Summary
En protokoll for neuroprotective bruk av lav dose lufttrykk plasma behandling på glukose deprivasjon-indusert SH-SY5Y skader.
Abstract
Lufttrykk plasma jet (APPJ) har tiltrukket seg oppmerksomheten til mange forskere fra flere fagfelt de siste årene på grunn av sine utslipp inneholder flere typer reaktivt nitrogen arter (RNS) og reaktive oksygen arter (ROS). Vår forrige studie har vist cytoprotective effekten av APPJ mot oksidativt stress-indusert skader. Målet med denne studien er å gi en detaljert i vitro behandling protokoll om neuroprotective programmene av helium APPJs på glukose deprivasjon-indusert skade i SH-SY5Y celler. SH-SY5Y human neuroblastom-avledet celle linjen ble opprettholdt i RPMI 1640 medium med 15% fosterets kalv serum. Kultur mediet ble deretter endret til RPMI 1640 uten glukose før APPJ behandling. Etter en 1t inkubasjon i en celle inkubator identifiserte celle levedyktighet bruker celle teller Kit 8. Resultatene viste at, sammenlignet med gruppen glukose deprivasjon, cellene behandles med APPJ utstilt betydelig økt celle levedyktighet i en doseavhengig måte, med 8 s/vel observert som en optimal dose. I mellomtiden hadde helium flyt ingen effekt på glukose deprivasjon-indusert celle verdifall. Resultatene indikerte at APPJ potensielt kan brukes som en behandlingsmetode for sykdommer i sentralnervesystemet knyttet til glukose deprivasjon. Denne protokollen kan også brukes som et cytoprotective program for celler med forskjellige impairments, men i cellekultur og APPJ behandling betingelsene skal justeres, og behandling dose må være relativt lav.
Introduction
Voksen hjernen bruker nesten utelukkende glukose som et substrat for energi metabolism under normale fysiologiske forhold. Den menneskelige hjernen utgjør bare 2% av kroppsvekten men bruker ca 25% av den totale glukose i kroppen1. Det er godt dokumentert at glukose metabolisme dysfunksjon er en av de store patologiske forandringer under iskemiske hjerneslag og forskjellige nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Huntingtons sykdom (HD) og Parkinsons sykdom (PD) 2,3. Mangel på glukose og svekket glukose opptak eller oxidative fosforylering kan direkte påvirke ATP produksjonen og ytterligere indusere nevrale celledød, som kan øke risikoen for neuronal dysfunksjon, antyder at opprettholde celle levedyktighet eller forsinke celle skade etter glukose deprivasjon kan være en fornuftig tilnærming for behandling av disse sykdommene. Etterforskningen av neuroprotective effekter via glukose modulasjon, fokuserer på anti-inflammatoriske midler, ion kanal modulatorer, frie radikaler renovasjonsarbeider, nevrotropisk faktorer, etc. har vært av interesse. Oversettelse av disse neuroprotective tilnærminger fra benk til klinisk praksis har imidlertid ikke vært vellykket4.
Lufttrykk plasma jetfly (APPJs) er en ny type atmosfæriske lav temperatur gass utslipp teknologi som har tiltrukket seg oppmerksomheten til mange forskere fra flere fagfelt de siste årene. APPJs har blitt brukt i flere tiår i biomedisinsk programmer som cellen kreftbehandling, bakteriell inaktivering, blodpropp, sårheling, oral medisin, etc.5,6, på grunn av sine utslipp av flere typer reaktivt nitrogen arter (RNS) og reaktive oksygen arter (ROS) (figur 1)7. Tidligere plasma bio-medisin programmer hovedsakelig fokusert på oksidativt og/eller nitrative stress på bakterier, celler og vev8. Men kan APPJ også være en "tveegget sverd" siden RNS og ROS er viktig intracellulær signalnettverk molekylene knyttet til mange fysiologiske og patofysiologiske9. Lystgass (nei) styrer et bredt spekter av biologiske prosesser og spiller en dobbel rolle i den menneskelige kroppen, spesielt i sentralnervesystemet (CNS). Lave nivåer av ingen har vist sine neuroprotective aktiviteter både i vitro og i vivo via flere signal veier10. Vår forrige studie først rapportert at helium APPJ-indusert ingen produksjon var involvert i neuroprotective effekten av APPJ mot oksidativt stress-indusert skader11. Men er effekten av APPJs på andre skader ikke rapportert. Derfor er målet med denne studien å gi en i vitro behandling protokollen om neuroprotective programmene av helium APPJ på glukose deprivasjon-indusert skade i SH-SY5Y celler. Forskjellig fra tidligere studier, våre protokollen brukes lavdose plasma behandling for neuroprotective programmer uten konsekvensene av overdreven plasma-indusert skader, som angir at APPJ behandling potensielt kan brukes som en roman "ingen donor narkotika "for fremtidig forskning og selv for klinisk oversettelse. Denne protokollen ble også foreslått som skal brukes som cytoprotective-program for andre celletyper ulike brukere, men APPJ behandling betingelsene skal re-justert og behandling dose må være relativt lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av APPJ enheten
Advarsel: ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før bruk. Bruk riktige sikkerhets praksis når du utfører alle eksperimentene, inkludert bruk av en avtrekksvifte og personlig verneutstyr (vernebriller, vernehansker, laboratoriefrakk, etc.). Protokollen krever standard celle håndtering teknikker (sterilisering celle utvinning celle passaging, celle frysing, celle flekker, etc.).
- Velge en kvarts rør med en indre diameter på 1 mm og en ytre diameter på 3 mm. glatt tverrsnitt i begge ender med en polering folie.
- Bruker en forniklet rustfritt stål nål med 1.0 mm diameter som høy spenning elektroden. Slipe dens tips til en radius av krumning av 0.05 mm.
- Brytes aluminiumsfolie (2 mm i bredde) rundt kvarts røret på 1 cm fra kvarts røret munnstykket. Fastsette rustfritt stål nål punktet på 1 cm fra den andre enden av aluminiumsfolie. Bruke aluminiumsfolie ringen som lav spenning elektroden.
2. Oppkjøpet av Jets
- gir et AC signal, koble høyspent effektforsterker til funksjonen signalgenerator som fungerer som en strømforsyning. For å registrere bølgeformer av anvendt spenning til høy spenning elektroden, koble en ende av høyspent sonden til digital oscilloskop og koble den andre enden til strømforsyningen. For å beskytte krets, bruk en 2 k Ω motstand som en beskyttende motstand. Koble krets som vist i figur 2.
FORSIKTIG: Berør ikke høy spenning linjene. - Kontinuerlig passere helium (volum brøk, 99,999%) over kvarts røret og kontrollere gass flow rate på en stabile 1,4 Standard Liter per minutt (SLM).
Merk: Vi bruker ikke et filter før behandle cellekulturer. Volum brøkdel av helium brukes i eksperimentet er 99,999%, og de fleste mikroorganismer kan ikke leve under disse forholdene. - Slå på strømmen av oscilloskop, signalgenerator og høyspent effektforsterker. Rotere frekvens posis 5 kHz. Gradvis øke spenningen til topp-til-topp verdien 6 kV.
Merk: Jet er lenge nok (ca. 3 cm) når topp-til-topp spenning anvendes i nålen er ca 6 kV.
3. Utarbeidelse av SH-SY5Y celler
- vokse SH-SY5Y human neuroblastom-avledet celle linje i en 25 cm 2 kolbe i RPMI 1640 medium med 15% fosterets kalv serum (FBS). Opprettholde cellene i en fuktet inkubator inneholder 5% CO 2 og 95% luft på 37 ° C.
- Når cellene nå 85% samløpet, nøye Sug opp kultur media og legge til 1 mL 0,25% trypsin + 0,1% EDTA cellene.
- Etter 15 s inkubasjon i romtemperatur, nøye Sug opp trypsin og legge 2 mL RPMI 1640 som inneholder 15% FBS å nøytralisere.
- Pipetter forsiktig opp og ned, vaske bunnen av brønnen til SH-SY5Y-monolayer er helt løsrevet.
- Telle celler ved hjelp av hemocytometer og justere til celle konsentrasjonen til 2 x 10 5 celler/mL ved å legge RPMI 1640 middels 15% FBS, og deretter overføre 100 µL av cellen suspensjon i hver brønn av en 96-brønns plate.
- At cellene å koble 12t i en celle inkubator før APPJ behandling.
4. APPJ behandling av SH-SY5Y
- Juster avstanden mellom munnstykket av kvarts rør og plattformen hvor 96-brønns platen plasseres til 3 cm. sikre at strålen kan touch overflate kultur medium.
Merk: Avstanden er ikke målt fra bunnen av platen. Det justeres først til 3 cm mellom munnstykket av kvarts røret og plattformen brukes til å plassere 96-brønns plate. - Før APPJ behandlingen, endre kultur medium i hver brønn unntatt kontroll brønnene til RPMI 1640 uten glukose medium.
- Plasser platen under APPJ munn og sikre at dysene kan skyte loddrett i hver brønn.
- Behandler celler i separate brønner med APPJ for 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s og 12 s.
Merk: APPJ genereres av ioniserende helium ( figur 1). Cellene skadet av glukose deprivasjon behandles av 4 s og 8 s helium flyt å eliminere effektene av helium på celler. Alle behandlinger skal utføres i tre eksemplarer.
5. Celle levedyktighet analysen
Merk: ikke endre mediet i dette trinnet.
- Etter APPJ behandling, ruge cellene 1t i en celle inkubator.
- Legge til 10 µL av cellen teller Kit-8 (CCK-8) løsning i hver brønn.
- Ruge cellene på 37 ° C i 4 h.
Merk: SH-SY5Y celle linjen er følsom for glukose deprivasjon forhold 12. Cellen levedyktighet synker til nesten 50% etter 1t glukose deprivasjon, som er den optimale celle levedyktighet tilstanden for pharmacodynamics studier. CCK-8 har ingen cytotoksisitet celler og celler er ruges med CCK-8 reagens en annen 4 h glukose deprivasjon forhold etter APPJ behandling du cellen levedyktighet. Etter 8 h glukose deprivasjon og APPJ behandling, var beskyttende effekten av APPJ betydelig redusert fordi langvarig av glukose deprivasjon førte til alvorlig skade SH-SY5Y cellene. Det var ingen bevis av levende celler etter 24 h glukose deprivasjon 11. - Måle absorbansen ved 450 nm med en microplate leseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD minst tre uavhengige eksperimenter. Grupperesultater ble analysert for variansen ved hjelp av VARIANSANALYSE. Alle analyser som ble utført med statistisk analyse software prisme og p < 0,05 var terskelen for statistisk betydning.
Cellen levedyktighet ble målt etter 4 h for CCK-8 inkubasjon. Som vist i Figur 3, glukose deprivasjon redusert levedyktigheten til 44.1 ± 2,6% sammenlignet med kontrollgruppen SH-SY5Y celler (celler normalt kultivert i RPMI 1640 medium som inneholder 15% FBS). APPJ behandling betydelig økt celle levedyktighet i en doseavhengig måte på en optimal dose av 8 s/Vel, og cellen levedyktigheten nådde 62.27 ± 3,1%. Gasstrømmen hadde ingen effekt på glukose deprivasjon-indusert celle verdifall (tabell 1).
Figur 1: typisk RNS og ROS reaksjoner i APPJ utslipp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av eksperimentelle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: beskyttende effekten av APPJ på glukose deprivasjon-indusert skade celleområde SH-SY5Y. Cellene ble behandlet med APPJ og utsatt for glukose deprivasjon 1t, hvoretter celle levedyktigheten ble bestemt bruker CCK-8 analysen. Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± SD. *** P < 0,001 versus kontroll; #P < 0,05 og ##P < 0,01 versus gruppen glukose deprivasjon (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Grupper | Cellen levedyktighet (kontrollen %) | |||
| Kontroll | 100 ± 3,7% | |||
| Glukose deprivasjon | 44,1 ± 2,6% *** | |||
| APPJ behandling + glukose deprivasjon | 1 s | 49.3 ± 2,8% | ||
| 2 s | 53.0 ± 2,7% | |||
| 4 s | 60.4 ± 2,3%# | |||
| 8 s | 62.3 ± 3,1%# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2,7% | |||
| Han flow + glukose deprivasjon | 4 s | 45,4 ± 2.4% | ||
| 8 s | 44,1 ± 3,1% | |||
Tabell 1: prosent levedyktighet data av SH-SY5Y celler etter glukose deprivasjon med eller uten APPJ behandling. P < 0,001 versus kontroll; #P < 0,05 og ##P < 0,01 versus gruppen glukose deprivasjon (n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SH-SY5Y celler er en human neuroblastom-avledet celle linje og er mye brukt som en aktuelle cellen modell for i vitro studier på nevrotoksisitet eller neuroprotection12. SH-SY5Y celle linjen var følsom glukose deprivasjon forhold. Cellen levedyktighet redusert til nesten 50% etter 1t glukose deprivasjon, som er optimale celle levedyktighet tilstanden for studier av pharmacodynamics. Videre CCK-8 reagens har ingen cytotoksisitet celler og celler ble inkubert med CCK-8 reagens en annen 4 h glukose deprivasjon forhold etter APPJ behandling du cellen levedyktighet. I denne studien gir vi en detaljert i vitro behandling protokoll om neuroprotective programmer APPJ på glukose deprivasjon-indusert skaden SH-SY5Y celler.
Endringer og feilsøking
CCK-8 inkubasjon tiden kan være kortere Hvis fargen i hver også betydelig endret. Men hvis SH-SY5Y celle tetthet er under 1 x 104 celler per brønn, celler blir død etter glukose deprivasjon og APPJ behandling. Det anbefales også å redusere infusjonshastigheten gass, samtidig som man sikrer at plasma strålen kan touch overflate kultur medium. APPJ kan også brukes som en cytoprotective agent for andre neuronal relatert cellelinjer (HT-22, Nevro-2A eller selv primære nerveceller) ulike brukere (hypoksi, oksidativt stress, etc.), men i cellekultur og APPJ behandling betingelsene skal readjusted, og behandling dose må være relativt lav. Vi har forsøkt å redusere avstanden i parameterverdien APPJ generasjon, og vi fant at plasma jet kan direkte påvirke feste SH-SY5Y celler som kan resultere i cellen skader (SH-SY5Y celler var lett løsrevet fra deres tilhenger tilstand). Vi tror at behandling avstanden bør være basert på den celle egenskaper og toleransen til plasma jet behandling.
Begrensninger av teknikken
Gjeldende protokollen bare fokusert på i vitro neuroprotective effekten av APPJ på glukose deprivasjon-skadde SH-SY5Y celler. Tidligere undersøkelser har vist at innånding av plasma kan forbedre hjerte funksjoner i en rotte hjerteinfarkt modell13. Mer arbeid er fortsatt behov for å undersøke i vivo behandlingsmetode for hjernen beskyttelse.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder
Tidligere forskning på plasma medisin betalt mer oppmerksomhet til inaktivering kapasitet i bakterier, kreftceller og vev på grunn av oksidativt og/eller nitrative stress indusert av APPJ behandling14. Våre protokollen brukes lavdose plasma behandling for neuroprotective programmer uten konsekvensene av overdreven plasma-indusert skader, som angir at APPJ behandling kan potensielt brukes som en roman "Ingen donor narkotika" for fremtidig forskning og selv for klinisk oversettelse.
Avgjørende skritt i protokollen
Det viktigste trinnet i denne protokollen er å sørge for APPJ behandling dosen er relativt lav, siden over behandling med APPJ vil forverre celle skader og direkte indusere celledød. Et annet viktig skritt er å kontrollere glukose deprivasjon varigheten eller cellene vil dø og cytoprotective effekten av APPJ vil reduseres betydelig. Ren helium, ble snarere enn helium blandet med en liten mengde O2 og air, brukt. Når helium blandet med en liten mengde O2 eller luft, øker mengden ROS i plasma. Det er svært vanskelig å stille en diagnose når komplisert plasma kjemiske reaksjoner forekommer.
Framtidige applikasjoner
Det er også verdt å merke seg at APPJ behandling ble brukt etter induksjon av glukose deprivasjon på SH-SY5Y celler, som angir at APPJ potensielt kan brukes som en behandlingsmetode for glukose deprivasjon-relaterte sykdommer i sentralnervesystemet, spesielt iskemiske hjerneslag. Derfor er det nødvendig for fremtidige studier for å vurdere behandling betingelsene for neuroprotective effekten av APPJ både alene og sammen med andre neuroprotective agenter i forskjellige perioder etter glukose deprivasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konflikter av interesse ble erklært i forhold til dette dokumentet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av innovasjon fondet av Beijing Neurosurgical Institute (2014-11), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 11475019 og 81271286) og Beijing Natural Science Foundation (nr. 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
- Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
- Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
- Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339 (2015).
- Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005 (2012).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
- Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049 (2016).
- Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
- Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401 (2017).
- Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309 (2014).
- Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).
