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Neuroscience

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

Abstract

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são leucócitos maduros que servem a um papel fisiológico crítico como fagócitos profissionais capazes de limpar uma variedade de partículas. Normalmente, BMDMs são restritas do sistema nervoso central (SNC), mas após uma lesão, podem facilmente se infiltrar. Uma vez dentro o tecido lesado do CNS, BMDMs são o tipo de célula primária responsável para a liberação de restos celulares derivados de lesões, incluindo grandes quantidades de detritos de mielina rica de lipídios. As ramificações neuropatológicas da fagocitose de detritos infiltração e mielina BMDM dentro o CNS são complexas e não é bem compreendido. Os protocolos descritos aqui, permitem direto em vitro estudo da BMDMs no contexto de lesão de CNS. Nós cobrimos murino BMDM isolamento e cultura, preparação de restos de mielina e ensaios para avaliar a fagocitose de restos de mielina BMDM. Estas técnicas produzem resultados quantificáveis robustos, sem a necessidade de equipamento especializado significativo ou materiais, no entanto, podem ser facilmente personalizadas para atender às necessidades dos pesquisadores.

Introduction

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodendrócitos moribundos, o tipo de célula responsável pela CNS axônio mielinização5. Nós e os outros têm mostrado que o afastamento dos restos de mielina é sobretudo da responsabilidade de infiltração BMDMs5,6,7. No entanto, dentro da lesão da medula espinhal com a duração de sites de restos de mielina tem sido sugerida para deslocar estas células normalmente anti-inflamatórios no sentido de um estado pro-inflamatórios5,8,9. Como principais mediadores neuro-inflamação na medula espinhal lesada, BMDMs são alvos clínicos importantes.

Para ajudar a investigar a influência da BMDMs na medula espinhal lesada, desenvolvemos um modelo in vitro para estudar diretamente como BMDMs responder aos restos de mielina. Para melhorar a relevância biológica, tanto BMDMs murino primários e os restos de mielina recentemente isoladas são usados nestas investigações. Como tal, os métodos apresentados aqui também detalham o isolamento e a cultura de BMDMs murino primários e derivado de uma técnica de gradiente de sacarose modificada usada para isolar o CNS murino mielina detritos10,11,12. Os restos de mielina podem prontamente ser rotulados com um corante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), para acompanhar que sua internalização por BMDMs. CFSE é bem adequada para esta aplicação, porque é não citotóxicas e suas licenças de espectro estreito fluorescente multiplexação com outras fluorescentes sondas13,14. Após a fagocitose, lipídios de restos de mielina são transportados através de lisossomos e empacotados como lipídios neutros em gotículas de lipídios intracelular5. Para quantificar este acúmulo intracelular de lipídios, apresentamos um óleo vermelho O ORO () método otimizado para análise quantitativa de imagem de coloração. Este método de coloração simples produz resultados reprodutíveis robustos e quantificação de15. Esses métodos facilitam o estudo da mielina detritos fagocitose e lipídios de retenção com equipamento especializado limitada.

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Protocol

Os métodos descritos aqui e na seção 2 foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Florida estado Universidade institucional Cuidado Animal e segue as directrizes estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, 8ª edição . Todos os animais utilizados no presente no presente protocolo são casa em um centro de animais de laboratório dedicado até o uso. Nenhuma experimentação na vivo foi realizado antes do sacrifício. Número de animais foram baseado na necessidade experimental usando a célula média e coleções de mielina, como um guia a fim de minimizar o uso.

Nota: Este protocolo descreve a geração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) (secção 1), a preparação dos restos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro (seção 2), o procedimento geral para a análise de fagocitose de restos de mielina (seção 3), e o procedimento geral para análise de acumulação de lipídios de detritos de mielina (secção 4). Preparação do reagente, celular colheita e manipulação, coleção de mielina e rotulagem e ensaio de desempenho devem ser concluídas em uma fluxo de ar laminar de biossegurança do armário.

1. geração de macrófagos derivados da medula óssea primárias

  1. Preparação do meio de cultura completo macrófago (CMCM)
    Nota:     geração de macrófagos da medula óssea requer o uso de fator colônia-estimulando do macrófago (M-CSF). Esta preparação utiliza mídia de fibroblasto murino condicionado L929 como fonte de M-CSF.
    1. Gere mídia de fibroblasto murino condicionado L929 por cultivo de células em pratos de 145 mm com 50 mL de glicose elevada (4500 mg/L, L-glicose) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 5% de soro de bezerro nascido novo (NCS) e penicilina/estreptomicina por 7 dias.
    2. Recolher meios de culturas em tubos de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtrar sobrenadantes através de um filtro de seringa 0,2 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL. Condicionado de mídia pode ser armazenadas a-80 ° C por até 6 meses.
    4. A glicose alta DMEM, adicionar 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 murino fibroblasto condicionado DMEM e 1% penicilina/estreptomicina. Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante 2-3 meses. Aquecido a 37 ° C antes do uso.
  2. Coleção de células primárias da medula óssea e indução de macrófagos
    Nota: Usando este um mouse protocolo irá gerar aproximadamente 20 milhões derivadas da medula óssea macrófagos (BMDMs).
    1. Eutanásia o número desejado de semana de 8-10 ratos velhos usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidos por deslocamento cervical.
    2. Higienizar o animal usando 70% (vol/vol) etanol: H2O, saturando o pelo.
    3. Cortar uma pequena abertura no abdômen e puxe cuidadosamente a pele para revelar o tecido subjacente. Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal.
    4. Remova ambas as pernas traseiras, começando no quadril e terminando na altura da tornozelo. Lugar do tecido coletado em um prato de Petri de 100mm contendo fosfato estéril de 5-10 mL tampão salino (PBS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina.
      Nota: Quando processar vários animais certifique-se de manter os pratos no gelo para limitar a degradação do tecido.
    5. Retire o músculo e tecido conjuntivo do osso usando um bisturi. Apenas o fêmur e a tíbia são utilizados para coleta de célula, a fíbula pode ser descartada.
    6. Expor a cavidade da medula dos ossos recolhidos por aparar uma pequena secção de cada extremidade com um bisturi.
    7. Usando uma agulha 25g, irrigue as cavidades da medula com CMCM em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Os ossos aparecerá brancos, uma vez que eles têm sido suficientemente liberados.
    8. Concluída a coleta, agite aspirados com uma agulha de 18g por 30-90 s gerado uma suspensão de célula única.
      Nota: Um passo de Lise opcional – glóbulos vermelhos (RBC) pode ser realizado neste momento. Recentemente tem sido sugerido que o teor de ferro intracelular pode influenciar os efeitos dos restos de mielina em macrófago polarização16. Para obter informações sobre a inclusão de uma etapa de Lise RBC referir-Trouplin et al. 17.
    9. Filtre a suspensão através de um filtro de célula estéril 70 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL.
    10. Sementes coletadas células uniformemente em pratos de cultura celular de 145 mm com 15-20 mL CMCM. Use aproximadamente três pratos de cultura por rato sacrificado. Incube as culturas a 37 ° C, 5% de CO2.
    11. Após 72 horas lavar pratos uma vez com PBS estéril para remover as células não-aderentes, em seguida, adicione 15-20mL CMCM fresco. Incube as culturas por mais 4 dias a 37 ° C, 5% de CO2. Após 7 dias de cultura total, as células hematopoiéticas da medula óssea inicialmente isoladas será maduros BMDMs (Figura 1).

2. geração de detritos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro

Nota: Todos os reagentes podem ser armazenados a 4 ° C por até 1 mês.

  1. Preparação dos reagentes de coleção de restos de mielina
    1. Preparar Tris· Solução-tampão de CL.
      1. A 800mL água destilada deionizada H2O (ddiH2O) adicionar 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentração final de 20 mM) e 20 mL de 100mm Na2EDTA (concentração final de 2 mM).
      2. Ajuste o pH a 7,45. Ajuste o volume para 1000 mL com ddiH2solução de filtro de O. através de uma unidade de filtração 0,2 µm.
    2. Prepare a solução de sacarose 1M.
      1. A 100 mL de Tris· CL solução de tampão, adicionar 68,46 g de sacarose. Ajustar o volume de 200 mL com Tris· Solução-tampão de CL. Filtre a solução através de uma unidade de filtração de 0,2 µm.
    3. Preparar 200 mL de solução de sacarose de 0,32 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).
    4. Preparar 150 mL de solução de sacarose de 0,83 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).
  2. Coleção de restos de mielina bruto derivado do cérebro
    Nota: O método de coleta descrito aqui é para o isolamento dos restos de mielina bruto.
    1. Eutanásia em ratos de 10-12 8-10 semanas de idade usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidas por deslocamento cervical.
    2. Dissecar o cérebro e os coloque em um prato de 100 mm, contendo 10 mL de solução de sacarose de 0,32 M.
Mantenha o prato no gelo.
  • Usando a tesoura cirúrgica estéril, cortar o cérebro em pedaços de aproximadamente 5 mm3 no tamanho.
  • Transferir o tecido para um tubo de centrifuga conico de 50 mL e adicionar cerca de 30 mL de solução de sacarose de 0,32 M.
  • Homogeneizar com um homogenizador giratório portátil estéril, até que seja alcançada uma solução suave.
  • Dilua o cérebro homogeneizado até um volume final de 90 mL com solução de sacarose de 0,32 M.
  • Para seis tubos de 38,5 mL paredes finas polipropileno se, adicione 20 mL de solução de sacarose de 0,83 M.
  • Delicadamente, adicione a solução de cérebro homogeneizado para o topo da solução de sacarose de 0,83 M, tomando cuidado para não misturar as duas camadas.
  • Contrapeso de cada tubo com a solução de sacarose de 0,32 M.
  • Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores mínimos para reduzir a perda de restos de mielina.
  • Recolha os restos de mielina da interface das duas densidades de sacarose.
    Nota: os detritos devem aparecer como uma faixa branca em direção ao centro do tubo.
  • Combinar os restos de mielina bruto em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e ajustar o volume a cerca de 35 mL, usando Tris· Solução-tampão de CL.
  • Homogeneizar os restos de mielina bruto com um homogenizador giratório portátil estéril para 30-60 s.
  • Divida uniformente a suspensão entre 6 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.
  • Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.
  • Como sólidas brancas pelotas agora será visíveis, desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10-15 mL de Tris· Solução-tampão de CL.
  • Divida uniformente a suspensão entre 2 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.
  • Centrifugar novamente a 100.000 x g durante 45 min a 4 ° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.
  • Desprezar o sobrenadante e ressuspender as bolas em 5-6 mL de PBS estéril e dividir a suspensão entre um número adequado de tubos de microcentrífuga pré-pesados 1,5 mL.
  • Centrifugar a 22.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
  • Desprezar o sobrenadante e determinar o peso das pelotas de restos de mielina.
  • Re-suspenda as pelotas em PBS para uma concentração final de 100 mg/mL.
    Nota: dez ou doze cérebro é suficiente para produzir 10-15 mL de restos de mielina de 100 mg/mL. Os restos de mielina podem ser loja a-80 ° C por 6 meses.
  • Os restos de mielina fluorescente rotulagem
    1. Prepare a solução 50 µM carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) imediatamente antes do uso.
      1. Usando o PBS estéril, dilua uma solução stock de 5 mM de CFSE preparado com 100% dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de trabalho de 50 µM.
      2. Filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,2 µm.
    2. Descongele a quantidade desejada de restos de mielina de 100 mg/mL e ressuspender com uma agulha estéril de 29 g.
      Nota: congelar os restos de mielina fará com que a largar a solução que exigem re-suspensão antes do uso.
    3. Transferi os restos de mielina para um tubo de centrífuga de micro pré-pesados 1,5 mL.
    4. Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4° C. Desprezar o sobrenadante.
    5. Resuspenda os restos de mielina em 200 µ l de solução CFSE por restos de mielina 100 µ l peletizado.
    6. Incube durante 30 min à temperatura (RT), protegida da luz.
    7. Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    8. Resuspenda o pellet em 600-800 µ l de tampão de lavagem (0,2 µm filtro esterilizado glicina 100mm em PBS).
    9. Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    10. Repita as etapas 2.3.8-2.3.9 mais duas vezes.
    11. Após a lavagem final, determinar o peso da pelota de restos de mielina e ressuspender a 100 mg/mL com PBS estéril.
      Nota: Os restos de mielina rotulado podem ser loja a-80 ° C por até 6 meses.

    • 3. a mielina ensaio de fagocitose de detritos

    Nota: O seguinte é o método básico para observar a fagocitose de restos de mielina fluorescente etiquetadas. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.

    1. Preparação de placas de tratamento
      1. Para cada placa de 145 mm, colete BMDMs maduros em um tubo de centrifuga conico de 15 mL com 5-6 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 10mm (EDTA) em fosfato salino de Dulbecco (dPBS) (pH 7,4).
        Nota: Não utilize tripsina pois ele pode alterar o estado de ativação de células18.
      2. Adicione um volume igual de CMCM pré-aquecido a cada tubo de células coletadas.
      3. Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante.
      4. Ressuspender as células em CMCM e contagem.
      5. A cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços, adicione 1 x 105 células em 1 mL de CMCM.
      6. Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.
    2. Análise e tratamento de resíduos de mielina
      1. Adicione 10 µ l de 100 mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina de cada bem (concentração final de 1 mg/mL).
      2. Incube durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% de CO2.
      3. Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não engolido.
      4. Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.
      5. Lave a placa 2 vezes com PBS estéril.
      6. Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.
      7. Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.
      8. Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço para reduzir fotobranqueamento.
      9. Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido.
        Nota: Os excitação e emissão de comprimentos de onda de CFSE são 494 nm e 521 nm, respectivamente.
      10. Divida o número de células positivas CFSE pelo número de núcleos para determinar a absorção de restos de mielina relativo.
      11. Antes da imagem latente, manter as placas por até 7 dias a 4 ° C, protegido da luz.

    4. quantificação dos lipídios intracelulares através de coloração de vermelho-O óleo

    Nota: O seguinte é o método básico para a observação de lipídios intracelulares de mielina-detritos derivados.O uso de CFSE rotulado os restos de mielina não é recomendado para quantificação fluorescente de ORO de coloração devido à sobreposição espectral. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.

    1. Preparação de soluções de coloração
      1. Prepare a solução de coloração vermelho-O óleo (ORO) 0,5%.
        1. Lentamente, adicionar 100 mL de propilenoglicol 100% (1,2-propanodiol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol), agitando.
        2. Aqueça a 95 ° C por 15 min ou até que todas as partículas grandes são dissolvidas.
          Nota: Não aqueça acima de 100 ° C.
        3. Filtrar a solução através de um pedaço de papel de filtro, enquanto ainda quente em um novo recipiente.
        4. Permitir que a solução legal durante a noite no RT. solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT
      2. Prepare a solução de glicol de propileno de 85%.
        1. Adicione 85 mL de propilenoglicol 100% para 15 mL de ddiH2O. mexa até misturado. Solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT
    2. Preparação de placas de tratamento
      1. Prepare uma placa de 24 seguindo o método descrito na seção 3.
      2. Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.
    3. Tratamento de detritos de mielina
      1. Adicione 10 µ l de restos de mielina de 100 mg/mL a cada poço (concentração final de 1 mg/mL).
      2. Incube durante 1-3 h a 37 ° C, 5% de CO2.
      3. Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não digerido.
        Nota: Neste ponto, placas podem também sofrer fixação imediata ou CMCM fresca pode ser adicionada, e células retornou a incubação por pontos de tempo adicional.
      4. Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.
      5. Lave a placa 2 vezes com PBS estéril então, procced à mancha.
    4. Coloração de ORO e análise
      1. Lave a placa fixa 3 vezes com ddiH2O.
      2. Adicione 400 µ l de propileno glicol de 100% a cada poço e incubar durante 5 min à RT
        Nota: isto irá reduzir o reporte de ddiH2O.
      3. Aspirar o propilenoglicol e adicione 400 µ l de solução ORO a cada poço.
      4. Incubar durante 8 min a 60 ° C.
      5. Aspire a solução ORO. Em seguida, adicione 400 µ l de 85% propilenoglicol a cada poço e incubar durante 5 minumintes no RT
      6. Lavar a placa 3 vezes com ddiH2O.
      7. Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.
      8. Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.
      9. Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço.
      10. Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO pode ser fotografada usando um conjunto padrão de filtro vermelho Texas ou DsRed.
      11. Quantificar de retenção relativo lipídios determinando a área positiva de ORO em cada campo de imagem e dividindo-o pelo número de núcleos.
      12. Manter as placas durante 7 dias a 4 ° C protegido da luz.

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    Representative Results

    Tratamento de BMDMs com CFSE rotulado os restos de mielina deve produzir interiorização clara (Figura 2). Enquanto um tempo de 3 horas de interação é suficiente para BMDMs fagocitar suficiente restos de mielina adicionado para a deteção de jusante robusto, acúmulo intracelular pode ser observado com tão pouco quanto 1 hora da interação. No entanto, alguns restos de mielina ainda podem estar presentes na superfície das células após a lavagem. Isto pode ser devido à lavagem insuficiente, ou não sendo totalmente internalizadas durante os estágios iniciais de fagocitose de partículas.

    Enquanto BMDMs rapidamente pode internalizar os restos de mielina, processamento dos lisossomos é necessário antes a forma de gotículas lipídicas stainable ORO. Para demonstrar, BMDMs foram incubadas com os restos de mielina durante 90 minutos, lavados e cultivadas por quantidades adicionais de tempo antes da fixação e coloração (Figura 3). A Figura 4 mostra que há um atraso entre o início do tratamento e aparência de lipídios neutros. Também deve ser notado que a retenção de lipídios não é estável durante a cultura. BMDMs vai começar a metabolizar lipídios acumulados logo após a formação da gota. Como tal, recomendamos esperar não mais de 24 horas entre os restos de mielina não-tragado ausente de lavagem e fixação.

    Quantificação de ORO manchado área demonstra a taxa de metabolismo de lipídios mielina em BMDMs (Figura 5). Após um período de 90 minutos de interação, as células foram devolvidas para incubação em CMCM fresco. Durante o período inicial de perseguição em meio fresco, os BMDMs metabolizam o componente de lipid de detritos fagocitados mielina em lípidos stainable neutros de ORO. Um aumento constante na área positiva de ORO é típico nas horas após a interação. Depois de 24 horas, os BMDMs terão effluxed ou metabolizada uma parcela significativa dos lipídeos intracelulares.

    Figure 1
    Figura 1 : Representante BMDM culturas. Poucas células aderentes serão observadas inicialmente. No dia 3, as células não-aderentes são removidas. Por 7 dia, observam-se macrófagos maduros derivadas da medula óssea. Escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 2
    Figura 2 : Ensaio de imagens de representante da fagocitose de restos de mielina BMDM. As células foram tratadas com 1mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina por 1 hora antes da lavagem e fixação com 4% PFA. Os restos de mielina interiorizada podem ser visualizado usando conjuntos de filtro padrão GFP em um microscópio capaz de epi-fluorescente. Escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 3
    Figura 3 : Diagrama de óleo O vermelho (ORO) Experimental Design. BMDM são tratados com os restos de mielina de 1mg/mL (diluição 1: 100) por 90 minutos, seguido de lavagem e cultura em meio fresco antes da fixação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 4
    Figura 4 : ORO coloração de BMDM após a fagocitose de restos de mielina. Seguir fixação com 4% PFA nos pontos de tempo indicados, BMDMs foram corados com ORO e Hoechst 33258. São mostradas imagens representativas para cada ponto de tempo. Escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 5
    Figura 5 : Análise quantitativa de imagem de ORO coloração. Para a quantificação de ORO de coloração, 3 poços foram fotografados em 20 X com 5 imagens por bem. Todas as configurações de aquisição de imagem eram idênticas. Barras de erro = SEM. (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    Os procedimentos descritos aqui utilizam ambos recém isolados restos de mielina CNS bruto e macrófagos derivados da medula óssea primários. Para reduzir despesas do animais, é recomendável que os cérebros e células da medula óssea de cada rato ser colhidas no momento do sacrifício. Dois pesquisadores trabalhando juntos podem preparar ambos os materiais simultaneamente. Alternativamente, os cérebros podem ser armazenados a-80 ° C em PBS suplementadas com antibióticos antes de isolamento de restos de mielina. Tem sido nossa experiência que o cérebro pode ser mantida nessas condições por até 1 mês sem perda apreciável de potencial de geração de detritos de mielina.

    CFSE é usado para rotular os restos de mielina por causa de sua facilidade de uso e intensidade fluorescente. O corante permanece extinto até celulares esterases cleave o grupo acetato sobre a molécula de14. Grupo libertos succinimidil éster pode então reagir com amidas primárias, resultando na fixação covalente a proteínas celulares14. Enquanto CFSE é excitável usando padrão verdes fluorescentes canais, existem vários derivados comercialmente disponíveis com diferentes propriedades espectrais. Assim, é possível projetar um ensaio de fagocitose semelhante usando vários corantes fluorescentes. Também deve ser notado que porque a tintura prontamente atravessa as membranas de plasma, pode ser usada para pilhas apoptotic de rótulo em uma maneira similar como os restos de mielina19. Além disso, enquanto nosso método baseia-se na análise de imagem padrão, com otimização de usuário, quantificação pode ser realizada usando citometria de fluxo ou uma placa de alta taxa de transferência de imagem de sistema.

    Óleo vermelho (também conhecido como solvente vermelho 27, ou vermelho Sudão 5B) é um corante solúvel em gordura que tem sido amplamente utilizado para manchar lípidos neutros em amostras histológicas. Sua pigmentação vermelha profunda permite a visualização de lipídios intracelulares via tanto campo claro e microscopia fluorescente5,20. Usar microscopia fluorescente permite a quantificação de imagiologia e robusto único canal de ORO manchada de gotículas lipídicas. Enquanto o método de coloração é simples e altamente reprodutível, deve-se tomar cuidado durante a preparação da amostra. É fundamental que álcool ou ácido-base fixador não sejam utilizados, como eles podem dissolver lipídios intracelulares, levando a uma redução significativa na intensidade de coloração. Além disso, tal como acontece com qualquer análise quantitativa da imagem, a importância de configurações de captura de imagem padronizada e amostragem suficiente de imparcial não pode ser suavizada. Recomenda-se o uso de controles de coloração para contabilizar qualquer amostra autofluorescência. Esses controles de coloração devem ser tratados de forma idêntica, mas esquerda inocente com ORO para medir o nível de fundo autofluorescência. Mesmo assim, o nosso método de análise de imagem requer menos otimização do que outras técnicas de quantificação de lipídios, tais como a ORO extração método21, que exige a preparação da curva padrão, é mais propenso a variabilidade experimental e exige destruição da amostra. A utilização da análise de imagem com base tem várias vantagens sobre os métodos de extração de ORO tradicionais em que-não-destrutivos e é compatível com immunostaining21,22 .

    Finalmente, enquanto os procedimentos descritos são relativamente simples e direta, é fundamental que a técnica asséptica apropriada ser usado, desde que os macrófagos expressam vários receptores que reconhecem patógenos associados a padrões moleculares (PAMPS) tais como a endotoxina lipopolissacarídeo (LPS)23. Interação com bactéria contamina irá resultar na ativação de macrófagos e pode mudança dramática sua função24,25. No que diz respeito aos restos de mielina coletados, testes de contaminação é recomendado. Métodos de deteção de endotoxinas como o ensaio de (LAL) lisado limulus métodos têm sensibilidade elevada e têm sido utilizados anteriormente para esta aplicação5,19.

    Os macrófagos desempenham um papel importante na saúde e na doença, no entanto, o papel de BMDMs no contexto de lesão do CNS é atualmente um importante tema de investigação. Usando os métodos descritos aqui, os pesquisadores podem começar a entender melhor o mecanismo de fagocitose de restos de mielina por BMDMs.

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    Disclosures

    Os autores têm sem divulgações.

    Acknowledgments

    Os autores gostaria de agradecer Glenn Sanger-Hodgson, especialista em mídia na faculdade de medicina de FSU, pelo seu trabalho na produção de vídeo, edição e locução.

    Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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    References

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    Neurociência edição 130 macrófago derivado de medula óssea fagocitose os restos de mielina óleo vermelho O carboxyfluorescein succinimidil éster lesão medular neurotrauma
    <em>In Vitro</em> Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea
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    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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