Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В пробирке Фагоцитоз миелина мусора макрофагами, костного мозга, полученных

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Мы представляем методы для оценки фагоцитарной способности первичного мышиных костного мозга, полученных макрофагов с использованием мусора дневно обозначенные миелина и внутриклеточных липидов капелька пятнать.

Abstract

Костный мозг производные макрофагов (BMDMs) являются зрелых лейкоцитов, которые служат критических Физиологическая роль как профессиональные фагоциты способны очистки различных частиц. Как правило BMDMs ограничены от центральной нервной системы (ЦНС), но после травмы, они могут легко проникнуть. Однажды в пораженных тканей ЦНС, BMDMs являются главной ячейки тип ответственность за разминирование травмы производные сотовой мусора, включая большое количество липидов богатых миелина мусора. Патологического последствия BMDM инфильтрации и миелина мусора фагоцитоза в пределах центральной нервной системы являются сложными и не хорошо понятны. Протоколы, описанные здесь, позволяют для прямой в vitro исследования BMDMs в контексте травмы ЦНС. Мы покрываем мышиных BMDM изоляции и культуры, миелина мусора подготовки и анализов для оценки BMDM миелина мусора фагоцитоза. Эти методы производить надежные количественные результаты без необходимости значительного специализированного оборудования или материалов, но могут быть легко настроены для удовлетворения потребностей исследователей.

Introduction

Костный мозг производные макрофагов (BMDMs) являются важным связующим звеном между врожденная и адаптивного иммунитета. Как антиген представляющих клеток (БТР) они могут общаться с лимфоцитов через обе презентации антигена и цитокина релиз1,2,3. Однако как профессиональных фагоцитов, их основная функция – очистить патогенов, возрасте клеток и клеточных обломков1,4. После травмы спинного мозга (SCI) значительное количество миелина мусора генерируется из умирающих олигодендроциты, типа клеток, ответственных за ЦНС аксона миелинизации5. Мы и другие показали, что распродажа миелина мусора является прежде всего обязанностью проникновения BMDMs5,6,7. Однако в пределах спинного сайты сплошным миелина мусора было предложено перенести эти обычно противовоспалительных клеток к про воспалительных государство5,8,9. Как основные посредники нейро-воспаления спинного мозга пострадавшего BMDMs являются важные клинические цели.

Чтобы помочь изучить влияние BMDMs в спинной мозг потерпевшего, мы разработали модель в vitro непосредственно изучить, как BMDMs реагировать миелина мусора. Для улучшения биологической значимости, первичный мышиных BMDMs и свежевыделенных миелина мусора используются в этих расследований. Таким образом представленные здесь методы также подробно изоляции и культуры первичной мышиных BMDMs, и изменение сахарозы градиентный метод, используемый для изолировать мышиных ЦНС производных миелина мусора10,,1112. Миелиновые мусора могут быть легко помечены Люминесцентную краску, Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE), трек, который его интернализации, BMDMs. CFSE хорошо подходит для этого приложения, потому что это не цитотоксических, и разрешений на его узких флуоресцентного спектра мультиплексирование с другими флуоресцентных зондов13,14. После фагоцитоза миелина мусора липиды транспортируются через лизосом и упакованы как нейтральные липиды в внутриклеточного липидного капель5. Для количественного определения это накопление внутриклеточных липидов, мы представляем O Красного масла (Оро), окрашивание метод, оптимизированный для анализа количественных изображений. Этот простой метод окрашивания производит надежные воспроизводимость результатов и количественной оценки15. Эти методы содействия изучению миелина мусора фагоцитоза и липидов удержания с ограниченным специализированного оборудования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Методы описанные здесь и в разделе 2 были одобрены Флорида государственного университета институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC) и руководящие принципы, изложенные в руководство для ухода и использования лабораторных животных, 8-й выпуск . Все животные, используемые в этом в настоящем Протоколе, дом в учреждении специальных лабораторных животных до использования. Не в естественных условиях экспериментов был выполненных ранее в жертву. Поголовья были основаны на экспериментальных потребности, используя средний клеток и миелина коллекций в качестве руководства для того, чтобы свести к минимуму использование.

Примечание: Этот протокол описывает поколения костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) (раздел 1), подготовка дневно обозначенные мозга, полученных миелина мусора (раздел 2), Общая процедура для анализа миелина мусора фагоцитоза (раздел 3), и Общая процедура для анализа миелина мусора накопления липидов (раздел 4). Подготовка реагента, уборки клеток и манипуляции, коллекции миелина и маркировки и анализа производительности должен быть завершен в ламинарный поток воздуха биобезопасности кабинета.

1. Генерация первичных макрофагов, костного мозга, полученных

  1. Подготовка полного макрофагов питательной среды (CMCM)
    Примечание:     макрофагов поколения от костного требует использования макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF). Эта подготовка использует L929 мышиных фибробластов кондиционером СМИ как источник M-CSF.
    1. Генерировать L929 мышиных фибробластов кондиционером СМИ путем культивирования клеток в 145 мм блюда с 50 мл из высоких глюкозы (4500 мг/Л Л-глюкозы) Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнена 5% новый род телячьей сыворотки (NCS) и пенициллин/стрептомицина за 7 дней.
    2. Собирать СМИ от культур в 50 мл конические пробирок и центрифуги для 30 минут на 3500 x g, 4 ° C.
    3. Фильтр supernatants через фильтр 0.2 мкм шприц в новый Тюбик 50 мл конические центрифуги. Кондиционерами СМИ могут храниться при температуре-80 ° C до 6 месяцев.
    4. Для высокой глюкозы DMEM, добавить 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 мышиных фибробластов кондиционером DMEM и 1% пенициллина/стрептомицина. Средства массовой информации могут храниться при температуре 4 ° C на 2-3 месяца. Теплой до 37 ° C перед использованием.
  2. Сбор первичных костный мозг клеток и макрофагов индукции
    Примечание: С помощью одной мыши этот протокол будет генерировать около 20 миллионов костного мозга-производные макрофагов (BMDMs).
    1. Усыпить желаемое количество 8-10 недели старых мышей с использованием стандартных руководящих принципов удушение CO2 следуют шейки матки дислокации.
    2. Дезинфекции животных с помощью 70% этанола (vol/vol): H2O, насыщая мех.
    3. Вырезать небольшое отверстие в животе и осторожно потяните кожу, чтобы выявить основной ткани. Позаботьтесь, чтобы не пункции брюшной полости.
    4. Удалите оба лань legs начиная с бедра и заканчивая лодыжки. Место собраны ткани в чашке Петри 100 мм, содержащий 5-10 мл стерильной фосфат буфер солевой раствор (PBS), с 1% пенициллина/стрептомицина.
      Примечание: Когда обработка нескольких животных не забудьте сохранить блюда на льду ограничить деградации ткани.
    5. Удаление мышечной и соединительной ткани из кости с помощью скальпеля. Используются только бедра и голени для коллекции ячейку, малоберцовой кости, может быть удален.
    6. Разоблачить полости костного мозга костей, собранных путем обрезки небольшой участок от каждого конца с помощью скальпеля.
    7. С помощью иглы 25g, Очистка полости костного мозга с CMCM в 50 мл конические пластиковых пробирок. Кости появится белый после того, как они были достаточно покраснел.
    8. После завершения сбора, агитируйте пунктаты с 18g игла для 30-90 s для генерации подвеска одну ячейку.
      Примечание: Лизис шаг необязательный эритроцитов (РБК) может быть выполнено на данный момент. Недавно было предложено, что содержание внутриклеточного железа может влиять на последствия миелина мусора после макрофагов поляризации16. Для информации относительно включения РБК лизис шаг обратитесь к Trouplin и др. 17.
    9. Фильтр подвеска через стрейнер 70 мкм стерильным клеток в новый Тюбик 50 мл конические центрифуги.
    10. Семя собраны ячейки равномерно в 145 мм блюд культуры клеток, содержащих 15-20 мл CMCM. Используйте примерно три культуры блюда на мышь жертву. Инкубируйте культур при 37 ° C, 5% CO2.
    11. После 72 часов мыть плиты с стерильных PBS, чтобы удалить не сторонник клетки, затем добавить 15-20 мл свежего CMCM. Инкубируйте культур еще 4 дней при 37 ° C, 5% CO2. После 7 дней, общей культуры кроветворных клеток костного первоначально изолированные будет зрелой BMDMs (рис. 1).

2. поколение дневно обозначенные мозга, полученных миелина мусора

Примечание: Все реагенты могут храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца.

  1. Подготовка миелина мусора коллекции реагентов
    1. Подготовка Tris· CL буферного раствора.
      1. До 800 мл дистиллированной деионизированной H2O (ddiH2O) добавляют 20 мл 1 M Tris· CL, pH 7.45 (20 mM концентрации выпускных экзаменов) и 20 мл 100 мм Na2ЭДТА (2 mM концентрации выпускных экзаменов).
      2. Отрегулируйте пэ-аш до 7,45. Отрегулируйте громкость до 1000 мл с ddiH2O. фильтра раствором через блок фильтрации 0,2 мкм.
    2. Подготовка 1 М раствора сахарозы.
      1. До 100 мл Tris· CL буферного раствора, добавить 68.46 г сахарозы. Отрегулируйте громкость до 200 мл с Tris· CL буферного раствора. Фильтр раствор через блок фильтрации 0,2 мкм.
    3. Подготовка 200 мл раствора сахарозы 0,32 М путем разбавления 1 М раствора с Tris· CL буферного раствора 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. Подготовка 150 мл раствора сахарозы 0,83 М путем разбавления 1 М раствора с Tris· CL буферного раствора 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. Сбор мусора мозга производные нефти миелина
    Примечание: Для изоляции нефти миелина мусора коллекции метод, описанный здесь.
    1. Усыпить мышей 10-12, 8-10 недель возраста с использованием стандартных руководящих принципов по удушение2 CO следуют шейки матки дислокации.
    2. Рассечь мозги и поместите их в тарелку 100 мм, содержащие 10 мл раствора сахарозы 0,32 М.
Держите блюдо на льду.
  • Стерильные хирургические ножницами, вырезать мозг на кусочки примерно 5 мм3 в размер.
  • Передача ткани до 50 мл конические пластиковых пробирок и добавить примерно 30 мл раствора сахарозы 0,32 М.
  • Однородный с стерильных ручные ротационные гомогенизатор, пока не будет достигнуто решение гладкой.
  • Разбавьте гомогенизированные мозги, чтобы окончательный объем 90 мл с 0,32 М раствора сахарозы.
  • Для шести 38,5 мл тонкостенных полипропиленовые ультрацентрифуга трубы добавьте 20 мл раствора сахарозы 0,83 М.
  • Аккуратно добавьте решение гомогенизированные мозга в верхней части 0,83 М раствора сахарозы, стараясь не смешивать два слоя.
  • Баланс пробирки с раствором сахарозы 0,32 М.
  • Центрифуга на 100,000 x g 45 мин при 4° C, с использованием соответствующего предварительно охлаждается ротор Ультрацентрифуги. Установите ротор ускорение и замедление их минимальные значения для уменьшения потерь мусора миелина.
  • Сбор мусора миелина из интерфейса двух плотности сахарозы.
    Примечание: мусор должен появиться как белая полоса к центру трубки.
  • Объединить сырой миелина мусора в 50 мл конические пластиковых пробирок и отрегулировать громкость примерно 35 мл, используя Tris· CL буферного раствора.
  • Однородный сырой миелина мусора с стерильных ручные поворотные гомогенизатор для 30-60 сек.
  • Равномерно распределить подвеска 6 чистый ультрацентрифуга трубы и баланс с соответствующим объемом Tris· CL буферного раствора.
  • Центрифуга на 100,000 x g 45 мин при 4° C, с использованием соответствующего предварительно охлаждается ротор Ультрацентрифуги. Установить их максимальные значения ротор ускорение и замедление.
  • Как теперь будут видны твердые белые гранулы, отменить супернатант и вновь приостановить гранулы в 10-15 мл Tris· CL буферного раствора.
  • Равномерно распределить подвеска 2 чистой ультрацентрифуга трубы и баланс с соответствующим объемом Tris· CL буферного раствора.
  • Центрифуга снова на 100,000 x g 45 мин при 4 ° C, с использованием соответствующего предварительно охлаждается ротор Ультрацентрифуги. Установить их максимальные значения ротор ускорение и замедление.
  • Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 5-6 мл стерильного PBS и разделить подвеска между соответствующее количество предварительно взвешенный 1,5 мл микро-пробирок.
  • Центрифуга на 22 000 x g 10 мин при 4 ° C.
  • Отменить супернатант и определить вес брикетов мусора миелина.
  • Вновь приостановить гранулы в PBS в конечной концентрации 100 мг/мл.
    Примечание: десять-двенадцать мозги достаточно производить 10-15 мл 100 мг/мл миелина мусора. Миелина мусора можно хранить при температуре-80 ° C 6 месяцев.
  • Миелиновые мусора люминесцентные маркировки
    1. Приготовляют раствор эфира (CFSE) succinimidyl Карбоксифлуоресцеина 50 мкм непосредственно перед использованием.
      1. С помощью стерильных PBS, разбавьте 5 мм Стоковый раствор CFSE, подготовленных с 100% диметилсульфоксида (ДМСО) к окончательной рабочей концентрации 50 мкм.
      2. Фильтр раствор через фильтр шприц 0,2 мкм.
    2. Оттепель нужное количество мусора миелина 100 мг/мл и вновь приостановить с помощью иглы стерильные 29 g.
      Примечание: блокирование мусора миелина приведет к его бросают решения, требующие ресуспендирования перед использованием.
    3. Передавать предварительно взвешенный 1,5 мл микро центрифуга миелина мусора.
    4. Центрифуга в 14800 g x 10 мин при 4° C. Выбросите супернатант.
    5. Ресуспензируйте миелина мусора в 200 мкл CFSE раствора на 100 мкл миелина мусора гранулированных.
    6. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре (RT) защищены от света.
    7. Центрифуга в 14800 g x 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    8. Ресуспензируйте гранулы в 600-800 мкл буфера мытья (0,2 мкм фильтром стерилизованные 100 мм Глицин в PBS).
    9. Центрифуга в 14800 g x 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    10. Повторите шаги 2.3.8-2.3.9 вдвое больше.
    11. После окончательной стирки определить вес Пелле мусора миелина и вновь приостановить до 100 мг/мл с стерильных PBS.
      Примечание: Помечены миелина мусора можно хранить при температуре-80 ° C до 6 месяцев.

    • 3. миелина мусора фагоцитоза Assay

    Примечание: Ниже приведен базовый метод наблюдения фагоцитоза дневно обозначенные миелина мусора. Добавление других процедур и экспериментальных условий будет необходимо оптимизировать следователем.

    1. Подготовка лечения пластин
      1. Для каждой пластины 145 мм собирают Зрелые BMDMs в 15 мл конические пластиковых пробирок с помощью 5-6 мл 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) Дульбекко фосфат амортизированное saline (dPBS) (рН 7,4).
        Примечание: Не используйте трипсина, как она может изменить состояние активации клеток18.
      2. Добавьте равное количество подогретым CMCM в каждую пробирку собранных клеток.
      3. Центрифуга на 180 x g 8 мин при 20 ° C. Выбросите супернатант.
      4. Вновь приостановите клетки в CMCM и count.
      5. В каждую лунку 24-ну клетки культуры плиты добавьте 1 х 105 клеток в 1 мл CMCM.
      6. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO2 на 24 часа.
    2. Лечение мусора миелина и анализ
      1. Добавьте 10 µL 100 мг/мл CFSE помечены миелина мусора для каждой скважины (конечной концентрации 1 мг/мл).
      2. Инкубируйте 1-3 часа при 37 ° C, 5% CO2.
      3. Промойте пластины 3 раза с стерильных PBS для удаления мусора не охватил миелина.
      4. 400 мкл параформальдегида 4%, в каждой скважине. Инкубируйте 30 мин на RT.
      5. Вымойте тарелка 2 раза с стерильных PBS.
      6. Добавьте 400 мкл раствора Hoechst 33258 в каждой скважине. Инкубируйте 5 мин на RT, защищенном от света.
      7. Мыть тарелки 2 раза с стерильных PBS.
      8. Добавьте 200 мкл фтор гель с трис-буфер для каждой скважины для уменьшения Фотообесцвечивание.
      9. Изображение клетки с помощью инвертированным микроскопом способны epi люминесцентные.
        Примечание: Возбуждения и выбросах волн CFSE, 494 Нм и 521 Нм, соответственно.
      10. Разделите количество положительных клеток CFSE на количество ядер для определения относительной миелина поглощение мусора.
      11. До обработки изображений, сохранить пластины на срок до 7 дней при 4 ° C, защищать от света.

    4. Количественная оценка внутриклеточных липиды через пятнать Красного O нефти

    Примечание: Ниже приведен базовый метод наблюдения внутриклеточный миелин мусора производные липиды.CFSE, помечены миелина мусора не рекомендуется использовать для флуоресцентных квантификации Оро пятнать благодаря спектрального наложения. Добавление других процедур и экспериментальных условий будет необходимо оптимизировать следователем.

    1. Подготовка пятнать решения
      1. Готовят 0,5% нефти красно-O (Оро) окрашивание раствора.
        1. Медленно добавьте 100 мл 100% пропилен гликоль (1,2-пропандиола) по 0,5 г Оро (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) помешивая.
        2. Нагрейте раствор при 95 ° C в течение 15 минут или до тех пор, пока все крупные частицы растворяются.
          Примечание: не нагреваются свыше 100 ° C.
        3. Фильтр раствор через кусок фильтровальной бумаги пока еще тепло в новый контейнер.
        4. Разрешить решение прохладно ночь на RT. раствор может храниться до 1 года на RT.
      2. Готовят раствор пропиленгликоля 85%.
        1. Добавьте 85 мл 100% пропиленгликоля 15 мл ddiH2O. Stir пока не смешано. Раствор может храниться до 1 год на RT.
    2. Подготовка лечения пластин
      1. Подготовка 24-ну пластины после метода, описанного в разделе 3.
      2. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO2 на 24 часа.
    3. Миелиновые мусора лечение
      1. 10 мкл мусора миелина 100 мг/мл, для каждой скважины (конечной концентрации 1 мг/мл).
      2. Инкубируйте 1-3 ч при 37 ° C, 5% CO2.
      3. Промойте пластины 3 раза с стерильных PBS для удаления мусора не переваривается миелина.
        Примечание: В этой точке, пластины, либо можно пройти немедленной фиксации или свежие CMCM могут быть добавлены, и клетки вернулся в инкубации для дополнительного времени точек.
      4. 400 мкл параформальдегида 4%, в каждой скважине. Инкубируйте 30 мин на RT.
      5. Вымойте тарелка 2 раза с стерильных PBS затем приступайте к пятнать.
    4. Оро окрашивание и анализ
      1. Вымойте фиксированной пластина 3 раза с ddiH2O.
      2. 400 мкл 100% пропиленгликоля для каждой скважины и инкубировать в течение 5 мин на RT.
        Примечание: это позволит уменьшить вынос ddiH2O.
      3. Аспирационная пропилен гликоль и 400 мкл раствора Оро в каждой скважине.
      4. Инкубируйте 8 мин при 60 ° C.
      5. Аспирационная Оро решения. Затем добавьте 400 мкл 85% пропиленгликоля для каждой скважины и проинкубируйте 5 minumintes на RT.
      6. Вымойте тарелка 3 раза с ddiH2O.
      7. Добавьте 400 мкл раствора Hoechst 33258 в каждой скважине. Инкубируйте 5 мин на RT, защищенном от света.
      8. Мыть тарелки 2 раза с стерильных PBS.
      9. Добавьте 200 мкл фтор гель с трис-буфер для каждой скважины.
      10. Изображение клетки с помощью инвертированным микроскопом способны epi люминесцентные. Оро может отражаться с использованием набора стандартных Техас красный или DsRed фильтр.
      11. Количественно относительные липидов удержания, определяя Оро положительной области в каждом поле изображения и разделить на количество ядер.
      12. Поддерживать пластины для 7 дней при температуре 4 ° C, защищенном от света.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Лечение BMDMs с CFSE надписью миелина мусора должно дать четкие интернализации (рис. 2). В то время как время 3 часа взаимодействия является достаточным для BMDMs фагоцитировать достаточно добавлен миелина мусора для надежного обнаружения вниз по течению, внутриклеточного накопления может наблюдаться с всего лишь 1 час взаимодействия. Однако некоторые миелина мусора могут быть присутствует на поверхности клеток после стирки. Это может быть из-за недостаточной Стиральная или частиц, не полностью учитываются на ранних этапах фагоцитоза.

    В то время как BMDMs можно быстро усвоить миелина мусора, лизосомальных обработки требуется до Оро stainable липидов капельки виде. Для демонстрации, BMDMs были инкубировали с мусором миелина 90 минут, промывают и культивируемых на дополнительное количество времени до фиксации и окраски (рис. 3). Рисунок 4 показывает, что есть задержка между начало лечения и липидный нейтральными внешний вид. Следует также отметить, что липидов удержания не является стабильным во время культуры. BMDMs начинают усваивать накопленный липиды вскоре после формирования капли. Таким образом мы рекомендуем ожидания не более 24 часов между Стиральная далеко не охватил миелина мусора и фиксации.

    Количественная оценка Оро, окрашенных области демонстрирует уровень миелина жирового обмена в BMDMs (рис. 5). После периода 90-минутный взаимодействия клетки были возвращены в инкубации в свежих CMCM. В начале периода Чейз в свежих средних BMDMs метаболизировать фагоцитированы миелина мусора жирового компонента в нейтральных Оро stainable липиды. Устойчивый рост в положительной области Оро является типичным в течение часов после взаимодействия. Однако, после 24 часов BMDMs будет иметь effluxed или метаболизируется значительную часть внутриклеточных липидов.

    Figure 1
    Рисунок 1 : Представитель культур BMDM. Первоначально будет наблюдаться несколько адэрентных клеток. На 3 день удаляются любые non сторонник клетки. День 7 наблюдаются Зрелые макрофаги костного мозга-производные. Масштаб = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 2
    Рисунок 2 : Представитель изображения BMDM миелина мусора фагоцитоза пробирного. Клетки были относиться с 1 мг/мл CFSE, помечены миелина мусора за 1 час до мытья и фиксации с 4% PFA. Интернализированных миелина мусора могут быть визуализированы с помощью стандартных наборов фильтров GFP на epi флуоресцентный Микроскоп способны. Масштаб = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 3
    Рисунок 3 : Диаграмма нефти экспериментальный дизайн красный O (Оро). BMDM лечат с 1 мг/мл миелина мусора (разбавления 1: 100) за 90 минут, после мытья и культуры в свежие среднего до фиксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 4
    Рисунок 4 : Оро окрашивание BMDM после фагоцитоза мусора миелина. После записи с 4% ПФА в указанных точках BMDMs-время окрашивали Оро и Hoechst 33258. Представитель изображения для каждой точки времени отображаются. Масштаб = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 5
    Рисунок 5 : Анализ количественных изображений Оро пятнать. Для количественной оценки Оро окрашивание 3 скважины были образы 20 X с 5 изображений в колодец. Все параметры изображения приобретения были идентичны. Планки погрешностей = SEM. (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Процедуры, описанные здесь используют свежевыделенных сырой ЦНС миелина мусора и первичного костного мозга-производные макрофагов. Чтобы уменьшить расходы животных, мы рекомендуем, чтобы оба мозги и клеток костного мозга быть заготавливаемым от каждой мыши во время жертвоприношения. Два исследователи, работающие вместе можно подготовить обоих одновременно. Кроме того мозг может храниться при температуре-80 ° C в PBS, дополнена антибиотиков до миелина мусора изоляции. Это был наш опыт, что мозг может быть сохранен в этих условиях сроком до 1 месяца без заметных потерь миелина мусора поколения потенциал.

    CFSE используется для обозначения миелина мусора из-за своей простоты использования и флуоресцентными интенсивности. Краска остается закаленном пока сотовой эстераз прилепится группе ацетата на молекулы14. Эстер группа освобожденных succinimidyl затем может реагировать с первичной амидов, привело ковалентных привязанность к клеточных белков14. В то время как CFSE возбудимых с использованием стандартных Зеленый флуоресцентный каналов, есть несколько производных коммерчески доступны с различных спектральных свойств. Таким образом это возможно для разработки аналогичных пробирного фагоцитоза, с использованием нескольких флуоресцентных красителей. Следует также отметить, что потому, что краска легко пересекает мембраны плазмы, она может использоваться для метки apoptotic клетки аналогичным образом как миелина мусора19. Кроме того в то время как наш метод опирается на анализ стандартных изображений, с оптимизацией пользователя, количественная оценка может выполняться с помощью проточной цитометрии или плита высокой пропускной способности системы.

    O красный нефти (также известный как растворитель красный 27 или Судан красный 5B) является жирорастворимых краситель, который широко используется для пятно нейтральные липиды в гистологической образцы. Его глубокий красный пигментация позволяет для визуализации внутриклеточных липидов через светлые области и флуоресцентной микроскопии5,20. С помощью флуоресцентной микроскопии позволяет одноканальный изображений и надежной количественной оценки Оро, окрашенных липидного капель. Хотя метод окрашивания является простой и высокую воспроизводимость, будьте внимательны во время подготовки проб. Важно, что алкоголь или на основе кислоты фиксаторы не использоваться, поскольку они могут растворить внутриклеточных липиды, привело к значительному сокращению интенсивности окрашивания. Кроме того как с любой анализ количественных изображений, нельзя недооценивать важное значение стандартизированной захвата изображения и достаточные объективные выборки. Для учета любого образца auto флуоресценции рекомендуется использовать окрашивания элементы управления. Такое окрашивание элементов управления должны рассматриваться одинаково, но слева незапятнанное с Оро для измерения уровня фона auto-флуоресценции. Несмотря на это наш метод анализа изображений требует меньше оптимизация, чем другие методы количественной оценки липидов, такие как Оро извлечения метода21, которая требует подготовки калибровочной кривой, более склонны к экспериментальной изменчивости и требует разрушение образца. Использование изображений на основе анализа имеет несколько преимуществ над традиционными методами извлечения Оро в том, что он неразрушающего и совместим с иммуноокрашивания21,22 .

    Наконец Хотя описанные довольно прямо вперед, крайне важно использовать правильную технику асептических, поскольку макрофаги Экспресс несколько рецепторов, которые признают, что патоген-связанные молекулярные модели (PAMPS) как эндотоксин липополисахарида (LPS)23. Взаимодействие с бактериального загрязнения будет привести к активации макрофагов и может резко изменить их функции24,25. В отношении собранных миелина мусора рекомендуется тестирование на загрязнение. Методы обнаружения эндотоксинов например lysate пробирного (Лал) limulus амебоцит имеют высокую чувствительность и были использованы ранее для этого приложения5,19.

    Макрофаги играют важную роль в здоровье и болезни, однако роль BMDMs в контексте травмы ЦНС в настоящее время является важной темой исследования. С помощью методов, описанных здесь, исследователи могут начинают лучше понимать механизм миелина мусора фагоцитоза, BMDMs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Авторы имеют не раскрытия.

    Acknowledgments

    Авторы хотели бы поблагодарить Сэнгер Гленн-Ходжсон, специалист по СМИ в БСС колледж медицины для всех его работу в видео, редактирования и голос за кадром.

    Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R01GM100474 и R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Нейробиологии выпуск 130 костного мозга полученных макрофагов фагоцитоз мусора миелина масло красный O Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира травмы спинного мозга нейротравма
    <em>В пробирке</em> Фагоцитоз миелина мусора макрофагами, костного мозга, полученных
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter