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Neuroscience

In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Vi presentiamo metodi per valutare la capacità fagocitica di primari macrofagi murini derivate da midollo osseo, utilizzando residui del myelin fluorescente contrassegnati e lipido intracellulare gocciolina macchiatura.

Abstract

Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono leucociti maturi che servono un ruolo fisiologico critico come fagociti professionali in grado di cancellare una varietà di particelle. Normalmente, BMDMs sono limitati dal sistema nervoso centrale (SNC), ma a seguito di un infortunio, essi possono facilmente infiltrarsi. Una volta all'interno il tessuto danneggiato del CNS, BMDMs sono il tipo di cellula primaria responsabile per la liquidazione del pregiudizio-derivato di detriti cellulari, tra cui grandi quantità di residui del myelin ricca di lipidi. Le ramificazioni neuropathological della fagocitosi BMDM infiltrazione e mielina detriti all'interno del SNC sono complesse e non ben compreso. I protocolli descritti qui, consentono lo studio diretto in vitro di BMDMs nel contesto della lesione dello SNC. Copriamo murino BMDM isolamento e cultura, preparazione di detriti di mielina e saggi per valutare la fagocitosi di detriti BMDM della mielina. Queste tecniche producono risultati quantificabili robusti senza bisogno di attrezzature specializzate significativa o materiali, eppure possono essere facilmente personalizzate per soddisfare le esigenze dei ricercatori.

Introduction

Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono un importante collegamento tra il sistema immunitario innato e adattivo. Come antigene che presenta le cellule (APC), possono comunicare con i linfociti tramite entrambi presentazione dell'antigene e rilascio di citochine1,2,3. Tuttavia, come fagociti professionali, la loro funzione primaria è di eliminare gli agenti patogeni, le cellule invecchiate e detriti cellulari1,4. A seguito di una ferita del midollo spinale (SCI), notevoli quantità di residui del myelin viene generato dai oligodendrocytes morente, il tipo di cellula responsabile della CNS assone mielinizzazione5. Noi ed altri abbiamo indicato che la liquidazione dei residui del myelin è principalmente la responsabilità di infiltrazione del BMDMs5,6,7. Tuttavia, all'interno di ferita del midollo spinale engulfment siti di residui del myelin è stato suggerito di spostare queste cellule antinfiammatorie normalmente verso un stato pro-infiammatorio5,8,9. Come mediatori chiave della neuro-infiammazione nel midollo spinale danneggiato, BMDMs sono obiettivi clinici importanti.

Al fine di studiare l'influenza della BMDMs nel midollo spinale danneggiato, abbiamo sviluppato un modello in vitro per studiare direttamente come BMDMs rispondere a residui del myelin. Per migliorare la rilevanza biologica, sia primario BMDMs murino e residui del myelin appena isolate sono utilizzati in queste indagini. Come tale, i metodi presentati qui dettaglio anche l'isolamento e coltura di BMDMs murino primario e derivato una tecnica gradiente di saccarosio modificate usata per isolare murino CNS mielina detriti10,11,12. Residui del myelin possono essere prontamente etichettato con un colorante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), per rilevare che l'internalizzazione di BMDMs. CFSE è adatto per questa applicazione perché è non citotossica e suoi permessi stretto spettro fluorescente Multiplexing con altri fluorescente sonde13,14. A seguito di fagocitosi, mielina detriti i lipidi sono trasportati attraverso i lisosomi e confezionati come lipidi neutri in goccioline di lipidi intracellulari5. Per quantificare questo accumulo di lipidi intracellulari, presentiamo un olio rosso O (ORO) che macchia il metodo ottimizzato per l'analisi quantitativa delle immagini. Questo semplice metodo di macchiatura produce robusti risultati riproducibili e quantificazione15. Questi metodi facilitano lo studio di ritenzione di fagocitosi e del lipido di detriti della mielina con limitate attrezzature specializzate.

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Protocol

I metodi descritti qui e nella sezione 2 sono stati approvati dalla Florida State University istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e segue le linee guida stabilite in Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8° edizione . Tutti gli animali utilizzati in questo in questo protocollo sono di casa in una struttura di animali di laboratorio dedicato fino all'utilizzo. Nessuna sperimentazione in vivo è stato eseguito prima del sacrificio. Numero di animali era basate su necessità sperimentali utilizzando media delle celle e collezioni di mielina come guida al fine di ridurre al minimo l'utilizzo.

Nota: Questo protocollo descrive la generazione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) (sezione 1), la preparazione dei residui del myelin fluorescente contrassegnati di cervello-derivato (sezione 2), la procedura generale per l'analisi di fagocitosi di detriti della mielina (sezione 3), e la procedura generale per l'analisi di accumulazione di mielina detriti del lipido (sezione 4). Preparazione dei reagenti, cella raccolta e manipolazione, raccolta di mielina ed etichettatura e performance test dovrebbe essere completati in una flusso d'aria laminare di biosicurezza.

1. generazione dei macrofagi primari derivanti dal midollo osseo

  1. Preparazione del terreno di coltura completa del macrofago (cm)
    Nota:     generazione del macrofago dal midollo osseo richiede l'uso del fattore distimolazione del macrofago (M-CSF). Questa preparazione utilizza i L929 dei fibroblasti murini condizionato media come fonte di M-CSF.
    1. Generare i media di fibroblasti murini condizionato L929 dalle cellule di coltura in piastre da 145 mm con 50 mL di alto glucosio (4500 mg/L L-glucosio) Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con siero di vitello nato nuovo 5% (NCS) e penicillina/streptomicina per 7 giorni.
    2. Raccogliere media da culture in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL e centrifugare per 30 minuti a 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtrare i surnatanti attraverso un filtro per siringa 0,2 µm in una nuova provetta conica 50 mL. Media condizionati possa essere memorizzati a-80 ° C fino a 6 mesi.
    4. Ad alto glucosio DMEM, aggiungere 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 dei fibroblasti murini condizionata DMEM e 1% penicillina/streptomicina. Media può essere memorizzato a 4 ° C per 2-3 mesi. Calda a 37 ° C prima dell'uso.
  2. Raccolta di cellule del midollo osseo primario e induzione del macrofago
    Nota: Utilizzando questo protocollo un mouse genererà circa 20 milioni derivanti dal midollo osseo macrofagi (BMDMs).
    1. Eutanasia il numero desiderato di 8-10 settimana vecchi topi utilizzando le linee guida standard CO2 asfissia seguiti da dislocazione cervicale.
    2. Sterilizzare l'animale utilizzando 70% etanolo (vol/vol): H2O, saturando la pelliccia.
    3. Fare un piccolo taglio nell'addome e attentamente tirare indietro la pelle per rivelare il tessuto sottostante. Fare attenzione a non forare la cavità peritoneale.
    4. Rimuovere entrambi i piedini posteriori a partire dell'anca e termina alla caviglia. Posto il tessuto raccolto in una capsula Petri 100 mm contenenti fosfato sterile 5-10 mL tampone salino (PBS) completato con 1% penicillina/streptomicina.
      Nota: Quando l'elaborazione di diversi animali assicuratevi di mantenere i piatti sul ghiaccio per limitare la degradazione del tessuto.
    5. Togliere l'osso usando un bisturi muscolare e del tessuto connettivo. Solo il femore e la tibia sono utilizzati per la raccolta delle cellule, può essere scartato il perone.
    6. Esporre la cavità del midollo delle ossa raccolte tagliando una piccola sezione da ogni estremità con un bisturi.
    7. Utilizzando un ago 25g, sciacquare la cavità del midollo con 59cm in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Le ossa apparirà bianche una volta che essi sono state svuotate sufficientemente.
    8. Una volta ultimata la raccolta, agitare aspira con un ago da 18g per 30-90 s generare una sospensione unicellulare.
      Nota: Un passaggio di lisi opzionale di globuli rossi (RBC) può essere eseguita a questo punto. Recentemente è stato suggerito che il contenuto intracellulare del ferro può influenzare gli effetti di residui del myelin sopra del macrofago polarizzazione16. Per ulteriori informazioni per quanto riguarda l'inclusione di un passo di lisi RBC fare Trouplin et al. 17.
    9. Filtrare la sospensione attraverso un colino di sterile cella 70 µm in una nuova provetta conica 50 mL.
    10. Seme raccolto cellule uniformemente in piastre di coltura cellulare 145 mm contenente mL 15-20 cm. Utilizzare circa tre piastre di coltura per topo sacrificato. Incubare le colture a 37 ° C, 5% CO2.
    11. Dopo 72 ore lavare le piastre una volta con PBS sterile per rimuovere le cellule non-aderenti, quindi aggiungere 15-20mL 59cm fresco. Incubare le colture per altri 4 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Dopo 7 giorni di cultura totale, le cellule di midollo osseo ematopoietico inizialmente isolate sarà maturo BMDMs (Figura 1).

2. generazione di residui del Myelin fluorescente contrassegnati cervello-derivato

Nota: Tutti i reagenti possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 mese.

  1. Preparazione dei reagenti di raccolta detriti mielina
    1. Preparare Tris· Soluzione tampone di cl.
      1. A 800mL di acqua distillata deionizzata H2O (ddiH2O), aggiungere 20 mL di 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentrazione finale di 20 mM) e 20 mL di 100 mM Na2EDTA (concentrazione finale di 2 mM).
      2. Regolare il pH a 7,45. Regolare il volume a 1000 mL con ddiH2O. filtro soluzione attraverso un'unità di filtrazione 0,2 µm.
    2. Preparare la soluzione di saccarosio 1m.
      1. A 100 mL di Tris· CL soluzione tampone, aggiungere 68,46 g di saccarosio. Regolare il volume a 200 mL con Tris· Soluzione tampone di cl. Filtrare la soluzione attraverso un'unità di filtrazione di 0,2 µm.
    3. Preparare 200 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M diluendo la soluzione di 1m con il Tris· CL 0.83:0.16 di soluzione tampone (vol/vol).
    4. Preparare 150 mL di soluzione di saccarosio 0,83 M diluendo la soluzione di 1m con il Tris· CL 0.83:0.16 di soluzione tampone (vol/vol).
  2. Raccolta di residui del myelin greggio cervello-derivato
    Nota: Il metodo di prelievo descritto qui è per l'isolamento dei residui del myelin grezza.
    1. Eutanasia, topi di 10-12 8-10 settimane di età utilizzando direttive standard di CO2 asfissia seguite da dislocazione cervicale.
    2. Sezionare i cervelli e metterli in un piatto di 100 mm contenente 10 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M.
Tenere il piatto sul ghiaccio.
  • Usando le forbici chirurgiche sterili tagliare i cervelli in pezzi di circa 5 mm3 dimensioni.
  • Trasferire il tessuto di una provetta conica per centrifuga da 50 mL e aggiungere circa 30 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M.
  • Omogeneizzare con un omogeneizzatore rotativo manuale sterile, finché non si ottiene una soluzione liscia.
  • Diluire l'omogeneizzato cervelli ad un volume finale di 90 mL con una soluzione di saccarosio 0,32 M.
  • A sei tubi di 38,5-mL con pareti sottili in polipropilene ultracentrifuga, aggiungere 20 mL di soluzione di saccarosio 0,83 M.
  • Delicatamente aggiungere la soluzione di omogeneizzato cervello alla parte superiore della soluzione di saccarosio 0,83 M, facendo attenzione a non per mescolare i due strati.
  • Equilibrio di ciascuna provetta con la soluzione di saccarosio 0,32 M.
  • Centrifuga a 100.000 x g per 45 min a 4° C, utilizzando un appropriato preraffreddata rotore ultracentrifuga. Impostato sui valori minimi per ridurre la perdita di mielina detriti rotore accelerazione e decelerazione.
  • Raccogliere i residui del myelin dall'interfaccia delle due densità di saccarosio.
    Nota: detriti dovrebbero apparire come una banda bianca verso il centro del tubo.
  • Combinare i residui del myelin grezzo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e regolare il volume a circa 35 mL utilizzando Tris· Soluzione tampone di cl.
  • Omogeneizzare i residui del myelin grezzo con un omogeneizzatore rotativo manuale sterile per 30-60 s.
  • Dividere equamente la sospensione tra 6 tubi di ultracentrifuga pulito ed equilibrio con un volume adeguato di Tris· Soluzione tampone di cl.
  • Centrifuga a 100.000 x g per 45 min a 4° C, utilizzando un appropriato preraffreddata rotore ultracentrifuga. Impostato sui valori massimi rotore accelerazione e decelerazione.
  • Come solido bianco pellet sarà ora visibile, eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 10-15 mL di Tris· Soluzione tampone di cl.
  • Dividere equamente la sospensione tra 2 tubi ultracentrifuga pulito ed equilibrio con un volume adeguato di Tris· Soluzione tampone di cl.
  • Centrifugare nuovamente a 100.000 x g per 45 min a 4 ° C, utilizzando un appropriato preraffreddata rotore ultracentrifuga. Impostato sui valori massimi rotore accelerazione e decelerazione.
  • Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 5-6 mL di PBS sterile e dividere la sospensione tra un numero adeguato di tubi micro-centrifuga pre-pesati 1,5 mL.
  • Centrifuga a 22.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  • Scartare il surnatante e determinare il peso delle palline di detriti di mielina.
  • Risospendere il pellet in PBS a una concentrazione finale di 100 mg/mL.
    Nota: dieci-dodici cervelli è abbastanza per produrre 10-15ml di residui del myelin 100 mg/mL. Residui del myelin possono essere conservare a-80 ° C per 6 mesi.
  • Contrassegno fluorescente di mielina detriti
    1. Preparare la soluzione di 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) immediatamente prima dell'uso.
      1. Utilizzando PBS sterile, diluire una soluzione di riserva di 5 mM di CFSE preparati con 100% dimetilsolfossido (DMSO) a una concentrazione finale di lavoro di 50 µM.
      2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa 0,2 µm.
    2. Scongelare la quantità desiderata di residui del myelin 100 mg/mL e risospendere con un ago sterile 29 g.
      Nota: i residui del myelin di congelamento provoca l'abbandonano la soluzione che richiede risospensione prima dell'uso.
    3. Trasferire i residui del myelin a una micro-centrifuga pre-pesati 1,5 mL.
    4. Centrifuga a 14.800 x g per 10 min a 4° C. Scartare il surnatante.
    5. Risospendere i residui del myelin in 200 µ l di soluzione di CFSE per 100 residui del myelin µ l pellettati.
    6. Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA) al riparo dalla luce.
    7. Centrifuga a 14.800 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
    8. Risospendere il pellet in 600-800 µ l di tampone di lavaggio (0,2 µm filtro sterilizzato glicina 100mm in PBS).
    9. Centrifuga a 14.800 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
    10. Ripetere i passaggi 2.3.8-2.3.9 altre due volte.
    11. Dopo il lavaggio finale, determinare il peso del pellet di detriti di mielina e risospendere a 100 mg/mL con PBS sterile.
      Nota: Residui del myelin con etichetta possono essere conservare a-80 ° C fino a 6 mesi.

    • 3. mielina detriti test di fagocitosi

    Nota: Di seguito è riportato il metodo di base per l'osservazione di fagocitosi di residui del myelin fluorescente contrassegnati. Aggiunta di altri trattamenti e condizioni sperimentali dovrà essere ottimizzata dallo sperimentatore.

    1. Preparazione delle piastre di trattamento
      1. Per ogni piastra 145mm, raccogliere BMDMs maturo in una provetta conica per centrifuga 15 mL con 5-6 mL di acido etilendiamminotetracetico 10mm (ed) in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (dPBS) (pH 7.4).
        Nota: Non utilizzare tripsina in quanto può alterare lo stato di attivazione delle cellule18.
      2. Aggiungere un volume uguale di 59cm pre-riscaldato a ciascuna provetta di cellule prelevate.
      3. Centrifugare a 180 x g per 8 min 20 ° C. Scartare il surnatante.
      4. Risospendere le cellule in 59cm e conteggio.
      5. A ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti, aggiungere 1 x 105 cellule in 1 mL di 59cm.
      6. Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 24 h.
    2. Analisi e trattamento di detriti di mielina
      1. Aggiungere 10 µ l di 100 mg/mL CFSE etichettato residui del myelin in ciascun pozzetto (concentrazione finale di 1 mg/mL).
      2. Incubare per 1-3 ore a 37 ° C, 5% CO2.
      3. Lavare la piastra 3 volte con PBS sterile per rimuovere residui del myelin non inghiottito.
      4. Aggiungere 400 µ l di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a TA.
      5. Lavare la piastra 2 volte con PBS sterile.
      6. Aggiungere 400 µ l di soluzione di Hoechst 33258 a ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
      7. Lavare le piastre 2 volte con PBS sterile.
      8. Aggiungere 200 µ l di Fluoro-gel con tampone Tris ad ogni pozzetto per ridurre photobleaching.
      9. Celle di immagine utilizzando un microscopio in grado di epi-fluorescenza invertito.
        Nota: Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione della CFSE è 494 nm e 521 nm, rispettivamente.
      10. Dividere il numero di cellule positive CFSE per il numero di nuclei per determinare l'assorbimento di detriti di mielina relativa.
      11. Prima di formazione immagine, è possibile mantenere piastre fino a 7 giorni a 4 ° C al riparo dalla luce.

    4. quantificazione dei lipidi intracellulari tramite olio rosso-O macchiatura

    Nota: Di seguito è riportato il metodo di base per l'osservazione intracellulari lipidi della mielina-detriti-derivati.L'uso di CFSE etichettato residui del myelin non è raccomandato per quantificazione fluorescente di ORO macchiatura dovuto sovrapposizione spettrale. Aggiunta di altri trattamenti e condizioni sperimentali dovrà essere ottimizzata dallo sperimentatore.

    1. Preparazione di soluzioni di colorazione
      1. Preparare soluzione colorante di 0,5% olio rosso-O (ORO).
        1. Lentamente aggiungere 100 mL del 100% di glicole propilenico (1,2-propandiolo) a 0,5 g di ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) continuando a mescolare.
        2. Riscaldare la soluzione a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando tutte le particelle più grandi vengono sciolti.
          Nota: non riscaldare oltre i 100 ° C.
        3. Filtrare la soluzione attraverso un pezzo di carta da filtro mentre ancora caldo in un nuovo contenitore.
        4. Consentire la soluzione di fresca durante la notte a RT. soluzione può essere conservata fino a 1 anno a TA.
      2. Preparare la soluzione di glicole propilenico 85%.
        1. Aggiungere 85 mL di glicole propilenico 100% a 15 mL di ddiH2O. mescolare fino misto. Soluzione può essere conservata fino a 1 anno a TA.
    2. Preparazione delle piastre di trattamento
      1. Preparare una piastra a 24 pozzetti seguendo il metodo descritto nella sezione 3.
      2. Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 24 h.
    3. Trattamento di detriti di mielina
      1. Aggiungere 10 µ l di residui del myelin 100mg/mL ad ogni pozzetto (concentrazione finale di 1 mg/mL).
      2. Incubare per 1-3 h a 37 ° C, 5% CO2.
      3. Lavare la piastra 3 volte con PBS sterile per rimuovere residui del myelin non digerito.
        Nota: A questo punto, piastre possono sottoporsi sia fissazione immediata o 59cm fresche possono essere aggiunti e celle restituite a incubazione per i punti di tempo aggiuntivo.
      4. Aggiungere 400 µ l di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a TA.
      5. Lavare la piastra 2 volte con PBS sterile poi dirette alla macchiatura.
    4. ORO di colorazione e analisi
      1. Lavare la piastra fissa 3 volte con ddiH2O.
      2. Aggiungere 400 µ l di 100% di glicole propilenico in ogni pozzetto e incubare per 5 minuti a TA.
        Nota: questo ridurrà il riporto di ddiH2O.
      3. Aspirare il glicole propilenico e aggiungere 400 µ l di soluzione ORO in ciascun pozzetto.
      4. Incubare per 8 min a 60 ° C.
      5. Aspirare la soluzione ORO. Quindi, aggiungere 400 µ l di 85% di glicole propilenico in ogni pozzetto e incubare per 5 minumintes a TA.
      6. Lavare la piastra 3 volte con ddiH2O.
      7. Aggiungere 400 µ l di soluzione di Hoechst 33258 a ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a RT, al riparo dalla luce.
      8. Lavare le piastre 2 volte con PBS sterile.
      9. Aggiungere 200 µ l di Fluoro-gel con tampone Tris in ciascun pozzetto.
      10. Celle di immagine utilizzando un microscopio in grado di epi-fluorescenza invertito. ORO possa essere imaged utilizzando un set di filtri standard Texas Red o DsRed.
      11. Quantificare ritenzione del lipido relativa determinazione della superficie ORO positiva in ogni campo di immagine e dividendolo per il numero dei nuclei.
      12. Mantenere piastre per 7 giorni a 4 ° C al riparo dalla luce.

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    Representative Results

    Trattamento di BMDMs con CFSE etichettato residui del myelin dovrebbe produrre chiaro internalizzazione (Figura 2). Mentre un tempo di 3 ore di interazione è sufficiente per BMDMs a fagocitare abbastanza residui del myelin aggiunto per rilevamento affidabile a valle, accumulo intracellulare può essere osservata con un minimo di 1 ora di interazione. Tuttavia, alcuni residui del myelin possono ancora essere presenti sulla superficie delle cellule dopo il lavaggio. Questo potrebbe essere a causa di un lavaggio insufficiente o particelle non essendo completamente interiorizzate durante le prime fasi della fagocitosi.

    Mentre BMDMs può interiorizzare velocemente residui del myelin, prima forma di goccioline lipidiche stainable ORO è necessaria elaborazione lisosomiale. Per illustrare, BMDMs sono state incubate con residui del myelin per 90 minuti, lavato e coltivate per ulteriori quantità di tempo prima della fissazione e colorazione (Figura 3). La figura 4 Mostra che c'è un ritardo tra l'inizio del trattamento e comparsa di lipidi neutri. Si noti anche che la ritenzione del lipido non è stabile durante la coltura. BMDMs inizierà a metabolizzare i lipidi accumulati subito dopo la formazione della gocciolina. Come tale, si consiglia di non più di 24 ore tra lavaggio lontano non inghiottito mielina detriti e fissazione di attesa.

    Quantificazione di ORO zona macchiata di seguito viene illustrato il tasso del metabolismo dei lipidi della mielina in BMDMs (Figura 5). Dopo un periodo di 90 minuti interazione, cellule ritornarono in incubazione in fresco 59cm. Durante il primo periodo di inseguimento in mezzo fresco, il BMDMs metabolizzare la componente lipidica di mielina fagocitati detriti in lipidi stainable ORO neutri. Un aumento costante nell'area positiva ORO è tipico nelle ore che seguono l'interazione. Dopo 24 ore, tuttavia, il BMDMs avrà effluxed o metabolizzato una porzione significativa dei lipidi intracellulari.

    Figure 1
    Figura 1 : Rappresentante BMDM culture. Alcune cellule aderenti saranno inizialmente osservate. Il giorno 3, vengono rimossi eventuali cellule non aderenti. Dal giorno 7, si osservano macrofagi maturi derivanti dal midollo osseo. Scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 2
    Figura 2 : Rappresentante immagini della fagocitosi di detriti Myelin BMDM Assay. Le cellule sono state trattate con 1mg/mL CFSE etichettato residui del myelin per 1 ora prima del lavaggio e la fissazione con 4% PFA. Residui del myelin interiorizzata possono essere visualizzato utilizzando il set di filtri standard GFP su un microscopio in grado di epi-fluorescente. Scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 3
    Figura 3 : Diagramma di disegno sperimentale di olio O rosso (ORO). BMDM sono trattati con residui del myelin 1mg/mL (diluizione 1: 100) per 90 minuti, seguita da lavaggio e cultura in mezzo fresco prima della fissazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 4
    Figura 4 : ORO macchiatura di BMDM seguendo la mielina detriti fagocitosi. Seguente la fissazione con 4% PFA a tempo-punti indicati, BMDMs sono stati macchiati con ORO e Hoechst 33258. Immagini rappresentative per ogni punto di tempo sono indicati. Scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 5
    Figura 5 : Analisi di immagine quantitativa di colorazione ORO. Per la quantificazione della colorazione ORO, 3 pozzi erano imaged 20 X con 5 immagini per pozzetto. Tutte le impostazioni di acquisizione di immagine erano identiche. Barre di errore = SEM. (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Le procedure descritte qui utilizzano entrambi appena isolato residui del myelin CNS grezza e macrofagi primari derivanti dal midollo osseo. Per ridurre le spese di animale, che si consiglia di entrambi i cervelli e le cellule del midollo osseo raccolte da ogni mouse al momento del sacrificio. Due ricercatori lavorano insieme possono preparare contemporaneamente entrambi i materiali. In alternativa, cervelli possono essere conservati a-80 ° C in PBS completati con antibiotici prima dell'isolamento di detriti di mielina. È stato la nostra esperienza che cervelli possa essere mantenuto in queste condizioni fino ad 1 mese senza perdita apprezzabile di potenziale di generazione di mielina detriti.

    CFSE viene utilizzato per identificare i residui del myelin per la sua facilità d'uso e intensità fluorescente. Il colorante rimane estiguuto finché esterasi cellulari fendono il gruppo acetato sulla molecola14. Il gruppo di liberati succinimidyl ester può successivamente reagire con primarie ammidi, con conseguente collegamento covalente di proteine cellulari14. Mentre CFSE è eccitabile utilizzando canali fluorescente verde standard, ci sono parecchi derivati commercialmente disponibili con differenti proprietà spettrali. Così, è possibile progettare un test di fagocitosi simile usando le tinture fluorescenti multiple. Si noti inoltre che poiché il colorante attraversa facilmente le membrane plasmatiche, puoi usarla per cellule apoptotiche etichetta in un modo simile come mielina detriti19. Inoltre, mentre il nostro metodo si basa sull'analisi di immagine standard, con ottimizzazione di utente, quantificazione può essere eseguita mediante citometria a flusso o un piatto di throughput elevato sistema di imaging.

    Oil Red O (noto anche come solvente rosso 27 o rosso Sudan 5B) è un colorante liposolubile che è stato usato estesamente per macchiare lipidi neutri in campioni istologici. La pigmentazione rosso intenso consente la visualizzazione dei lipidi intracellulari via sia campo luminoso e microscopia fluorescente5,20. Utilizzando la microscopia a fluorescenza permette per la quantificazione di imaging e robusto di singolo canale di ORO macchiato le goccioline del lipido. Mentre il metodo di colorazione è semplice e altamente riproducibili, è necessario prestare attenzione durante la preparazione del campione. È fondamentale che alcool o acido-base fissativi non essere usato, come si possono sciogliere i lipidi intracellulari, che conduce ad una riduzione significativa nell'intensità di colorazione. Inoltre, come con qualsiasi analisi di immagine quantitativa, non può essere sottovalutato l'importanza delle impostazioni di acquisizione immagine standardizzata e sufficiente campionamento imparziale. L'uso di macchiatura controlli è raccomandato per qualsiasi campione auto-fluorescenza. Tali colorazione controlli dovrebbero essere trattati in modo identico, ma rimasto senza macchia con ORO per misurare il livello di auto-fluorescenza di fondo. Anche così, il nostro metodo di analisi di immagine richiede meno ottimizzazione rispetto ad altre tecniche di quantificazione dei lipidi, come il ORO estrazione metodo21, che richiede una preparazione della curva standard, è più incline alla variabilità sperimentale e necessita di distruzione del campione. L'uso dell'analisi di immagine basata ha diversi vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di estrazione di ORO in quanto esso non distruttivo ed è compatibile con immunostaining21,22 .

    Infine, mentre le procedure descritte sono relativamente semplice, è fondamentale che un'adeguata tecnica asettica essere usato, poiché i macrofagi esprimono molteplici recettori che riconoscono l'agente patogeno associato pattern molecolari (PAMPS) quali l'endotossina lipopolisaccaride (LPS)23. Interazione con batterico contamina volontà provocare l'attivazione del macrofago e possibile cambiamento drammatico loro funzione24,25. Per quanto riguarda i residui del myelin raccolti, si consiglia il test per la contaminazione. Metodi di rilevamento di endotossina ad esempio, il saggio di limulus metodo lisato (LAL) hanno alta sensibilità e sono stati utilizzati in precedenza per questa applicazione5,19.

    I macrofagi svolgono un ruolo importante nella salute e la malattia, ma il ruolo di BMDMs nel contesto della lesione dello SNC è attualmente un importante argomento di indagine. Utilizzando i metodi descritti qui, i ricercatori possono cominciare a capire meglio il meccanismo della fagocitosi di detriti di mielina da BMDMs.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

    Acknowledgments

    Gli autori vorrei ringraziare Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist presso la FSU College of Medicine per tutta la sua opera nella produzione di video, l'editing e Voice-over.

    Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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    References

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    Neuroscienze problema 130 derivate dal midollo osseo del macrofago fagocitosi residui del myelin olio carboxyfluorescein succinimidyl ester ferita del midollo spinale O rosso neurotrauma
    <em>In Vitro</em> Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo
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    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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