Summary
포도 당 부족 유발 SH-SY5Y 상해에 낮은 복용량 대기압 플라즈마 처리의 신경 보호 응용 프로그램에 대 한 프로토콜.
Abstract
대기압 플라즈마 제트 (APPJ)는 자사의 배출량 반응성 질소 종 (RNS) 및 반응성 산소 종 (선생님)의 여러 종류를 포함 하기 때문에 최근 몇 년 동안에서 여러 분야에서 많은 연구자의 주목을 받고 있다. 우리의 이전 연구는 산화 스트레스 유발 부상에 대 한 APPJ의 cytoprotective 효과 보이고 있다. 현재 연구의 목표는 SH-SY5Y 세포에 포도 당 부족 유발 부상에 헬륨 APPJs의 신경 보호 응용 프로그램에 관한 자세한 생체 외에서 치료 프로토콜을 제공 하는입니다. SH SY5Y 인간 신경 파생 셀 라인 보완 15% 태아 종 아리 혈 청 RPMI 1640 매체에 유지 되었다. 문화 매체 APPJ 치료 전에 포도 당 없이 RPMI 1640 다음 변경 되었습니다. 셀 인큐베이터에서 1 h 부 화, 후 세포 생존 능력 셀 계산 키트 8를 사용 하 여 결정 했다. 결과, 보여주었다 포도 당 부족 그룹에 비해, APPJ로 치료 하는 세포 전시 크게 증가 세포 생존 복용량 의존 방식에서 8 s/잘 최적의 복용량으로 관찰. 한편, 헬륨 흐름이 했다 포도 당 부족-유도 된 세포 손상에 영향을 주지 않습니다. 우리의 결과 APPJ 잠재적으로 포도 당 부족에 관련 된 중추 신 경계에에서 질환에 대 한 치료 방법으로 사용 될 수 표시. 이 프로토콜도 사용할 수 cytoprotective 응용 프로그램으로 다른 장애가 있는 다른 셀에 대 한 하지만 세포 배양 및 APPJ 치료 조건을 재조정 해야, 그리고 치료 복용량은 상대적으로 낮은 되어야 합니다.
Introduction
성인 두뇌는 거의 독점적으로 정상적인 생리 적인 조건 하에서 에너지 대사에 대 한 기판으로 포도 당을 사용합니다. 인간의 뇌는 몸 무게의 2%만 하지만 바디1내 총 포도의 약 25%를 소비 한다. 그것은 잘 문서화 되어있다 그 포도 당 대사 장애는 주요 학적 변화 중 허 혈 성 뇌졸중 및 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD) , 헌팅턴의 질병 (HD) 등 다양 한 신경 퇴행 성 질환 2,3. ATP 생산에 직접 영향을 줄 수 및 더 신경 부전, 제안 그 유지 세포 생존 능력의 위험을 증가 시킬 수 있습니다 신경 세포 죽음을 유도 포도 당 및 손상된 포도 당 통풍 관 또는 산화 인 산화의 부족 또는 지연 셀 부상 후 포도 당 부족이이 질병 치료에 대 한 합리적인 접근 될 수 있습니다. 포도 당 변조, 항 염증 제 대리인, 이온 채널 변조기, 자유 래 디 칼 청소부, neurotrophic 요인에 초점을 통해 신경 보호 효과의 조사 등 관심 되었습니다. 그러나, 임상 연습에 벤치에서 이러한 신경 접근의 번역 성공4되지 않았습니다.
대기압 플라즈마 제트 (APPJs)는 최근 몇 년 동안에서 여러 분야에서 많은 연구자의 관심을 끌고있다 대기 저온 가스 방전 기술의 새로운 종류. APPJs 암 세포 치료, 세균 비활성화, 혈액 응고, 상처 치유, 구두 약, 등5,6, 여러 종류의 그것의 방출 때문에 다양 한 생물 의학 응용 프로그램에 수십 년 동안 사용 되었습니다. 반응 질소 종 (RNS) 및 반응성 산소 종 (선생님) (그림 1)의7. 이전 플라즈마 바이오 의학 응용 프로그램은 주로 박테리아, 세포, 조직과8에 산화 그리고/또한 nitrative 스트레스에 집중 했다. 그러나, RNS과 선생님은 많은 생리 적 및 병 태 생리 과정9와 관련 된 중요 한 세포내 신호 분자는 APPJ 또한 "양날의 검" 될 수 있습니다. 질소 산화물 (NO) 생물학 과정의 넓은 범위를 제어 하 고 인체, 특히 중앙 신경 시스템 (CNS)에 이중 역할을 한다. 낮은 레벨의 그들의 신경 활동 모두 나타났습니다 생체 외에서 그리고 vivo에서 여러 신호 경로10통해. 우리의 이전 연구는 그 헬륨에 처음 보고 된 APPJ 유도 아니 생산 산화 스트레스 유발 부상11에 대 한 APPJ의 신경 보호 효과에 참여 했다. 그러나, 다른 상해에 APPJs의 효과 되지 보고 되었습니다. 따라서, 현재 연구의 목표 SH SY5Y 세포에 포도 당 부족 유발 부상에는 체 외에서 치료 프로토콜 헬륨 APPJ의 신경 보호 응용 프로그램에 대 한 제공 하는 것입니다. 이전 연구에서 다른, 우리의 프로토콜 부상의 과도 한 플라즈마 유도, APPJ 치료 잠재적으로 소설 "기증자 약으로 사용 될 수를 나타내는 결과 없이 신경 보호 응용 프로그램에 대 한 낮은 복용량 플라즈마 처리를 사용 "미래 연구 및 임상 번역에도. 이 프로토콜은 또한 다른 장애가 있는 다른 세포 유형 대 한 cytoprotective 응용 프로그램으로 사용할 수 제안 하지만 APPJ 치료 조건 다시 조정 해야 하며 치료 복용량 상대적으로 낮은 되어야 합니다.
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Protocol
1. APPJ 장치의 준비
주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 증기 두건 및 개인 보호 장비 (보호 안경, 보호 장갑, 랩 코트, 등)의 사용을 포함 하 여 모든 실험을 수행할 때 적절 한 안전 관행을 사용 하십시오. 프로토콜 처리 기술 (살 균, 세포 복구, 셀 뿌리고, 세포 동결, 셀 얼룩, 등) 표준 셀 필요.
- 1 m m 내부 직경 석 영 튜브를 선택 하 고 외부 직경 3 m m.의 부드러운 연마 호 일을 사용 하 여 양 끝 횡단면.
- 1.0 m m의 직경을 가진 니켈 도금된 스테인리스 바늘을 사용 하 여 고전압 전극으로. 0.05 m m의 곡률 반경에 팁을 갈기.
- 포장 알루미늄 호 일 (폭에서 2 m m) 주위에 1 cm에서 석 영 튜브 석 영 튜브에서 노즐. 알루미늄 호 일의 다른 쪽 끝에서 1 cm에서 스테인리스 스틸 바늘 포인트를 수정. 알루미늄 포 일 반지를 사용 하 여 낮은 전압 전극으로.
2. 제트기의 수집
- 는 AC 신호를 제공 하는 기능 신호 발생기 전원 공급 장치는 고압 전력 증폭기 연결. 높은 전압 전극에 인가 전압의 파형을 기록, 디지털 오실로스코프에 고전압 프로브의 한쪽 끝을 연결 하 고 전원 공급 장치를 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 회로 보호 하려면 2 k Ω 보호 저항으로 저항. 그림 2와 같이 회로 연결.
주의: 높은 전압 라인을 만지지 마십시오. - 지속적으로 석 영 튜브를 통해 헬륨 (볼륨 분수, 99.999%)을 통과 하 고 안정적인 1.4 표준 리터 당 분 (SLM)에서 가스 유량 제어.
참고: 우리가 사용 하지 마십시오 필터 셀 문화를 치료 하기 전에. 실험에 사용 하는 헬륨의 볼륨 분수 99.999% 이며 대부분 미생물이이 조건 하에서 살 수 없다. - 는 오실로스코프, 신호 발생기, 고압 전력 증폭기의 전원을 켭니다. 5 kHz에 주파수 조절 손잡이 회전 합니다. 점차적으로 증가 6의 피크-피크 값 전압 kV.
참고: 제트기는 충분히 (약 3cm) 때 바늘에 적용 하는 전압의 피크-피크 값은 약 6 kV.
3. SH SY5Y 세포의 준비
- RPMI 1640에서 25 cm 2 플라스 크에 성장 SH-SY5Y 인간 신경 파생 셀 라인 매체 15% 태아 종 아리 혈 청 (FBS)와 보충. 포함 된 37에서 5% CO 2와 95% 공기 습도 인큐베이터에 셀 유지 ° c.
- 때 셀 85% 합류에 도달, 신중 하 게 문화 미디어를 발음 하 고 셀에 1 mL 0.25 %trypsin + 0.1 %EDTA 추가.
- 후 15의 보육 실내 온도에, 신중 하 게는 트립 신을 발음 하 고 추가 2 mL 15% 포함 된 RPMI 1640 무력화 FBS.
- 부드럽게 아래로, 플라스틱 SH SY5Y 단층 완전히 분리 될 때까지, 우물의 바닥 세척.
- 는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 RPMI 1640 중간 + 15를 추가 하 여 2 x 10 5 셀/mL로 세포 농도 조정 %FBS, 그리고 96 잘 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 전송 100 µ L.
- APPJ 치료 전에 셀 인큐베이터에 12 h에 대 한 연결을 세포 허용.
4. SH-SY5Y의 APPJ 치료
- 조정 석 영의 노즐 사이의 거리 튜브와 96 잘 접시 배치 될 위치에 3 cm. 플랫폼 빔 문화 매체의 표면을 만질 수 있는 보장.
참고: 거리는 플레이트의 하단에서 측정 하지 됩니다. 그것은 먼저 석 영 튜브의 노즐 및 96 잘 접시를 사용 하는 플랫폼 간의 3 cm 조정. - APPJ 치료 하기 전에 변경 제어 웰 스 제외 하 고 각 잘 배양 RPMI 1640 포도 당 매체 없이.
- APPJ 노즐 아래 접시 놓고 제트기 각 우물에 수직으로 쏠 수 있다 확인 하십시오.
- 0 APPJ와 함께 별도 우물에서 치료 세포 s, 1의 2 s, 4 s, 8, 및 12 s.
참고: APPJ ( 그림 1) 헬륨 이온화에 의해 생성 됩니다. 4 세포 포도 당 부족으로 부상 처리 됩니다 셀에 헬륨의 영향을 제거 하는 8 s 헬륨 흐름과 s. 모든 치료는 3 중에서 수행 되어야 합니다.
5. 세포 생존 능력 분석 결과
참고:이 단계에서 매체를 변경 하지 마십시오.
- APPJ 치료 후 세포 배양 기에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어.
- 각 잘 셀 계산 키트-8 (CCK-8) 솔루션의 추가 10 µ L.
- 품 어 4 h. 위해 37 ° C에서 셀
참고: SH-SY5Y 셀 라인은 포도 당 부족 조건 12에 민감합니다. 세포 생존 능력은 pharmacodynamics 연구에 대 한 최적의 세포 생존 조건이 1 시간 포도 당 부족 후 거의 50% 감소 합니다. CCK-8 셀에 아무 세포 독성 있으며 셀은 APPJ 치료 세포 생존 능력을 확인 후 CCK-8 시 포도 당 부족 조건에서 다른 4 h와 인 큐베이 팅. 8 h 포도 당 부족 APPJ 처리 후에, APPJ의 보호 효과 때문에 포도 당 부족의 긴 기간 SH SY5Y 세포의 심한 손상을 주도 크게 감소 되었다. 24 시간 포도 당 부족 11 후 살아있는 세포의 증거가 없었다. - 450에서 흡 광도 측정 microplate 리더 nm.
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Representative Results
데이터는 적어도 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표현 됩니다. 그룹 결과 ANOVA를 사용 하 여 분산에 대 한 분석 했다. 모든 분석은 통계 분석 소프트웨어 프리즘 및 p를 사용 하 여 수행 했다 < 0.05 통계적 의미에 대 한 임계값을 했다.
세포 생존 능력은 CCK-8 보육의 4 h 후 측정 했다. 그림 3에서 보듯이, 포도 당 부족 통제 그룹에 비해 44.1 ± 2.6%에 SH-SY5Y 세포의 생존 감소 (일반적으로 15% 포함 된 RPMI 1640 매체에 경작 하는 세포 FBS). APPJ 치료는 크게 8 s, 잘의 최적 복용량에 복용량 의존 방식에서 세포 생존 능력을 증가 하 고 세포 생존 능력 도달 62.27 ± 3.1%. 가스 흐름이 했다 포도 당 부족-유도 된 세포 손상 (표 1)에 영향을 주지 않습니다.
그림 1: APPJ 방출에서 전형적인 RNS와 ROS 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 실험적인 체제의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: SH-SY5Y 세포의 포도 당 부족 유발 부상에 APPJ의 보호 효과. 셀은 APPJ로 치료 되었고 대상이 1 h, 포도 당 부족 후 세포 생존 능력 CCK-8 분석 결과 사용 하 여 결정 했다. 오차 막대를 나타내는 평균 ± sd. * * * P < 0.001 제어; 대 #P < 0.05와 ##P < 0.01 포도 당 부족 그룹 대 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 그룹 | 세포 생존 능력 (제어 %) | |||
| 제어 | 100 ± 3.7% | |||
| 포도 당 부족 | 44.1 ± 2.6% * * * | |||
| APPJ 치료 + 포도 당 부족 | 1 s | 49.3 ± 2.8% | ||
| 2 s | 53.0 ± 2.7% | |||
| 4 s | 60.4 ± 2.3%# | |||
| 8 s | 62.3 ± 3.1%# | |||
| 12 s | 51.3 ± 2.7% | |||
| 그 흐름 + 포도 당 부족 | 4 s | 45.4 ± 2.4% | ||
| 8 s | 44.1 ± 3.1% | |||
표 1: SH-SY5Y의 백분율 생존 데이터 세포 포도 당 부족 또는 APPJ 치료 없이 후. P < 0.001 제어; 대 #P < 0.05와 ##P < 0.01 포도 당 부족 그룹 대 (n = 3).
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Discussion
SH SY5Y 세포는 인간의 신경 파생 셀 라인 고 neurotoxicity 또는 neuroprotection12에 생체 외에서 연구에 대 한 적절 한 셀 모델로 서 널리 이용 된다. SH SY5Y 셀 라인 포도 당 부족 조건에 민감 했다. 세포 생존 능력은 pharmacodynamics의 연구에 대 한 최적의 세포 생존 조건이 1 시간 포도 당 부족 후 거의 50% 감소. 또한, CCK-8 시 약은 아무 세포 독성 세포 및 셀 APPJ 치료 세포 생존 능력을 확인 후 포도 당 부족 조건에서 다른 4 h CCK-8 시와 incubated 했다. 현재 연구에서 우리 SH SY5Y 세포의 포도 당 부족 유발 부상에 APPJ의 신경 보호 응용 프로그램에 관한 자세한 생체 외에서 치료 프로토콜을 제공합니다.
수정 및 문제 해결
CCK-8 부 화 시간이 짧은 각 색 잘 크게 변경 하는 경우 수 있습니다. 그러나 SH SY5Y 셀 밀도 잘 당 1 x 104 의 세포가 하 있는 경우에, 세포 포도 당 부족 및 APPJ 처리 후 죽은 것 이다. 그것은 또한 플라즈마 빔 문화 매체의 표면에 터치 수 하면서 가스 흐름 율을 줄이기 위해 권장 됩니다. 있으 나 APPJ 다른 신경 관련된 셀 라인 (HT-22, 신경-2A, 또는 주 뉴런) (산소, 산화 스트레스, 등), 다른 장애가 있는 사용자에 대 한 cytoprotective 대리인으로 또한 사용 될 수 있지만 세포 배양 및 APPJ 치료 조건 이어야 한다 재조정, 치료 복용량은 상대적으로 낮은 되어야 합니다. 우리이 APPJ 세대 매개 변수에서 거리를 줄이기 위해 노력 하 고 우리는 플라즈마 제트 셀 부상 (SH SY5Y 셀 쉽게 그들의 부착 상태에서 분리 했다) 귀 착될 수 있는 SH SY5Y 세포의 부착에 영향을 직접 수 발견. 우리는 치료 거리는 셀 특성 및 플라즈마 제트 치료에 허용 오차에 따라 결정 되어야 믿습니다.
기술의 한계
현재 프로토콜 생체 외에서 신경 보호 효과에 APPJ의 포도 당 부족 부상 SH SY5Y 세포에만 집중 했다. 이전 연구는 플라즈마의 그 흡입을 보여주었다 쥐 심근 경색 모델13심장 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 더 많은 작업은 여전히 뇌 보호에 대 한 vivo에서 치료 방법을 조사 필요 합니다.
기존의 방법에 관하여 의미
플라즈마 의학에 대 한 이전 연구 APPJ 치료14에 의해 유도 된 산화 그리고/또한 nitrative 스트레스 때문에 세균, 암 세포와 조직에서 비활성화 용량에 더 많은 관심을 지불. APPJ 치료 잠재적으로 사용 될 수는 소설 "기증자 약" 미래 연구에 대 한 고도 과도 한 플라즈마 유도 상해의 결과 없이 신경 보호 응용 프로그램에 대 한 낮은 복용량 플라즈마 처리를 사용 하는 우리의 프로토콜 임상 번역 하십시오.
프로토콜 내에서 중요 한 단계
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계가입니다 APPJ 치료 복용량은 APPJ와 치료를 통해 이후 상대적으로 낮은 되도록 셀 부상 악화 되며 직접 세포 죽음을 유도. 포도 당 부족 기간을 제어 하는 또 다른 중요 한 단계 또는 셀 죽을 것 이다 그리고 APPJ의 cytoprotective 효과 크게 줄어들 것입니다. 순수한 헬륨, 헬륨 O2 또는 공기의 작은 양의 혼합 보다는 사용 되었다. O2 또는 공기의 작은 양의 혼합 헬륨을 사용 하는 경우는 플라즈마에서 선생님의 양을 증가할 것 이다. 그것은 매우 복잡 한 플라즈마 화학 반응이 발생 하는 경우 진단 하 게 어렵다입니다.
미래의 응용 프로그램
그것은 또한 APPJ 처리 APPJ 잠재적으로 중앙 신경 조직에서 포도 당 부족 관련 질병에 대 한 치료 방법으로 사용 될 수를 나타내는 SH SY5Y 세포에 포도 당 부족의 유도 후 적용은 가치가 특히 허 혈 성 선입니다. 따라서, 그것은 혼자와 포도 당 부족 후 다른 기간에 다른 신경 에이전트와 함께에서 APPJ의 신경 보호 효과의 처리 상태를 평가 하는 미래 연구에 대 한 필요.
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Disclosures
이 문서에 관하여 관심 없음 충돌 선언 했다.
Acknowledgments
이 작품은 베이징 신경외과 학회 (2014-11), 중국 (No. 11475019와 81271286)의 국가 자연과학 기초 및 베이징 자연 과학 재단 (No. 7152027)의 혁신 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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