Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Fagocytose av Myelin rusk av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Vi presenterer metoder for å vurdere phagocytic kapasitet primære murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager fluorescently merket myelin rusk og intracellulær lipid slippverktøy flekker.

Abstract

Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) er modne leukocytter som tjener en kritisk fysiologiske rolle som profesjonell phagocytes i stand til å fjerne en rekke partikler. Vanligvis BMDMs er begrenset fra sentralnervesystemet (CNS), men etter en skade, kan de lett infiltrere. En gang innenfor den skadde CNS vevet, BMDMs er den primære celle typen ansvarlig for rydding av skade-avledet mobilnettet rusk, inkludert store mengder lipid rik myelin rusk. Neuropathological betydningen av BMDM infiltrasjon og myelin rusk fagocytose i CNS er komplekse og ikke godt forstått. Protokollene som beskrevet her, Tillat for direkte i vitro studier av BMDMs i forbindelse med CNS skade. Vi dekker murine BMDM isolasjon og kultur, myelin rusk forberedelser og analyser for å vurdere BMDM myelin rusk fagocytose. Disse teknikkene gir robust målbare resultater uten behov for betydelig spesialisert utstyr eller materialer, men kan enkelt tilpasses for å møte behovene til forskere.

Introduction

Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) er et viktig bindeledd mellom de medfødte og adaptive immunsystem. Som antigen presentere celler (APCs), de kan kommunisere med lymfocytter via både antigen-presentasjon og cytokin slipp1,2,3. Men som profesjonell phagocytes er deres primære funksjon å fjerne patogener, alderen celler og mobilnettet rusk1,4. Etter en ryggmargsskade (SCI), betydelige mengder myelin rusk genereres fra døende oligodendrocytes, hvilken celle ansvarlig for CNS axon myelination5. Vi og andre har vist at klarering av myelin rusk er primært ansvarlig for infiltrere BMDMs5,6,7. Men innen ryggmargsskade har nettsteder engulfment av myelin avfall blitt foreslått for å skifte disse normalt anti-inflammatoriske celler mot en pro-inflammatoriske staten5,8,9. Som nøkkel meglere på Nevro-betennelse i skadet ryggmargen er BMDMs viktig kliniske mål.

For å undersøke påvirkning av BMDMs i skadet ryggmargen, har vi utviklet en i vitro modell å direkte studere hvordan BMDMs svare på myelin rusk. For å forbedre biologiske relevans, brukes både primære murine BMDMs og ferske isolert myelin rusk i disse undersøkelsene. Som sådan, metodene presenteres her også detalj isolasjon og kultur av primære murine BMDMs, og en modifisert sukrose gradient teknikk som brukes til å isolere murine CNS avledet myelin rusk10,11,12. Myelin rusk kan være lett merket med et fluorescerende farge, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), å spore sin internalisering av BMDMs. CFSE er godt egnet for dette programmet fordi det er ikke-cytotoksiske og dens smale fluorescerende spekteret tillater Multiplexing med andre fluorescerende sonder13,14. Etter fagocytose, myelin rusk lipider transporteres gjennom lysosomer og pakket som nøytral lipider i intracellulær lipid dråper5. For å måle denne intracellulær lipid opphopningen, presenterer vi en olje Red O (ORO) flekker metoden optimalisert for kvantitative bildeanalyser. Denne enkle flekker metoden gir robust reproduserbar resultater og kvantifisering15. Disse metodene lette studiet av myelin rusk fagocytose og lipid oppbevaring med begrenset spesialisert utstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metodene beskrevet her og i del 2 har blitt godkjent av Florida State University institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og følger retningslinjene som er angitt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, 8th utgave . Alle dyr som brukes i denne denne protokollen er hus i en dedikert laboratorium dyr anlegget før bruk. Ingen i vivo eksperimentering ble utført før ofre. Dyr tall var basert på eksperimentell behov med gjennomsnittlig cellen og myelin samlinger som en guide for å minimere bruken.

Merk: Denne protokollen beskriver generering av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) (del 1), utarbeidelse av fluorescently merket hjerne-avledet myelin rusk (del 2), den vanlige fremgangsmåten for å analysere myelin rusk fagocytose (del 3), og den generelle fremgangsmåten for analyse av myelin rusk lipid opphopning (del 4). Forberedelse av reagenser, cellen høsting og manipulasjon, myelin samling merking og analysen ytelse må fullføres i en laminær luftstrøm biosafety kabinett.

1. generasjon av primære Ben margtransplantasjon-avledet makrofager

  1. Utarbeidelse av komplett macrophage kultur medium (CMCM)
    Merk:     Macrophage generasjon fra benmargen krever bruk av macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF). Dette preparatet benytter L929 murine fibroblast betinget media som kilde til M-CSF.
    1. Generere L929 murine fibroblast betinget medier av dyrking celler i 145 mm retter med 50 mL av høy glukose (4500 mg/L L-glukose) Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) supplert med 5% ny født kalv serum (NCS) og Penicillin/Streptomycin i 7 dager.
    2. Samle medier fra kulturer i 50 mL konisk sentrifuge rør og sentrifuger i 30 minutter på 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtrere supernatants gjennom en 0,2 µm sprøyte inn en ny 50 mL konisk sentrifuge røret. Betinget media kan lagres ved-80 ° C i opptil 6 måneder.
    4. Høy glukose DMEM, legge til 5% vol/vol sokkel, 15% vol/vol L929 murine fibroblast betinget DMEM og 1% Penicillin/Streptomycin. Media kan lagres på 4 ° C for 2-3 måneder. Varmt 37 ° c før bruk.
  2. Primær bein margtransplantasjon celler og macrophage induksjon
    Merk: Bruke denne protokollen ett museklikk vil generere ca 20 millioner Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs).
    1. Euthanize ønsket antall 8-10 uke gamle mus ved hjelp av standard CO2 kvelning retningslinjer etterfulgt av cervical forvridning.
    2. Rense dyret bruker 70% (vol/vol) etanol: H2O, mette pelsen.
    3. Skjær en liten åpning i magen og trekk forsiktig tilbake huden til å avdekke de underliggende vev. Pass på å ikke punktere bukhulen.
    4. Fjerne begge to bakben ben starter ved hoftene og slutter på ankelen. Sted samlet vevet i en 100 mm Petriskål inneholder 5-10 mL steril fosfat bufret saltvann (PBS) med 1% Penicillin/Streptomycin.
      Merk: Når behandling av flere dyr pass på å holde retter på is begrense vev degradering.
    5. Fjern muskler og bindevev fra benet ved hjelp av en skalpell. Bare femur og tibia brukes for cellen innsamling, fibula kan kastes.
    6. Utsett margtransplantasjon hulrommet av samlet bein av trimming en liten del fra hver ende med en skalpell.
    7. Bruker en 25g nål, tømme margtransplantasjon hulrom med CMCM til en 50 mL konisk sentrifuge rør. Bein vises hvit når de har vært tilstrekkelig skylles.
    8. Når samlingen er fullført, agitere aspirates med en 18g nål for 30-90 s generert en enkeltcelle suspensjon.
      Merk: En valgfri røde blodlegemer (RBC) lysis trinn kan utføres på dette punktet. Det har nylig blitt foreslått at intracellulær jerninnhold kan påvirke virkningene av myelin rusk på macrophage polarisering16. For informasjon om inkludering av en RBC se lysis trinn Trouplin et al. 17.
    9. Filtrere suspensjon gjennom en 70 µm sterilt celle sil i en ny 50 mL konisk sentrifuge tube.
    10. Frø samlet celler jevnt i 145 mm celle kultur retter som inneholder 15-20 mL CMCM. Bruk ca tre kultur retter per musen ofret. Inkuber kulturer på 37 ° C, 5% CO2.
    11. Etter 72 timer vaske tallerkener gang med sterilt PBS å fjerne ikke-tilhenger celler, deretter legge til 15-20mL frisk CMCM. Inkuber kulturer for ytterligere 4 dager ved 37 ° C, 5% CO2. Etter 7 dager totalt kultur være blodkreft benmarg cellene opprinnelig isolert moden BMDMs (figur 1).

2. generasjon Fluorescently merket hjerne-avledet Myelin rusk

Merk: Reagenser kan lagres på 4 ° C i opptil 1 måned.

  1. Utarbeidelse av myelin rusk samling reagenser
    1. Forberede Tris· CL buffer løsning.
      1. 800mL destillert deionisert H2O (ddiH2O) legge til 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7.45 (20 mM endelige konsentrasjon) og 20 mL 100 mM Na2EDTA (2 mM endelige konsentrasjon).
      2. Justere pH til 7.45. Justere volumet til 1000 mL med ddiH2O. Filter løsning gjennom en 0,2 µm filtrering enhet.
    2. Forberede 1 M sucrose løsning.
      1. Til 100 mL Tris· CL buffer løsning, legge 68.46 g av sukrose. Justere volumet til 200 mL med Tris· CL buffer løsning. Filtrere løsning gjennom en 0,2 µm filtrering enhet.
    3. Klargjør 200 mL 0.32 M sucrose løsning ved å fortynne 1 M løsningen med Tris· CL buffer løsning 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. Klargjør 150 mL 0,83 M sucrose løsning ved å fortynne 1 M løsningen med Tris· CL buffer løsning 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. Samling av hjerne-avledet råolje myelin rusk
    Merk: Samling metoden beskrevet her er for isolering av råolje myelin rusk.
    1. Euthanize 10-12 mus 8-10 ukens av alderen med standard CO2 kvelning retningslinjer etterfulgt av cervical forvridning.
    2. Dissekere hjernen og plassere dem i en 100 mm rett som inneholder 10 mL 0.32 M sucrose løsning.
Holde rett på isen.
  • Ved hjelp av sterile kirurgisk saks kuttet hjernen i biter ca 5 mm3 i størrelse.
  • Overføre vev til en 50 mL konisk sentrifuge rør og legge til ca 30 mL 0.32 M sucrose løsning.
  • Homogenize med et sterilt håndholdt roterende homogenizer, til en glatt løsning er oppnådd.
  • Fortynne homogenisert hjernen til et endelig antall 90 mL med 0.32 M sucrose løsning.
  • Seks 38,5-mL tynnvegget polypropylen ultracentrifuge rør, legge til 20 mL 0,83 M sucrose løsning.
  • Forsiktig legge homogenisert hjernen løsningen til toppen av 0,83 M sucrose løsning, ta vare ikke for å blande de to lagene.
  • Balanse hver tube med 0.32 M sucrose løsning.
  • Sentrifuge 100.000 x g for 45 min ved 4° C ved hjelp av en passende avkjølt pre ultracentrifuge rotoren. Angi rotoren akselerasjon og deselerasjon til minimum verdiene til å redusere myelin rusk tap.
  • Samle myelin rusk fra grensesnittet av de to sukrose tettheter.
    Merk: rusk skal vises som et hvitt bånd mot midten av røret.
  • Kombinere råolje myelin rusk i en 50 mL konisk sentrifuge rør og juster volumet til ca 35 mL bruker Tris· CL buffer løsning.
  • Homogenize råolje myelin rusk med et sterilt håndholdt roterende homogenizer for 30-60 s.
  • Dividere jevnt suspensjon mellom 6 ren ultracentrifuge rør og balanse med en passende mengde Tris· CL buffer løsning.
  • Sentrifuge 100.000 x g for 45 min ved 4° C ved hjelp av en passende avkjølt pre ultracentrifuge rotoren. Angi rotoren akselerasjon og deselerasjon til de høyeste verdiene.
  • Som vises nå heldekkende hvit pellets, forkaste nedbryting og å utsette pellets i 10-15 mL Tris· CL buffer løsning.
  • Dividere jevnt suspensjon mellom 2 ren ultracentrifuge rør og balanse med en passende mengde Tris· CL buffer løsning.
  • Sentrifuger igjen avkjølt 100.000 x g for 45 min ved 4 ° C ved hjelp av en passende pre ultracentrifuge rotoren. Angi rotoren akselerasjon og deselerasjon til de høyeste verdiene.
  • Forkaste nedbryting og resuspend pellets i 5-6 mL steril PBS og dele suspensjon mellom et passende antall pre vektet 1,5 mL mikro-sentrifuge rør.
  • Sentrifuger 22.000 x g i 10 min på 4 ° C.
  • Forkast nedbryting og fastslå vekten myelin rusk pellets.
  • Nytt avbryte pellets PBS til en siste konsentrasjon av 100 mg/mL.
    Merk: ti-tolv hjerner er nok til å produsere 10-15 mL av 100 mg/mL myelin rusk. Myelin rusk kan være store på-80 ° C i 6 måneder.
  • Myelin rusk fluorescerende merking
    1. Forberede 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) løsning umiddelbart før bruk.
      1. Bruker sterilt PBS, fortynne en 5 mM lager løsning av CFSE med 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) til en siste arbeider konsentrasjon av 50 µM.
      2. Filtrere løsning gjennom en 0,2 µm sprøyten.
    2. Tine den ønskede mengden av 100 mg/mL myelin rusk og å suspendere med en bakteriefri 29 g nål.
      Merk: frysing myelin rusk vil føre til å løsning krever rørets før bruk.
    3. Overføre myelin rusk slik pre vektet 1,5 mL mikro-sentrifuge.
    4. Sentrifuger 14,800 x g i 10 min på 4° C. Kast nedbryting.
    5. Resuspend myelin rusk i 200 µL CFSE løsning per 100 µL myelin rusk pelleted.
    6. Inkuber i 30 min ved romtemperatur (RT) beskyttet mot lyset.
    7. Sentrifuger 14,800 x g i 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
    8. Resuspend pellet i 600-800 µL av vaskebuffer (0,2 µm filter steriliseres 100 mM glysin i PBS).
    9. Sentrifuger 14,800 x g i 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
    10. Gjenta trinn 2.3.8-2.3.9 to ganger mer.
    11. Etter siste vask, fastslå vekten myelin rusk pellets og å suspendere til 100 mg/mL med sterilt PBS.
      Merk: Merket myelin rusk kan være store på-80 ° C for inntil 6 måneder.

    • 3. myelin rusk fagocytose analysen

    Merk: Følgende er den grunnleggende metoden for å observere fagocytose av fluorescently merket myelin rusk. Andre behandlinger og eksperimentelle forhold må optimaliseres av utprøver.

    1. Utarbeidelse av behandling plater
      1. For hver 145 mm plate, samle eldre BMDMs i en 15 mL konisk sentrifuge tube med 5-6 mL 10 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (dPBS) (pH 7.4).
        Merk: Ikke bruk trypsin som det kan endre aktiveringsstatusen for celler18.
      2. Legge til en lik mengde forvarmes CMCM hver tube avhentet celler.
      3. Sentrifuger 180 x g i 8 min på 20 ° C. Kast nedbryting.
      4. Nytt suspendere celler i CMCM og antall.
      5. Hver brønn av en 24-vel celle kultur plate, legger du til 1 x 105 celler i 1 mL av CMCM.
      6. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 for 24 timer.
    2. Myelin rusk behandling og analyse
      1. Legge 10 µL av 100 mg/mL CFSE merket myelin rusk i hver brønn (1 mg/mL siste konsentrasjon).
      2. Inkuber i 1-3 timer på 37 ° C, 5% CO2.
      3. Vask plate 3 ganger med sterilt PBS å fjerne ikke-omsluttet myelin rusk.
      4. Legge til 400 µL av 4% paraformaldehyde i hver brønn. Inkuber i 30 min på RT.
      5. Vask plate 2 ganger med sterilt PBS.
      6. Legge til 400 µL Hoechst 33258 løsning i hver brønn. Inkuber i 5 min på RT beskyttet mot lyset.
      7. Vask plater 2 ganger med sterilt PBS.
      8. Legge til 200 µL av Fluoro-gel med Tris buffer i hver brønn for å redusere photobleaching.
      9. Bildet celler med en invertert epi-fluorescerende dugelig mikroskop.
        Merk: De eksitasjon og utslipp bølgelengdene av CFSE er 494 nm og 521 nm, henholdsvis.
      10. Del antall CFSE positive celler på antall kjerner til å angi relativ myelin rusk opptak.
      11. Før bildebehandling, opprettholde plater for opptil 7 dager på 4 ° C beskyttet mot lyset.

    4. kvantifisering av intracellulær lipider Via olje Red-O flekker

    Merk: Følgende er den grunnleggende metoden for å observere intracellulær myelin-avfall-avledet lipider.Bruk av CFSE merket myelin rusk anbefales ikke for fluorescerende kvantifisering av ORO flekker på grunn av spectral overlapping. Andre behandlinger og eksperimentelle forhold må optimaliseres av utprøver.

    1. Utarbeidelse av flekker løsninger
      1. Forberede 0,5% olje Red-O (ORO) flekker løsning.
        1. Sakte legge til 100 mL 100% propylenglykol (1,2-Propanediol) i 0,5 g ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) under omrøring.
        2. Varme løsning på 95 ° C i 15 minutter eller til alle store partikler er oppløst.
          Merk: ikke varme over 100 ° C.
        3. Filtrere løsning gjennom filter papir når den er varm til en ny container.
        4. Tillate løsning kule overnatting på RT. løsning kan lagres i opptil 1 år for RT.
      2. Forberede 85% propylenglykol løsning.
        1. Legge til 85 mL av 100% propylenglykol 15 mL ddiH2O. rør til blandet. Løsningen kan lagres i opptil 1 år for RT.
    2. Utarbeidelse av behandling plater
      1. Forberede en 24-vel plate etter metoden skissert i avsnitt 3.
      2. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 for 24 timer.
    3. Myelin rusk behandling
      1. Tilsett 10 µL av 100 mg/mL myelin rusk hver brønn (1 mg/mL siste konsentrasjon).
      2. Inkuber for 1-3 h ved 37 ° C, 5% CO2.
      3. Vask plate 3 ganger med sterilt PBS å fjerne ikke-fordøyd myelin rusk.
        Merk: På dette punktet, plater kan enten gjennomgå umiddelbare fiksering eller frisk CMCM kan legges, og cellene tilbake til inkubasjonstiden for ekstra tid poeng.
      4. Legge til 400 µL av 4% paraformaldehyde i hver brønn. Inkuber i 30 min på RT.
      5. Vask plate 2 ganger med sterilt PBS og utbytte for flekker.
    4. ORO flekker og analyse
      1. Vask fast plate 3 ganger med ddiH2O.
      2. Legge til 400 µL av 100% propylenglykol hver brønn og ruge i 5 min på RT.
        Merk: Dette vil redusere carryover ddiH2O.
      3. Sug opp propylenglykol og legge til 400 µL av ORO løsning i hver brønn.
      4. Inkuber i 8 min på 60 ° C.
      5. Sug opp ORO løsningen. Deretter tilsett 400 µL av 85% propylenglykol hver brønn og ruge for 5 minumintes på RT.
      6. Vask plate 3 ganger med ddiH2O.
      7. Legge til 400 µL Hoechst 33258 løsning i hver brønn. Inkuber i 5 min på RT, beskyttet mot lyset.
      8. Vask plater 2 ganger med sterilt PBS.
      9. Legge til 200 µL av Fluoro-gel med Tris buffer i hver brønn.
      10. Bildet celler med en invertert epi-fluorescerende dugelig mikroskop. ORO kan avbildes med en standard Texas rød eller DsRed filter.
      11. Kvantifisere relative lipid oppbevaring ved å bestemme ORO positiv området i hvert bildefelt og dele det på antall kjerner.
      12. Opprettholde plater i 7 dager på 4 ° C beskyttet mot lyset.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Behandling av BMDMs med CFSE merket myelin rusk skal gi klare internalisering (figur 2). Mens gangen 3 timers samhandling er tilstrekkelig for BMDMs å phagocytose nok ekstra myelin rusk for robust nedstrøms gjenkjenning, kan intracellulær opphopning observeres med så lite som 1 time interaksjon. Men kan noen myelin rusk fortsatt finnes på cellens overflate etter vask. Dette kan skyldes utilstrekkelig vask eller partikler ikke blir fullstendig internalisert i den tidlige fasen av fagocytose.

    Mens BMDMs kan raskt internalisere myelin rusk, kreves lysosomale behandling før ORO stainable lipid dråper skjemaet. For å demonstrere, var BMDMs inkubert med myelin rusk i 90 minutter, vasket og kultivert for ekstra mengder tid før fiksering og flekker (Figur 3). Figur 4 viser det er en forsinkelse mellom behandling initiering og nøytrale lipid utseende. Det bør også bemerkes at lipid oppbevaring ikke er stabil under kultur. BMDMs vil begynne å forbrenne akkumulert lipider snart etter slippverktøy formasjon. Derfor anbefaler vi vente lenger enn 24 timer mellom vask bort ikke omsluttet myelin rusk og fiksering.

    Kvantifisering av ORO farget området viser hastigheten på myelin lipid stoffskiftet i BMDMs (figur 5). Etter en 90-minutters samhandling periode, celler ble returnert til inkubasjon i friske CMCM. I tidlig chase perioden i friske medium metabolismer BMDMs phagocytosed myelin rusk lipid komponenten i nøytral ORO stainable lipider. En jevn økning i ORO positiv området er typisk i timene etter samhandlingen. Etter 24 timer men BMDMs har effluxed eller metaboliseres en betydelig del av de intracellulær lipider.

    Figure 1
    Figur 1 : Representant BMDM kulturer. Tilhenger cellene vil være først observert. Dag 3 fjernes ikke-tilhenger celler. Av dag 7, er modne Ben margtransplantasjon-avledet makrofager observert. Skalaen = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2 : Representant bilder av BMDM Myelin rusk fagocytose analysen. Cellene ble behandlet med 1mg/mL CFSE merket myelin rusk i 1 time før vask og fiksering med 4% PFA. Internalisert myelin rusk kan visualiseres ved hjelp av standard GFP filteret sett på en epi-fluorescerende dugelig mikroskop. Skalaen = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 : Diagram av olje røde O (ORO) eksperimentell Design. BMDM er behandlet med 1mg/mL myelin rusk (1: 100 fortynning) i 90 minutter, etterfulgt av vask og kultur i frisk medium før fiksering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4 : ORO farging av BMDM etter Myelin rusk fagocytose. Følgende fiksering med 4% PFA på de angitte tidspunkt BMDMs var farget med ORO og Hoechst 33258. Representant bilder for hvert tidspunkt vises. Skalaen = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5 : Kvantitative bildeanalyser med ORO farging. For kvantifisering av ORO flekker, ble 3 brønner fotografert på 20 X med 5 bilder per brønn. Alle bildeinnstillingene oppkjøpet var identiske. Feilfelt = SEM. (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Prosedyrene som er beskrevet her benytter både fersk isolert råolje CNS myelin rusk og primære Ben margtransplantasjon-avledet makrofager. For å redusere dyr utgifter, anbefaler vi at både hjerne og bein margtransplantasjon celler høstes fra hver musen ved offer. To forskere samarbeide kan forberede begge materialene samtidig. Hjernen kan også lagres på-80 ° C i PBS med antibiotika før myelin rusk isolasjon. Det er vår erfaring at hjerner kan opprettholdes under disse forholdene i opptil 1 måned uten merkbar tap av myelin rusk generasjon potensialet.

    CFSE brukes til å navngi myelin rusk på grunn av sin brukervennlighet og fluorescerende intensitet. Fargestoff forblir Let til mobilnettet esterases cleave gruppen acetate molekyl14. Frigjort succinimidyl ester gruppen kan deretter reagere med primær amides, som resulterer i kovalente vedlegg til mobilnettet proteiner14. Mens CFSE er nervøs med standard grønne fluorescerende kanaler, er det flere derivater kommersielt tilgjengelig med forskjellige spektrale egenskapene. Dermed er det mulig å utforme en lignende fagocytose analysen bruker flere fluorescerende fargestoffer. Det bør også bemerkes at fordi fargestoff lett krysser plasma membraner, den kan brukes til etiketten apoptotisk celler på samme måte som myelin rusk19. Videre mens vår metode avhengig standardbilde analyse, med bruker optimalisering, utføres kvantifisering med flowcytometri eller en høy gjennomstrømning tallerken tenkelig system.

    Olje Red O (også kjent som løsemiddel Red 27 eller Sudan Red 5B) er en fettløselige fargestoff som har vært brukt mye stain nøytral lipider i histologiske prøver. Sin dype røde pigmentering tillater visualisering av intracellulær lipider via både lyse felt og fluorescerende mikroskopi5,20. Bruke lysstoffrør mikroskopi tillater enkeltkanals tenkelig og robust kvantifisering av ORO farget lipid dråper. Mens metoden flekker er enkel og svært reproduserbare, må omsorg tas under eksempel forberedelse. Det er viktig at alkohol eller syrebasert fiksativene ikke brukes, hvordan de kan løses intracellulær lipider, fører til en betydelig reduksjon i flekker intensitet. I tillegg, som med alle kvantitativt bildeanalyser, kan ikke viktigheten av standardiserte fange innstillinger og tilstrekkelig upartiske prøvetaking bli undervurdert. Bruk av flekker kontroller anbefales å ta hensyn til noen eksempel auto-fluorescens. Slike flekker kontroller skal behandles likt, men venstre unstained kvinne med ORO å måle nivået av bakgrunnen auto-fluorescens. Likevel krever vårt bilde analysemetode mindre optimalisering enn andre lipid kvantifisering teknikker, som ORO utvinning metoden21, som krever standardkurve forberedelse, er mer utsatt for eksperimentell variasjon, og nødvendiggjør ødeleggelsen av prøven. Bruk av bildeanalyse basert har flere fordeler fremfor tradisjonelle ORO utvinning metoder som det ikke-destruktiv og er kompatibel med immunostai-21,22 .

    Til slutt, mens fremgangsmåtene er relativt rett frem, er det avgjørende at brukes riktig steril teknikk, siden makrofager express flere reseptorer som gjenkjenner patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPS) som endotoxin lipopolysakkarid (LPS)23. Interaksjon med bakteriell forurenser vil resultere i macrophage aktivisering og kan dramatisk endre deres funksjon24,25. I forhold til samlet myelin rusk anbefales testing for forurensning. Endotoxin gjenkjenningsmetoder som limulus amebocyte lysate (LAL) analysen har høy følsomhet, og har vært brukt tidligere til denne program5,19.

    Makrofager spiller en viktig rolle i både helse og sykdom, men rollen BMDMs i forbindelse med CNS skader er et viktig tema i etterforskningen. Bruke metodene som er beskrevet her, kan forskere begynne å forstå mekanismen av myelin rusk fagocytose av BMDMs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingen avsløringer.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gjerne takke Glenn Sanger-Hodgson, Media spesialist på FSU College of Medicine for alle sitt arbeid i videoproduksjon, redigering og voice-over.

    Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01GM100474 og R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Nevrovitenskap problemet 130 Ben margtransplantasjon-avledet macrophage fagocytose myelin rusk olje røde O carboxyfluorescein succinimidyl ester ryggmargsskade Biografiske filmer
    <em>In Vitro</em> Fagocytose av Myelin rusk av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter