Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

Ny tillämpning av ett atmosfäriskt tryck Plasma Jet som neuroskyddande Agent mot glukos Deprivation-inducerad skada av SH-SY5Y celler

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/56323
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för neuroprotektiva tillämpningen av låg dos atmosfärstryck plasmabehandling på glukos deprivation-inducerad SH-SY5Y skador.

Abstract

Atmosfäriskt tryck plasma jet (APPJ) har uppmärksammats av många forskare från flera discipliner under de senaste åren eftersom dess utsläpp omfattar flera typer av reaktiva kväve arter (RNS) och reaktiva syreradikaler (ROS). Vår tidigare studie visat cytoprotektiva effekten av APPJ mot oxidativ stress-inducerade skador. Syftet med föreliggande studie är att ge en detaljerad i vitro behandlingsprotokoll angående nervskyddande tillämpningar av helium APPJs på glukos deprivation-inducerad skada i SH-SY5Y celler. SH-SY5Y mänsklig neuroblastom-derived cell linjen bibehölls i RPMI 1640 medium kompletteras med 15% fetalt kalvserum. Odlingssubstratet bytte sedan till RPMI 1640 utan glukos före APPJ behandling. Efter en 1 h inkubation i en cell inkubator bestämdes cellernas viabilitet med Cell räknar Kit 8. Resultaten visade att, jämfört med gruppen glukos deprivation, celler behandlas med APPJ uppvisade signifikant ökad cellviabilitet på ett dosberoende sätt, med 8 s per brunn observerats som en optimal dos. Under tiden hade helium flöde ingen effekt på glukos deprivation-inducerad cell nedskrivning. Våra resultat visade att APPJ potentiellt skulle kunna användas som en behandlingsmetod för sjukdomar i centrala nervsystemet relaterade till glukos deprivation. Detta protokoll kan också användas som ett cytoprotektiva program för andra celler med olika funktionsnedsättningar, men de cellkultur och APPJ behandling villkor bör justeras dosen måste vara relativt låg.

Introduction

Den vuxna hjärnan använder nästan uteslutande glukos som substrat för energiomsättning under normala fysiologiska förhållanden. Den mänskliga hjärnan utgör endast 2% av kroppsvikt men förbrukar cirka 25% av den totala glukosen i kroppen1. Det är väl dokumenterat att glukos metabolism dysfunktion är en av de stora patologiska förändringarna under ischemisk stroke och olika neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom (AD), Huntingtons sjukdom (HD) och Parkinsons sjukdom (PD) 2,3. Avsaknaden av glukos och nedsatt glukosupptag eller oxidativ fosforylering kan direkt påverka ATP produktionen och ytterligare framkalla neurala celldöd, vilket kan öka risken för neuronal dysfunktion, vilket tyder på att underhålla cellernas viabilitet eller att senarelägga cell skada efter glukos deprivation kan vara en rimlig strategi för behandling av dessa sjukdomar. Utredningen av neuroprotektiva effekter via glukos modulering, med fokus på antiinflammatoriska medel, ion kanal modulatorer, fri radikal renhållare, neurotrofiska faktorer, etc. har varit av intresse. Översättning av dessa neuroprotektiva strategier från bänk klinisk praxis har dock inte varit framgångsrik4.

Atmosfäriskt tryck plasma jets (APPJs) är en ny typ av atmosfäriska låg temperatur gas utsläpp teknik som på senare år har uppmärksammats av många forskare från flera discipliner. APPJs har använts i årtionden i olika biomedicinska applikationer såsom cell cancerbehandling, bakteriell inaktivering, koagulation, sårläkning, oral medicin, etc.5,6, på grund av dess utsläpp av flera typer reaktivt kväve arter (RNS) och reaktiva syreradikaler (ROS) (figur 1)7. Tidigare plasma biomedicin ansökningar inriktades främst på oxidativ och/eller nitrative stress på bakterier, celler och vävnader8. Men kan APPJ också vara ett ”tveeggat svärd” eftersom RNS och ROS är viktigt intracellulära signalmolekyler som besläktade med många fysiologiska och patofysiologiska processer9. Lustgas (NO) styr en rad biologiska processer och spelar en dubbel roll i den mänskliga kroppen, särskilt i centrala nervsystemet (CNS). Låga nivåer av nr har visat sin nervskyddande verksamhet både in vitro- och in-vivo via flera signal vägar10. Vår tidigare studie först rapporterades att helium APPJ-inducerad ingen produktion var inblandad i den neuroprotektiva effekten av APPJ mot oxidativ stress-inducerade skador11. Effekterna av APPJs på andra skador har dock inte rapporterats. Syftet med föreliggande studie är därför att ge ett in vitro- behandlingsprotokoll angående nervskyddande tillämpningar av helium APPJ på glukos deprivation-inducerad skada i SH-SY5Y celler. Skiljer sig från tidigare studier, våra protokoll används låg dos plasmabehandling för neuroprotektiva program utan konsekvenserna av överdriven plasma-inducerade skador, vilket indikerar att APPJ behandling potentiellt skulle kunna användas som en roman ”ingen givare drog ”för framtida forskning och även för kliniska översättning. Detta protokoll föreslogs också för att användas som en cytoprotektiva ansökan för andra celltyper med olika funktionsnedsättningar, men de APPJ behandling villkor bör justeras och dosen måste vara relativt låg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av enhetens APPJ

försiktighet: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd lämpliga säkerhetsrutiner när du utför alla de experiment, inklusive användning av en spiskåpa och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, skyddshandskar, laboratorierock, etc.). Protokollet kräver standard cellen hantering tekniker (sterilisering, cell återhämtning, cell passaging, cell frysning, cell färgning, etc.).

  1. Välj en kvarts röret med en inre diameter av 1 mm och en yttre diameter av 3 mm. slät ottomotorer i båda ändar med hjälp av en polering folie.
  2. Använda en förnicklad nål i rostfritt stål med en diameter på 1,0 mm som högspänning elektroden. Slipa sina tips till en radie på 0,05 mm.
  3. Wrap aluminiumfolie (2 mm i bredd) runt kvarts röret på 1 cm från kvarts röret munstycke. Fixa den rostfria nål punkten på 1 cm från den andra änden av aluminiumfolie. Använder aluminiumfolie ringen som lågspänning elektroden.

2. Förvärv av Jets

  1. ge en AC-signal, ansluta högspännings-effektförstärkaren till den funktion signalgenerator som fungerar som en strömförsörjning. För att registrera vågformer av spänningen till högspänning elektroden, Anslut ena änden av högspännings-sonden till digitala oscilloskopet och Anslut den andra ändan till strömförsörjningen. För att skydda kretsen, använder en 2 k Ω motstånd som en skyddsmotståndet. Anslut kretsen som visas i figur 2.
    Varning: Vidrör inte högspänningsledningar.
  2. Kontinuerligt passera helium (volymfraktion, 99,999%) över kvarts röret och styra gasflödet vid en stabil 1.4 Standard Liter per minut (SLM).
    Obs: Vi använder inte ett filter innan behandling av cellkulturer. Volymfraktionen av helium används i experimentet är 99,999%, och de flesta mikroorganismer inte kan leva under dessa förhållanden.
  3. Slå på strömmen av oscilloskop, signalgenerator och högspännings-effektförstärkare. Vrid justerskruven frekvens till 5 kHz. Gradvis öka spänningen till en peak-to-peak värde av 6 kV.
    Obs: Jet är tillräckligt lång (ca 3 cm) när peak-to-peak värdet av spänning tillämpas i nålen är cirka 6 kV.

3. Beredning av SH-SY5Y celler

  1. växa i SH-SY5Y mänsklig neuroblastom-derived cell linje i en 25 cm 2 kolv RPMI 1640 medium kompletteras med 15% fetalt kalvserum (FBS). Upprätthålla cellerna i en fuktad inkubator som innehåller 5% CO 2 och 95% luft vid 37 ° C.
  2. När cellerna nå 85% sammanflödet, noggrant aspirera kultur media och tillsätt 1 mL 0,25% trypsin + 0,1% EDTA till cellerna.
  3. Efter 15 s inkubation vid rumstemperatur, noggrant aspirera på trypsin och tillsätt 2 mL RPMI 1640 som innehåller 15% FBS att neutralisera.
  4. Försiktigt Pipettera upp och ner, tvätta botten av brunnen, tills den SH-SY5Y enskiktslager är helt fristående.
  5. Räkna cellerna med hjälp av hemocytometer och justera cellkoncentrationen till 2 x 10 5 celler/mL genom att lägga till RPMI 1640 medium + 15% FBS, och sedan överföra 100 µL cellsuspension till varje brunn en plattan med 96 brunnar.
  6. Tillåta cellerna att bifoga för 12 h i en cell inkubator före behandlingen med APPJ.

4. APPJ behandling av SH-SY5Y

  1. Justera avståndet mellan munstycket av kvartarna tube och plattformen där plattan med 96 brunnar ska placeras till 3 cm. se till att balken kan röra vid ytan på odlingsmediet.
    Obs: Mäts inte avståndet från botten av plattan. Det justeras först till 3 cm mellan munstycket på kvarts röret och den plattform som används för att placera plattan med 96 brunnar.
  2. Före APPJ behandling, ändra odlingssubstratet i varje brunn utom kontrollbrunnarna RPMI 1640 utan glukos medium.
  3. Placera plattan under APPJ munstycket och säkerställa att jets kan skjuta vertikalt i varje brunn.
  4. Behandla celler i separata brunnar med APPJ för 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s, och 12 s.
    Obs: APPJ genereras av joniserande helium ( figur 1). Celler skadas av glukos deprivation behandlas av 4 s och 8 s helium flöde att eliminera effekterna av helium på celler. Alla behandlingar ska utföras i tre exemplar.

5. Cell livskraft Assay

Obs: Ändra inte mediet i detta steg.

  1. Efter APPJ behandling, inkubera cellerna för 1 h i en cell inkubator.
  2. Lägg till 10 µL av Cell räknar Kit-8 (CCK-8) lösning till varje brunn.
  3. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 4 h.
    Obs: SH-SY5Y cell linjen är känslig för glukos deprivation villkor 12. Cellernas viabilitet minskar till nästan 50% efter 1 h glukos deprivation, vilket är den optimala cell livskraft för farmakodynamiska studier. CCK-8 har ingen cytotoxicitet för celler och cellerna inkuberas med CCK-8 reagens för en annan 4 h i glukos deprivation villkoren efter APPJ behandling för att kontrollera livskraft cancercell. Den skyddande effekten av APPJ minskade avsevärt efter 8 h glukos deprivation och APPJ behandling, eftersom lång-varaktigheten av glukos deprivation ledde till svår skada av SH-SY5Y cellerna. Det fanns inga tecken på levande celler efter 24 h glukos deprivation 11.
  4. Mät absorbansen vid 450 nm med en microplate reader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uppgifter uttrycks som den medelvärde ± SD minst tre oberoende experiment. Koncernens resultat analyserades för variansen med ANOVA. Alla analyser utfördes med hjälp av statistisk analysprogramvara Prism och p < 0,05 var gränsen för statistisk signifikans.

Cellernas viabilitet mättes efter 4 h CCK-8 inkubation. I figur 3visas glukos deprivation minskar lönsamheten för SH-SY5Y celler till 44,1 ± 2,6% jämfört med kontrollgruppen (celler som normalt odlade i RPMI 1640 medium som innehåller 15% FBS). APPJ behandling ökade betydligt cellviabilitet på ett dosberoende sätt på en optimal dos av 8 s per brunn, och cellviabiliteten nådde till 62.27 ± 3,1%. Gasflödet hade ingen effekt på glukos deprivation-inducerad cell nedskrivning (tabell 1).

Figure 1
Figur 1: typiska RNS och ROS reaktioner i APPJ utsläpp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk av experimentella installationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: skyddande effekt av APPJ på glukos deprivation-inducerad skada av SH-SY5Y celler. Celler behandlades med APPJ och utsätts för glukos deprivation för 1 h, varefter cellviabiliteten bestämdes med CCK-8 analys. Felstaplar representera medelvärde ± SD. *** P < 0,001 kontra kontroll; #P < 0,05 och ##P < 0,01 jämfört med glukos deprivation (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Grupper Cellernas viabilitet (kontroll %)
Kontroll 100 ± 3,7%
Glukos deprivation 44,1 ± 2.6% ***
APPJ behandling + glukos deprivation 1 s 49.3 ± 2,8%
2 s 53,0 ± 2,7%
4 s 60,4 ± 2,3%#
8 s 62,3 ± 3,1%#
12 s 51,3 ± 2,7%
Han flöde + glukos deprivation 4 s 45,4 ± 2,4%
8 s 44,1 ± 3,1%

Tabell 1: procent livskraft data av SH-SY5Y cellerna efter glukos deprivation med eller utan APPJ behandling. P < 0,001 kontra kontroll; #P < 0,05 och ##P < 0,01 jämfört med glukos deprivation (n = 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SH-SY5Y celler är en human neuroblastom-derived cellinje och används allmänt som en cell lämplig modell för in vitro- studier på neurotoxicitet eller neuroprotektion12. SH-SY5Y cell fodra var känslig för glukos deprivation förhållanden. Cellernas viabilitet minskade till nästan 50% efter 1 h glukos deprivation, vilket är den optimala cell livskraft för studier av farmakodynamik. Dessutom CCK-8 reagens har ingen cytotoxicitet för celler och celler inkuberades med CCK-8 reagens för en annan 4 h i glukos deprivation villkoren efter APPJ behandling för att kontrollera livskraft cancercell. I den aktuella studien ger vi en detaljerad i vitro behandlingsprotokoll angående nervskyddande tillämpningar av APPJ på den glukos deprivation-inducerad skadan av SH-SY5Y celler.

Modifieringar och felsökning
CCK-8 inkubationstiden kan vara kortare om färg i varje väl väsentligt förändrats. Men om SH-SY5Y cell densiteten är lägre än 1 x 104 celler per brunn, celler kommer vara död efter glukos deprivation och APPJ behandling. Det rekommenderas också att minska gasflödet, samtidigt att plasma balken kan röra vid ytan av odlingssubstratet. APPJ kan också användas som en cytoprotektiva medel för andra neuronala relaterade cellinjer (HT-22, neuro-2A eller ens primära nervceller) med olika funktionsnedsättningar (hypoxi, oxidativ stress, etc.), men de cellkultur och APPJ behandling villkor bör justeras, och dosen måste vara relativt låg. Vi har försökt att minska avståndet i denna APPJ generation parameter, och vi hittade att plasma jet direkt kan påverka fastsättning av SH-SY5Y celler vilket kan resultera i cell skador (SH-SY5Y celler var enkelt fristående från deras vidhäftande tillstånd). Vi anser att behandling avståndet bör baseras på egenskaperna som cellen och toleransen till jet plasmabehandling.

Begränsningar av tekniken
Det nuvarande protokollet bara fokuserat på in vitro- neuroprotektiva effekten av APPJ på glukos deprivation-skadade SH-SY5Y celler. Tidigare forskning har visat att inandning av plasma kunde förbättra hjärtfunktionen i en råtta hjärtinfarkt modell13. Mer arbete krävs fortfarande att undersöka behandlingsmetoden i vivo för hjärnan skydd.

Betydelse med avseende på befintliga metoder
Tidigare forskning om plasma läkemedel betalas mer uppmärksamhet till inaktivering kapacitet i bakterier, celler och vävnader på grund av den oxidativa eller nitrative stress induceras av APPJ behandling14. Våra protokoll används låg dos plasmabehandling för neuroprotektiva program utan konsekvenserna av överdriven plasma-inducerade skador, vilket indikerar att APPJ behandling kan potentiellt användas som en roman ”ingen givare drog” för framtida forskning och även för kliniska översättning.

Kritiska steg i protokollet
Det mest kritiska steget i detta protokoll är att se till att den APPJ behandlingsdosen är relativt låg, sedan över behandling med APPJ kommer att förvärra cell skador och direkt inducera celldöd. Ett annat viktigt steg är att kontrollera glukos deprivation varaktighet eller cellerna dör och cytoprotektiva effekten av APPJ kommer att minska avsevärt. Rent helium, användes snarare än helium blandas med en liten mängd O2 eller luft. När helium blandas med en liten mängd O2 eller luft används, ökar mängden ROS i plasma. Det är mycket svårt att göra en diagnos när komplicerade plasma kemiska reaktioner uppstår.

Framtida tillämpningar
Det är också värt att notera att APPJ behandling tillämpades efter induktion av glukos deprivation på SH-SY5Y celler, vilket indikerar att APPJ potentiellt skulle kunna användas som en behandlingsmetod för glukos deprivation-relaterade sjukdomar i centrala nervsystemet, särskilt ischemisk stroke. Det är därför nödvändigt för framtida studier för att utvärdera behandling villkoren för neuroprotektiva effekten av APPJ både ensamt och i kombination med andra nervskyddande agenter under olika perioder efter glukos deprivation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter förklarades i förhållande till denna uppsats.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av innovationsfonden Beijing Neurokirurgiska Institute (2014-11), National Natural Science Foundation Kina (nr 11475019 och 81271286) och Beijing naturvetenskap Foundation (nr 7152027).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line China Center for Type Culture Collection 3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medium Thermo Scientific 21875091 stored at 4 °C
RPMI 1640 medium no glucose Thermo Scientific 11879020 stored at 4 °C
fetal calf serum Thermo Scientific 16000044 stored at -20 °C
tripsin-EDTA solution Solarbio T1300 stored at 4 °C
96 wells plate corning 3599
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Dojindo Laboratories CK04 stored at 4 °C
microplate reader Tecan M200 Pro for measuring the absorbance at 450 nm
High – voltage Power Amplifier Trek PD06087 for amplifing the power
Function Signal Generator MaZe Electronics Science&Technology AT30120 for providing the specific signal
High – Voltage Probe Tektronix P6015A for detecting high voltage
Digital Oscilloscope Tektronix DPO4104B for displaying the signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
  2. Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
  3. Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
  4. Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
  5. Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339 (2015).
  6. Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005 (2012).
  7. Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
  8. Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
  9. Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049 (2016).
  10. Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
  11. Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401 (2017).
  12. Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  13. Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309 (2014).
  14. Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).

Tags

Ingenjörsvetenskap låg fråga 128 atmosfäriskt tryck plasma jet dos neuroprotektion glukos deprivation cell skador SH-SY5Y celler
Ny tillämpning av ett atmosfäriskt tryck Plasma Jet som neuroskyddande Agent mot glukos Deprivation-inducerad skada av SH-SY5Y celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, X., Meng, Z., Ouyang, J., Qiao, More

Yan, X., Meng, Z., Ouyang, J., Qiao, Y., Yuan, F. New Application of an Atmospheric Pressure Plasma Jet as a Neuro-protective Agent Against Glucose Deprivation-induced Injury of SH-SY5Y Cells. J. Vis. Exp. (128), e56323, doi:10.3791/56323 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter