 बार फिक्स्ड प्लेट धो लें ।
      2. १००% propylene ग्लाइकोल के ४०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से और आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
        नोट: इससे ddiH2ओ की स् कम हो जाएगी ।
      3. महाप्राण propylene ग्लाइकोल और एक अच्छी तरह से ओरो समाधान के ४०० µ एल जोड़ें ।
      4. ६० डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए मशीन ।
      5. ओरो समाधान महाप्राण । फिर, एक अच्छी तरह से ८५% propylene ग्लाइकोल के ४०० µ एल जोड़ें और आरटी पर 5 minumintes के लिए मशीन ।
      6. ddiH2O के साथ 3 बार प्लेट धो लें ।
      7. जोड़ें ४०० µ एल के Hoechst ३३२५८ समाधान के लिए एक अच्छी तरह से । आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन, प्रकाश से रक्षा की ।
      8. धो प्लेटें बाँझ पंजाबियों के साथ 2 बार ।
      9. एक अच्छी तरह से Tris बफर के साथ Fluoro-जेल के २०० µ एल जोड़ें ।
      10. छवि एक औंधा महामारी-फ्लोरोसेंट सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं । ओरो एक मानक टेक्सास लाल या DsRed फिल्टर सेट का उपयोग कर imaged किया जा सकता है ।
      11. प्रत्येक छवि क्षेत्र में ओरो सकारात्मक क्षेत्र का निर्धारण और नाभिक की संख्या से यह विभाजन के सापेक्ष लिपिड प्रतिधारण बढ़ाता है ।
      12. प्रकाश से संरक्षित 4 ° c पर 7 दिनों के लिए प्लेट बनाए रखें ।

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    Representative Results

    CFSE लेबल myelin मलबे के साथ BMDMs के उपचार स्पष्ट internalization (चित्रा 2) उपज चाहिए । जबकि एक 3 घंटे के संपर्क समय BMDMs के लिए पर्याप्त है phagocytose मजबूत बहाव का पता लगाने के लिए myelin मलबे जोड़ा, intracellular संचय के रूप में छोटे रूप में बातचीत के 1 घंटे के साथ मनाया जा सकता है । हालांकि, कुछ myelin मलबे अभी भी धोने के बाद सेल सतह पर मौजूद हो सकता है । यह अपर्याप्त धोने के कारण हो सकता है, या phagocytosis के प्रारंभिक दौर के दौरान पूरी तरह से आंतरिक नहीं किया जा रहा कणों ।

    जबकि BMDMs तेजी से myelin मलबे internalize कर सकते हैं, लाइसोसोमल प्रसंस्करण ओरो धुंधला लिपिड बूंदें फार्म से पहले की आवश्यकता है । प्रदर्शित करने के लिए, BMDMs ९० मिनट के लिए myelin मलबे के साथ गर्मी, धोया, और निर्धारण और धुंधला (चित्रा 3) से पहले समय की अतिरिक्त मात्रा के लिए कल्चरित थे. चित्रा 4 पता चलता है वहां उपचार दीक्षा और तटस्थ लिपिड उपस्थिति के बीच एक देरी है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि लिपिड प्रतिधारण संस्कृति के दौरान स्थिर नहीं है । BMDMs छोटी बूंद गठन के बाद जल्द ही जमा लिपिड metabolize शुरू हो जाएगा । इस तरह, हम न अब से 24 घंटे की प्रतीक्षा की सिफारिश धोने दूर गैर घिरा हुआ myelin मलबे और निर्धारण के बीच ।

    ओरो सना हुआ क्षेत्र के ठहराव BMDMs में myelin लिपिड चयापचय की दर को दर्शाता है (चित्रा 5). एक ९० मिनट की बातचीत की अवधि के बाद, कोशिकाओं को ताजा CMCM में मशीन के लिए लौट रहे थे । ताजा माध्यम में जल्दी पीछा अवधि के दौरान, BMDMs metabolize phagocytosed myelin मलबे लिपिड घटक तटस्थ ओरो में धुंधला लिपिड में । ओरो सकारात्मक क्षेत्र में एक निरंतर वृद्धि बातचीत के बाद घंटों में विशिष्ट है । 24 घंटे के बाद हालांकि, BMDMs effluxed या metabolized intracellular लिपिड का एक महत्वपूर्ण हिस्सा होगा ।

    Figure 1
    चित्र 1 : प्रतिनिधि BMDM संस्कृतियों । कुछ अनुयाई कोशिकाओं को शुरू में मनाया जाएगा । 3 दिन पर, किसी भी गैर-अनुयाई कक्ष निकाल दिए जाते हैं । 7 दिन तक, परिपक्व अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज मनाया जाता है । स्केल = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Figure 2
    चित्र 2 : BMDM Myelin मलबे Phagocytosis परख के प्रतिनिधि छवियां । कोशिकाओं को धोने और 4% पीएफए के साथ निर्धारण करने से पहले 1 घंटे के लिए myelin मलबे लेबल 1mg/एमएल CFSE के साथ इलाज किया गया । आंतरिक myelin मलबे एक महामारी फ्लोरोसेंट सक्षम माइक्रोस्कोप पर मानक GFP फिल्टर सेट का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । स्केल = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्र 3 : तेल लाल ओ (ओरो) प्रयोगात्मक डिजाइन के आरेख । BMDM 1mg/एमएल myelin मलबे (1:100 कमजोर पड़ने) के साथ ९० मिनट के लिए इलाज कर रहे हैं, धोने और संस्कृति ताजा माध्यम से निर्धारण करने से पहले के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4 : ओरो BMDM के दाग के बाद Myelin मलबे Phagocytosis । संकेत दिया समय पर 4% पीएफए के साथ निंनलिखित निर्धारण-अंक, BMDMs ओरो और Hoechst ३३२५८ के साथ दाग थे । हर समय बिंदु के लिए प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । स्केल = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Figure 5
    चित्र 5 : मात्रात्मक ओरो की छवि विश्लेषण धुंधला । ओरो धुंधला के ठहराव के लिए, 3 कुओं 5 प्रति अच्छी तरह से छवियों के साथ 20X में imaged थे । सभी छवि प्राप्ति सेटिंग्स समान थीं । त्रुटि पट्टियां = SEM. (n = 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    प्रक्रियाओं यहां वर्णित दोनों ताजा पृथक कच्चे तेल सीएनएस myelin मलबे और प्राथमिक अस्थि मज्जा का उपयोग-मैक्रोफेज व्युत्पंन । पशु व्यय को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि दोनों दिमाग और अस्थि मज्जा कोशिकाओं बलिदान के समय प्रत्येक माउस से काटा जा. दो शोधकर्ताओं ने एक साथ काम दोनों सामग्री एक साथ तैयार कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, दिमाग में संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c पंजाब में myelin मलबे अलगाव से पहले एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक । यह हमारा अनुभव रहा है कि दिमाग को इन परिस्थितियों में myelin मलबे पीढ़ी की क्षमता का कोई प्रशंसनीय नुकसान के साथ 1 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है ।

    CFSE उपयोग और फ्लोरोसेंट तीव्रता के अपने आसानी की वजह से myelin मलबे लेबल किया जाता है । डाई रहता है जब तक सेलुलर esterases अणु पर एसीटेट समूह सट14। मुक्त succinimidyl एस्टर समूह तो प्राथमिक के बीच के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, सेलुलर प्रोटीन के लिए आबंध लगाव में जिसके परिणामस्वरूप14। जबकि CFSE उत्तेजित मानक हरी फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग कर रहा है, वहां कई विभिंन वर्णक्रमीय संपत्तियों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेरिवेटिव हैं । इस प्रकार, यह एक समान phagocytosis परख कई फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग कर डिजाइन करने के लिए संभव है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि क्योंकि डाई आसानी से प्लाज्मा झिल्ली को पार, यह myelin मलबे के रूप में एक समान तरीके से अपोप्तोटिक कोशिकाओं को लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है19. इसके अलावा, जबकि हमारी विधि मानक छवि विश्लेषण पर निर्भर करता है, उपयोगकर्ता अनुकूलन के साथ, ठहराव प्रवाह cytometry या एक उच्च प्रवाह प्लेट इमेजिंग प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है ।

    तेल लाल ओ (भी विलायक लाल 27, या सूडान लाल 5B के रूप में जाना जाता है) एक वसा में घुलनशील डाई कि बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है ऊतकीय नमूनों में तटस्थ लिपिड दाग है । इसकी गहरी लाल रंजकता दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी5,20के माध्यम से intracellular लिपिड के दृश्य के लिए अनुमति देता है । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का प्रयोग एकल चैनल इमेजिंग और ओरो सना हुआ लिपिड बूंदों के मजबूत ठहराव के लिए अनुमति देता है । जबकि दाग विधि सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि है, देखभाल नमूना तैयारी के दौरान लिया जाना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि शराब या एसिड आधारित fixatives नहीं किया जा सकता है, के रूप में वे intracellular लिपिड भंग कर सकते हैं, तीव्रता धुंधला में एक महत्वपूर्ण कमी करने के लिए अग्रणी । इसके अतिरिक्त, के रूप में किसी भी मात्रात्मक छवि विश्लेषण के साथ, मानकीकृत छवि पर कब्जा सेटिंग्स और पर्याप्त निष्पक्ष नमूने के महत्व ख़ामोश नहीं किया जा सकता है । धुंधला नियंत्रण का उपयोग किसी भी नमूना ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए खाते के लिए सिफारिश की है । इस तरह के दाग नियंत्रण हूबहू इलाज किया जाना चाहिए, लेकिन ओरो के साथ दाग पृष्ठभूमि ऑटो प्रतिदीप्ति के स्तर को मापने के लिए छोड़ दिया । फिर भी, हमारी छवि विश्लेषण विधि ऐसे ओरो निष्कर्षण विधि21के रूप में अंय लिपिड ठहराव तकनीकों, की तुलना में कम अनुकूलन की आवश्यकता है, जो मानक वक्र तैयारी की आवश्यकता है, और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए प्रवण है, और आवश्यक नमूने के विनाश । छवि आधारित विश्लेषण के उपयोग में पारंपरिक ओरो निष्कर्षण तरीकों पर कई फायदे है कि यह गैर विनाशकारी और immunostaining21,22 के साथ संगत है ।

    अंत में, जबकि प्रक्रियाओं का वर्णन अपेक्षाकृत सीधे आगे हैं, यह महत्वपूर्ण है कि उचित रोकनेवाला तकनीक का इस्तेमाल किया जा, के बाद से मैक्रोफेज व्यक्त कई रिसेप्टर्स कि पहचान रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPS) जैसे endotoxin lipopolysaccharide (एलपीएस)23. बैक्टीरियल प्रदूषित के साथ बातचीत macrophage सक्रियण में परिणाम और नाटकीय अपने समारोह में बदल सकते है24,25। में एकत्र myelin मलबे के संबंध में, संदूषण के लिए परीक्षण की सिफारिश की है । ऐसे limulus amebocyte lysate (लाल) परख के रूप में Endotoxin डिटेक्शन तरीकों उच्च संवेदनशीलता है, और इस आवेदन के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है5,19।

    मैक्रोफेज स्वास्थ्य और रोग दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, फिर भी सीएनएस की चोट के सन्दर्भ में BMDMs की भूमिका वर्तमान में जांच का एक महत्वपूर्ण विषय है. यहां वर्णित विधियों का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने BMDMs द्वारा phagocytosis myelin मलबे के तंत्र को बेहतर ढंग से समझना शुरू कर सकते हैं ।

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    Disclosures

    लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

    Acknowledgments

    लेखक ग्लेन सैंज-Hodgson, चिकित्सा के FSU कॉलेज में वीडियो उत्पादन, संपादन में अपने सभी काम के लिए मीडिया विशेषज्ञ, और आवाज पर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

    इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01GM100474 और R01GM072611) ने समर्थन दिया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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    References

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    तंत्रिका विज्ञान १३० अंक अस्थि मज्जा-व्युत्पंन macrophage phagocytosis myelin मलबे तेल लाल हे carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर रीढ़ की हड्डी में चोट neurotrauma
    इन <em>विट्रो</em> अस्थि मज्जा द्वारा Myelin मलबे के Phagocytosis-व्युत्पंन मैक्रोफेज
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    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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