Summary
En protokol til neuroprotektive anvendelsen af lav-dosis atmosfæretryk plasma behandling på glucose afsavn-induceret SH-SY5Y skader.
Abstract
Atmosfæretryk plasma jet (APPJ) har tiltrukket sig opmærksomhed fra mange forskere fra flere discipliner i de seneste år fordi dens emissioner omfatter flere typer af reaktive nitrogen arter (RNS) og reaktive ilt arter (ROS). Vores tidligere undersøgelse har vist cytoprotective effekten af APPJ mod oxidativt stress-induceret skader. Formålet med den foreliggende undersøgelse er at give en detaljeret in vitro- behandling protokol vedrørende neuroprotektive programmerne for helium APPJs på glucose afsavn-induceret skade i SH-SY5Y celler. SH-SY5Y humane neuroblastoma-afledte cellelinje blev fastholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 15% føtalt kalveserum. Næringssubstratet skiftede derefter til RPMI 1640 uden glukose før APPJ behandling. Efter en 1 h inkubation i en celle inkubator, var cellernes levedygtighed bestemmes ved hjælp af celle tælle Kit 8. Resultaterne viste, at i forhold til gruppen glukose afsavn, celler behandles med APPJ udstillet betydeligt øget cellernes levedygtighed i en dosisafhængig måde, med 8 s/godt observeret som en optimal dosis. I mellemtiden, helium flow havde ingen effekt på glucose afsavn-induceret celle værdiforringelse. Vores resultater viste, at APPJ potentielt kunne anvendes som en behandlingsmetode for sygdomme i centralnervesystemet relateret til glukose afsavn. Denne protokol kan også bruges som et cytoprotective program for andre celler med forskellige funktionsnedsættelser, men cellekultur og APPJ behandling betingelser bør justeres, og behandling dosis skal være forholdsvis lav.
Introduction
Den voksne hjerne bruger næsten udelukkende glukose som substrat for energimetabolisme under normale fysiologiske forhold. Den menneskelige hjerne udgør kun 2% af kropsvægten, men forbruger ca 25% af den samlede glukose i kroppen1. Det er veldokumenteret at glukose metabolisme dysfunktion er en af de store patologiske ændringer under iskæmisk slagtilfælde og forskellige neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), Huntington's chorea (HD) og Parkinsons sygdom (PD) 2,3. Af mangel på glucose og enten nedsat glukoseoptagelse eller oxidativ fosforylering kan direkte påvirke ATP produktion og yderligere fremkalde neurale celledød, der kan øge risikoen for neuronal dysfunktion, hvilket tyder på at opretholde celle levedygtighed eller at forsinke celle skade efter glukose afsavn kan være en fornuftig tilgang til behandling af disse sygdomme. Undersøgelsen af neuroprotektive effekter via glukose graduering, med fokus på anti-inflammatoriske lægemidler, ion-kanal modulatorer, frie radikaler skyllevæsker, neurotrope faktorer, etc. har været af interesse. Oversættelse af disse neuroprotektive tilgange fra bænken til klinisk praksis har imidlertid ikke været vellykket4.
Atmosfærisk tryk plasma jets (APPJs) er en ny slags atmosfæriske lav temperatur gas udledning teknologi, der har tiltrukket sig opmærksomhed fra mange forskere fra flere discipliner i de seneste år. APPJs har været brugt i årtier i forskellige biomedicinske anvendelser såsom kræft celle behandling, bakteriel inaktivering, blodkoagulation, sårheling, oral medicin, etc.5,6, på grund af emissionerne af flere typer af reaktive nitrogen arter (RNS) og reaktive ilt arter (ROS) (figur 1)7. Tidligere plasma bio-medicin programmer primært fokuseret på den oxidative og/eller nitrative stress på bakterier, celler og væv8. APPJ kunne også være en "tveægget sværd" da RNS og ROS er vigtigt intracellulær signalering molekyler relateret til mange fysiologiske og patofysiologiske processer9. Nitrogenoxid (NO) styrer en bred vifte af biologiske processer og spiller en dobbelt rolle i den menneskelige krop, især i centralnervesystemet (CNS). Lave niveauer af NO har vist deres neuroprotektive aktiviteter både i in vitro og i vivo via flere signal veje10. Vores tidligere undersøgelse først rapporteret at helium APPJ-induceret ingen produktion var involveret i neuroprotektive effekt af APPJ mod oxidativt stress-induceret skader11. Effekter af APPJs på andre skader er dog ikke blevet rapporteret. Formålet med den foreliggende undersøgelse er derfor, at give en in vitro- behandling protokol vedrørende neuroprotektive programmerne for helium APPJ på glucose afsavn-induceret skade i SH-SY5Y celler. Forskellig fra tidligere undersøgelser, vores protokol brugt lavdosis plasma behandling for neuroprotektive programmer uden konsekvenserne af overdreven plasma-induceret skader, der angiver, at APPJ behandling potentielt kunne anvendes som en roman "ingen donor stof "for fremtidig forskning og selv for kliniske oversættelse. Denne protokol blev også foreslået skal bruges som et cytoprotective program til andre celletyper med forskellige funktionsnedsættelser, men APPJ behandling betingelser bør re justerede og behandling dosis skal være forholdsvis lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af enheden APPJ
forsigtighed: Rådfør dig med alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Brug venligst passende sikkerhedspraksis, når du udfører alle forsøgene, herunder brug af et stinkskab og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, beskyttende handsker, laboratoriekittel, osv.). Protokollen kræver standard celle håndtering teknikker (sterilisering, celle opsving, celle passaging, celle frysning, celle farvning, etc.).
- Vælg en kvarts rør med en indvendig diameter på 1 mm og udvendig diameter på 3 mm. glat tværsnit i begge ender, ved hjælp af en polering folie.
- Bruge et forniklet rustfrit stål nål med en diameter på 1,0 mm som højspænding elektrode. Slibe sin tip til en krumningsradius på 0,05 mm.
- Wrap aluminiumsfolie (2 mm i bredden) omkring kvarts rør på 1 cm fra kvarts rør dysen. Fix rustfrit stål nål punkt på 1 cm fra anden enden af aluminiumsfolie. Bruge aluminium folie ring som lav spænding elektrode.
2. Erhvervelse af jetfly
- at give en AC-signal, tilsluttes den funktion signalgenerator, der fungerer som en strømforsyning højspænding effektforstærker. For at registrere kurveformer af den anvendte spænding til højspænding elektrode, Tilslut den ene ende af højspændings sonden til den digitale oscilloskop og Tilslut anden enden til strømforsyningen. For at beskytte kredsløbet, bruge en 2 k Ω modstand som en beskyttende modstand. Tilslut kredsløbet, som vist i figur 2.
Forsigtig: Rør ikke højspændingsforbindelser. - Løbende passere helium (volumenfraktion, 99,999%) over kvarts rør og kontrol af gasstrømmen på en stabil 1.4 Standard Liter pr. minut (SLM).
Bemærk: Vi bruger ikke en filter før behandling af cellekulturer. Volumenfraktion helium bruges i eksperimentet er 99,999%, og de fleste mikroorganismer kan ikke leve under disse betingelser. - Slår magt oscilloskop, signalgenerator og højspændings effektforstærker. Rotere frekvens ingsknap til 5 kHz. Gradvist øge spændingen til en top til top værdi af 6 kV.
Bemærk: Jet er langt nok (ca. 3 cm) Hvornår top til top værdi af spænding i nålen er ca 6 kV.
3. Forberedelse af celler, SH-SY5Y
- vokse SH-SY5Y humane neuroblastoma-afledte cellelinje i en 25 cm 2 kolbe i RPMI 1640 medium suppleret med 15% føtalt kalveserum (FBS). Opretholde cellerne i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO 2 og 95% luft ved 37 ° C.
- Når cellerne nå 85% sammenløb, omhyggeligt Opsug dyrkningsmedier og tilføje 1 mL 0,25% trypsin + 0,1% EDTA til cellerne.
- Efter 15 s inkubation ved stuetemperatur, omhyggeligt Opsug trypsin og der tilsættes 2 mL RPMI 1640 indeholdende 15% FBS at neutralisere.
- Forsigtigt pipetteres op og ned, vaske i bunden af brønden, indtil SH-SY5Y éncellelag er helt løsrevet.
- Tæller cellerne ved hjælp af hemocytometer og justere den celle koncentration til 2 x 10 5 celler/mL ved at tilføje RPMI 1640 medium + 15% FBS, og derefter overføre 100 µL af cellesuspension til hver brønd af en 96-brønd plade.
- Tillader cellerne til at vedhæfte i 12 timer i en celle inkubator før APPJ behandling.
4. APPJ behandling af SH-SY5Y
- Juster afstanden mellem dysens af kvarts rør og platform hvor 96-brønd pladen placeres til 3 cm. sikre at strålen kan berøre overfladen af næringssubstratet.
Bemærk: Afstanden er ikke målt fra bunden af pladen. Tilpasses den først 3 cm mellem dysen af kvarts rør og platformen bruges til 96-brønd plade. - Før APPJ behandlingen, ændre næringssubstratet i hver brønd undtagen kontrolhullerne til RPMI 1640 uden glukose medium.
- Placere plade under APPJ dyse og sikre, at jets kan skyde lodret i hver brønd.
- Behandle celler i separate brønde med APPJ for 0 Sørensen, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s, og 12 s.
Bemærk: APPJ er genereret af ioniserende helium ( figur 1). Cellerne såret af glucose afsavn behandles af 4 s og 8 s helium flow til at fjerne virkningerne af helium på celler. Alle behandlinger skal foretages i tre eksemplarer.
5. Celle levedygtighed Assay
Bemærk: ændrer ikke mediet i dette trin.
- Efter APPJ behandlingen, inkuberes celler for 1 h i en celle inkubator.
- Tilføje 10 µL af celle tælle Kit-8 (CCK-8) løsning til hver brønd.
- Ruger celler ved 37 ° C i 4 h.
Bemærk: SH-SY5Y cellelinje er følsomme over for glukose afsavn betingelser 12. Cellernes levedygtighed falder til næsten 50% efter 1 h glukose afsavn, som er optimal celle levedygtighed betingelse for farmakodynamik undersøgelser. CCK-8 har ingen cytotoksicitet celler og celler er inkuberes med CCK-8 reagens for en anden 4 h i glucose afsavn betingelser efter APPJ behandling at kontrollere cellernes levedygtighed. Efter 8 h glukose afsavn og APPJ behandling, blev den beskyttende effekt af APPJ væsentligt reduceret fordi lang varighed af glucose afsavn førte til alvorlige skader på SH-SY5Y celler. Der var ingen tegn på levende celler efter 24 h glukose afsavn 11. - Måling af absorbans ved 450 nm med en mikrotiterplade læser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data er udtrykt i den gennemsnit ± SD mindst tre uafhængige forsøg. Gruppen resultaterne blev analyseret for variansen ved hjælp af ANOVA. Alle analyser blev udført ved hjælp af statistisk analyse software prisme og p < 0,05 var tærsklen for Statistisk signifikans.
Cellernes levedygtighed blev målt efter 4 h CCK-8 inkubation. Som vist i figur 3, glucose afsavn nedsat levedygtigheden af SH-SY5Y celler til 44,1 ± 2,6% sammenlignet med kontrolgruppen (celler, der normalt dyrkes i RPMI 1640 medium indeholdende 15% FBS). APPJ behandling steget betydeligt cellernes levedygtighed i en dosisafhængig måde på en optimal dosis af 8 s/godt, og cellernes levedygtighed nåede til 62.27 ± 3,1%. Gasflow havde ingen effekt på glucose afsavn-induceret celle værdiforringelse (tabel 1).
Figur 1: typiske RNS og ROS reaktioner i APPJ emissioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af opsætningen af eksperimenterende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: beskyttende effekt af APPJ på glucose afsavn-induceret skade celler, SH-SY5Y. Celler blev behandlet med APPJ og udsat for glucose afsavn for 1 time, hvorefter cellernes levedygtighed blev bestemt ved CCK-8 assay. Fejllinjer udgør gennemsnit ± SD. *** P < 0,001 versus kontrol; #P < 0,05 og ##P < 0,01 versus glukose afsavn gruppen (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Grupper | Cellernes levedygtighed (kontrol %) | |||
| Kontrol | 100 ± 3,7% | |||
| Glukose afsavn | 44.1 ± 2,6% *** | |||
| APPJ behandling + glukose afsavn | 1 s | 49.3 ± 2,8% | ||
| 2 s | 53.0 ± 2,7% | |||
| 4 s | 60.4 ± 2,3%# | |||
| 8 Sørensen | 62.3 ± 3,1%# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2,7% | |||
| Han flow + glukose afsavn | 4 s | 45,4 ± 2,4% | ||
| 8 Sørensen | 44.1 ± 3,1% | |||
Tabel 1: procent levedygtighed data af SH-SY5Y celler efter glukose afsavn med eller uden APPJ behandling. P < 0,001 versus kontrol; #P < 0,05 og ##P < 0,01 versus glukose afsavn gruppen (n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SH-SY5Y celler er en human neuroblastoma-afledte cellelinie og er almindeligt anvendt som en passende celle model for in vitro- undersøgelser den neurotoksiske eller neuroprotection12. SH-SY5Y cellelinje var følsomme over for glukose afsavn betingelser. Cellernes levedygtighed faldt til næsten 50% efter 1 h glukose afsavn, som er den optimale celle levedygtighed betingelse for undersøgelser af farmakodynamik. Derudover CCK-8 reagens har ingen cytotoksicitet celler og celler blev inkuberet med CCK-8 reagens for en anden 4 h i glucose afsavn betingelser efter APPJ behandling at kontrollere cellernes levedygtighed. I den aktuelle undersøgelse giver vi en detaljeret in vitro- behandling protokol vedrørende neuroprotektive anvendelser af APPJ på glucose afsavn-induceret skade af SH-SY5Y celler.
Ændringer og fejlfinding
CCK-8 inkubationstiden kan være kortere, hvis farve i hver godt betydeligt ændret. Men hvis SH-SY5Y celle tæthed er under 1 x 104 celler pr. brønd, celler vil være døde efter glukose afsavn og APPJ behandling. Det anbefales også at reducere strømningshastigheden gas samtidig, plasma strålen kan berøre overfladen af næringssubstratet. APPJ kan også bruges som en cytoprotective agent for andre neuronal relateret cellelinjer (HT-22, neuro-2A eller endda primære neuroner) med forskellige funktionsnedsættelser (hypoxi, oxidativ stress, osv.), men bør cellekultur og APPJ behandling betingelser justeres, og behandling dosis skal være forholdsvis lav. Vi har forsøgt at mindske afstanden i denne APPJ generation parameter, og vi fandt, at plasma jet direkte kan påvirke udlæg i SH-SY5Y celler, hvilket kan resultere i celle skader (SH-SY5Y celler blev let adskilt fra deres vedhængende tilstand). Vi mener, at behandling afstanden bør baseres på cellebanker og tolerancen overfor plasma jet behandling.
Begrænsninger af teknikken
Den nuværende protokol kun fokuseret på in vitro- neuroprotektive effekten af APPJ på glucose afsavn-såret SH-SY5Y celler. Tidligere forskning har vist, at indånding af plasma kunne forbedre hjerte funktioner i en rotte myokardieinfarkt model13. Mere arbejde er stadig behov for at undersøge i vivo behandlingsmetoden for hjernen beskyttelse.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Tidligere forskning på plasma medicin betalt mere opmærksomhed til inaktivering kapacitet i bakterier, kræftceller og væv på grund af den oxidative og/eller nitrative stress induceret af APPJ behandling14. Vores protokol brugt lavdosis plasma behandling for neuroprotektive programmer uden konsekvenserne af overdreven plasma-induceret skader, der angiver, APPJ behandlingen potentielt kunne anvendes som en roman "Ingen donor stof" for den fremtidige forskning og endda for klinisk oversættelse.
Kritiske trin i protokollen
Det mest afgørende skridt i denne protokol er at sikre APPJ behandling dosis er relativt lav, siden over behandling med APPJ vil forværre celle skader og direkte fremkalde celledød. Endnu et kritisk skridt er at kontrollere glukose afsavn varighed eller cellerne dør og cytoprotective effekten af APPJ vil blive reduceret betydeligt. Ren helium, blev snarere end helium blandet med en lille mængde af O2 eller luft, brugt. Når helium blandet med en lille mængde af O2 eller luft bruges, øges mængden af ROS i plasma. Det er meget vanskeligt at stille en diagnose når komplicerede plasma kemiske reaktioner forekomme.
Fremtidige ansøgninger
Det er også værd at bemærke, at APPJ-behandlingen blev anvendt efter induktion af glucose afsavn på SH-SY5Y celler, der angiver, at APPJ potentielt kunne anvendes som en behandlingsmetode for glucose afsavn-relaterede sygdomme i centralnervesystemet, især iskæmisk slagtilfælde. Derfor er det nødvendigt for fremtidige undersøgelser for at evaluere behandling betingelser neuroprotektive virkning af APPJ, både alene og i kombination med andre neuroprotektive agenter i forskellige perioder efter glukose afsavn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter blev erklæret i forhold til dette papir.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af innovationsfond Beijing Neurokirurgiske Institute (2014-11), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 11475019 og 81271286) og Beijing Natural Science Foundation (nr. 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
- Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
- Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
- Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339 (2015).
- Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005 (2012).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
- Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049 (2016).
- Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
- Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401 (2017).
- Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309 (2014).
- Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).
