Summary
小剂量大气压等离子体治疗糖剥夺性 SH-SY5Y 损伤的神经保护应用协议
Abstract
大气压力等离子体射流 (APPJ) 近年来引起了许多研究人员的关注, 因为它的排放包括多种类型的活性氮 (RNS) 和活性氧物种 (ROS)。我们先前的研究表明 APPJ 对氧化应激损伤的细胞作用。本研究的目的是提供一个详细的体外治疗方案, 关于神经保护应用的氦 APPJs 对葡萄糖剥夺诱导损伤 SH-SY5Y 细胞。SH-SY5Y 的人神经母细胞瘤的干细胞系维持在 RPMI 1640 培养基补充15% 胎小牛血清。在 APPJ 治疗前, 培养基被转化为 RPMI 1640, 无葡萄糖。在一个细胞培养器 1 h 孵化后, 细胞活力是确定使用细胞计数套件8。结果表明, 与葡萄糖剥夺组相比, APPJ 治疗的细胞表现出明显增加的细胞活力, 以剂量依赖性的方式, 8 s/良好观察作为最佳剂量。同时, 氦流动对葡萄糖剥夺诱导的细胞损伤无影响。我们的研究结果表明, APPJ 可能被用作治疗中枢神经系统中与葡萄糖缺乏相关的疾病的一种方法。本协议也可作为其他不同损伤细胞的细胞应用, 但细胞培养和 APPJ 处理条件应重新调整, 治疗剂量必须相对较低。
Introduction
在正常的生理条件下, 成年大脑几乎完全使用葡萄糖作为能量代谢的基质。人脑只占身体重量的 2%, 但在身体的总葡萄糖中消耗了大约25% 的1。众所周知, 葡萄糖代谢失调是缺血性中风和各种神经退行性疾病 (包括阿尔茨海默氏病 (AD)、亨廷顿氏病 (HD) 和帕金森病 (PD) 的主要病理变化之一2,3。葡萄糖的缺乏和糖的摄取受损或氧化磷酸化可以直接影响 ATP 的生产, 并进一步诱发神经细胞死亡, 这可能会增加神经元功能障碍的风险, 这表明维持细胞活力或延缓葡萄糖剥夺后的细胞损伤可能是治疗这些疾病的合理方法。通过葡萄糖调制对神经保护作用的研究, 着重于抗炎剂、离子通道调制器、自由基清道夫、神经营养因子、等。然而, 这些神经保护方法的翻译从长凳到临床实践没有成功4。
常压等离子体射流 (APPJs) 是一种新型的大气低温气体放电技术, 近年来引起了众多学科研究者的关注。APPJs 已用于几十年的各种生物医学应用, 如癌症细胞治疗, 细菌灭活, 凝血, 伤口愈合, 口服药物,等5,6, 由于其多种类型的排放活性氮种类 (RNS) 和活性氧 (ROS) (图 1)7。以前的等离子体生物医学应用主要集中在细菌、细胞和组织的氧化和/或 nitrative 压力上8。然而, APPJ 也可能是一把 "双刃剑", 因为 RNS 和 ROS 是重要的细胞内信号分子与许多生理学和病理生理学过程9。一氧化二氮 (no) 控制着广泛的生物过程, 在人体, 特别是中枢神经系统中扮演着双重角色。低水平的 NO 已经显示了他们的神经保护活动的体外和在体内通过多个信号通路10。我们先前的研究首次报告, 氦 APPJ 诱导 NO 的产生参与了 APPJ 抗氧化应激损伤的神经保护作用11。然而, 未报告 APPJs 对其他损伤的影响。因此, 本研究的目的是提供一个体外治疗方案, 关于氦 APPJ 在葡萄糖剥夺诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤中的应用。与以往的研究不同, 我们的协议使用低剂量等离子治疗的神经保护应用, 而不会造成过多的血浆损伤, 表明 APPJ 治疗可能被用作一种新型的 "无供药物"为将来的研究, 甚至临床翻译。本协议也被建议作为细胞应用的其他细胞类型有不同的损伤, 但 APPJ 治疗条件应调整和治疗剂量必须相对较低。
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Protocol
1. APPJ 设备的准备
警告: 请在使用前查阅所有相关的材料安全数据表 (MSDS)。在执行所有的和 #160 时, 请使用适当的安全做法; 实验, 包括使用通风罩和个人防护设备 (安全眼镜、防护手套、实验室大衣、 等 )。该协议要求标准的细胞处理技术 (杀菌, 细胞恢复, 细胞传代, 细胞冻结, 细胞染色, 等 ).
- 选择一个内径为 1 mm 的石英管, 外部直径为 3 mm. 使用抛光箔平滑两端的截面.
- 使用直径为1.0 毫米的镀镍不锈钢针作为高压电极。研磨其尖端的曲率半径为 0.05 mm.
- 将铝箔 (2 毫米宽) 环绕在石英管的1厘米处, 从石英管喷嘴。将不锈钢针点从铝箔的另一端固定在1厘米处。使用铝箔环作为低压电极.
2。获取 jet
- 提供交流信号, 将高压功率放大器连接到用作电源的功能信号发生器。将所施加电压的波形记录到高压电极上, 将高压探头的一端连接到数字示波器, 并将另一端连接至电源。为了保护电路, 使用 2 k 和 #8486; 电阻作为保护电阻。连接电路, 如 图 2 所示.
注意: 请勿触摸高压线路. - 在石英管上连续通过氦 (体积分数, 99.999%), 控制气体流速在稳定的1.4 标准升每分钟 (解运).
注意: 在处理单元格区域性之前, 我们不使用筛选器。实验中使用的氦体积分数为 99.999%, 大多数微生物在这种情况下无法生存. - 打开示波器、信号发生器和高压功率放大器的电源。将频率调节旋钮旋转5赫。将电压逐渐增加到 6 kV 的峰值.
注: 当在针中施加的电压的峰值约为6伏时, 该射流足够长 (约3厘米).
3。SH-SY5Y 细胞的制备
- 在一个25厘米 2 SH-SY5Y 中, 在 RPMI 1640 培养基中, 以15% 胎小牛血清 (FBS) 为基质, 培养出具有神经母细胞瘤的人的神经干细胞。在含有 5% CO 2 和37和 #176 的95% 空气的湿恒温培养箱中维护电池; C.
- 当细胞达到85% 汇流时, 仔细吸取培养基, 并在细胞中加入1毫升0.25% 胰蛋白酶 + 0.1% EDTA.
- 十五年代在室温下孵化后, 小心地吸取胰蛋白酶, 并加入2毫升 RPMI 1640, 内含 15% FBS 以中和.
- 轻轻吸管向上和向下, 冲洗井底, 直到 SH-SY5Y 单层完全分离.
- 通过例计数单元格并将单元格浓度调整为 2 x 10 5 单元格/mL, 方法是添加 RPMI 1640 中等 +15% FBS, 然后转移100和 #181; L 对96孔板的每一个井进行细胞悬浮.
- 在 APPJ 治疗前允许细胞在细胞孵化器中附加12小时.
4。APPJ 处理 SH-SY5Y
- 调整石英管喷嘴与平台之间的距离, 将96孔板放置在3厘米处. 确保光束能够触及培养基的表面.
注意: 距离不是从盘子的底部测量的。它是第一次调整到3厘米之间的喷嘴的石英管和平台用于放置96井板. - 在 APPJ 处理前, 除控制井外, 将每井的培养基改变为 RPMI 1640, 无葡萄糖培养基.
- 将板放在 APPJ 喷嘴下, 确保射流可以垂直射入每个井.
- 在单独的井中处理单元格的 APPJ 为 0 s、1 s、2 s、4 s、8 s 和十二年代.
注意: APPJ 是由电离氦生成的 ( 图 1 )。通过 4 s 和 8 s 氦流来处理因葡萄糖剥夺而损伤的细胞, 以消除氦对细胞的影响。所有的治疗方法都要进行三份.
5。细胞活力测定方法
注意: 请不要在此步骤中更改介质.
- 在 APPJ 处理后, 在细胞孵化器中孵育1小时的细胞.
- 添加10和 #181; 单元格计数 Kit-8 (CCK-8) 解决方案.
- 孵育37和 #176 的细胞; C 为 4 h.
注: SH-SY5Y 细胞系对葡萄糖剥夺情况敏感, 12 。1小时葡萄糖缺乏后, 细胞存活率降低到近 50%, 这是药效学研究的最佳细胞生存条件。CCK-8 对细胞没有细胞毒性, 细胞与 CCK-8 试剂在 APPJ 治疗后的葡萄糖剥夺条件下再孵育4小时, 以检查细胞的活力。在8小时葡萄糖剥夺和 APPJ 治疗后, APPJ 的保护作用明显降低, 因为长期的葡萄糖剥夺导致 SH-SY5Y 细胞的严重损害。在 24 h 葡萄糖剥夺后没有活细胞的证据 11 . - 使用微读取器测量 450 nm 的吸光度.
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Representative Results
数据被表示为至少三独立实验的平均± SD。采用方差分析法对组结果进行方差统计。所有的分析都是用统计分析软件棱镜和 p 和 #60 进行的; 0.05 是统计意义的门槛。
CCK-8 孵育4小时后测定细胞活力。如图 3所示, 与对照组相比, 葡萄糖剥夺使 SH-SY5Y 细胞的生存能力降低到44.1 ± 2.6% (通常在 RPMI 1640 介质中含有 15% FBS)。APPJ 治疗显著增加了细胞生存能力的剂量依赖性的方式, 在最佳剂量 8 s/井, 和细胞存活率达到62.27 ±3.1%。气流对葡萄糖剥夺诱导的细胞损伤没有影响 (表 1)。
图 1: 典型的 RNS 和 ROS 在 APPJ 排放中的反应.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 实验装置的示意图.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: APPJ 对葡萄糖剥夺诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤的保护作用.细胞以 APPJ 治疗, 并在1小时内被葡萄糖剥夺, 然后用 CCK-8 测定法测定细胞活力。误差线代表平均± P 和 #60; 0.001 与控制;#P 和 #60; 0.05 和 # #P 和 #60; 0.01 与葡萄糖剥夺组 (n = 3)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 组 | 细胞活力 (控制百分比) | |||
| 控制 | 100±3.7% | |||
| 葡萄糖剥夺 | 44.1 ± 2.6% *** | |||
| APPJ 治疗 + 葡萄糖缺乏 | 1 s | 49.3 ±2.8% | ||
| 2 s | 53.0 ±2.7% | |||
| 4 s | 60.4 ± 2.3%# | |||
| 8 s | 62.3 ± 3.1%## | |||
| 十二年代 | 51.3 ±2.7% | |||
| 他流动 + 葡萄糖匮乏 | 4 s | 45.4 ±2.4% | ||
| 8 s | 44.1 ±3.1% | |||
表 1: SH-SY5Y 细胞在无 APPJ 治疗葡萄糖剥夺后的生存率数据.P & #60; 0.001 与控制;#P 和 #60; 0.05 和 # #P 和 #60; 0.01 与葡萄糖剥夺组 (n = 3)。
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Discussion
SH-SY5Y 细胞是人神经母细胞瘤衍生的干细胞系, 并广泛应用作为一个适当的细胞模型, 为体外神经系统毒性或脑保护的研究12。SH-SY5Y 细胞系对葡萄糖缺乏状态敏感。1小时葡萄糖缺乏后, 细胞活力降低到近 50%, 这是研究药效学的最佳细胞生存条件。此外, CCK-8 试剂对细胞没有细胞毒性, 在 APPJ 治疗后的葡萄糖剥夺条件下, CCK-8 试剂孵育4小时, 以检测细胞的活力。在目前的研究中, 我们提供了一个详细的体外治疗方案, 关于神经保护应用的 APPJ 对葡萄糖剥夺诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤。
修改和故障排除
如果每个井的颜色发生明显变化, CCK-8 潜伏期可能较短。但如果 SH-SY5Y 细胞密度低于 1 x 104细胞, 那么细胞将在葡萄糖剥夺和 APPJ 治疗后死亡。同时, 还建议降低气体流量, 同时确保等离子体束能接触培养基的表面。APPJ 也可以作为其他神经元相关的细胞系 (HT-22, neuro-2A, 甚至原神经元) 的细胞剂, 具有不同的损伤 (缺氧, 氧化应激,等), 但细胞培养和 APPJ 治疗条件应调整, 治疗剂量必须相对较低。我们试图减少这一 APPJ 生成参数的距离, 我们发现, 等离子射流可以直接影响 SH-SY5Y 细胞的附着, 这可能导致细胞损伤 (SH-SY5Y 细胞容易脱离其附着状态)。我们认为, 治疗距离应基于细胞特性和对等离子体射流处理的耐受性。
技术的局限
目前的协议只侧重于体外APPJ 对葡萄糖剥夺损伤 SH-SY5Y 细胞的神经保护作用。以往的研究表明, 在大鼠心肌梗死模型中, 吸入血浆能改善心脏功能13。还需要做更多的工作来研究脑保护的体内治疗方法。
关于现有方法的意义
由于 APPJ 治疗引起的氧化和/或 nitrative 应激, 血浆药物在细菌、癌细胞和组织中的灭活能力受到了更多的关注14。我们的协议使用低剂量等离子治疗的神经保护应用, 没有过多的血浆诱发损伤的后果, 表明 APPJ 治疗可能作为一种新型的 "无供者药物" 的未来研究, 甚至临床翻译。
协议中的关键步骤
该协议最关键的步骤是确保 APPJ 治疗剂量相对较低, 因为过度治疗 APPJ 会加重细胞损伤, 直接诱发细胞死亡。另一个关键的步骤是控制葡萄糖剥夺持续时间或细胞将死亡和细胞的效果 APPJ 将大大减少。使用纯氦, 而不是氦混合少量的 O2或空气。当氦与少量的 O2或空气混合使用时, 血浆中的 ROS 含量会增加。当复杂的等离子体化学反应发生时, 很难做出诊断。
未来应用
还值得注意的是, APPJ 治疗是在诱导葡萄糖剥夺后, SH-SY5Y 细胞, 表明 APPJ 可作为一种治疗方法的葡萄糖剥夺相关疾病的中枢神经系统,尤其是缺血性中风因此, 在葡萄糖剥夺后的不同时期, 单独和与其他神经保护剂结合, 对 APPJ 神经保护作用的治疗条件进行评估, 是今后研究的需要。
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Disclosures
关于本文件, 没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了北京神经外科研究所 (2014-11)、中国国家自然科学基金 (Nos. 11475019 和 81271286) 和北京自然科学基金会 (No. 7152027) 的创新基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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