Summary
Протокол для применения нейропротекторной низкодозированные атмосферное давление плазменной обработки на глюкозу лишение индуцированной SH-SY5Y травмы.
Abstract
Струи плазмы атмосферного давления (APPJ) привлекла внимание многих исследователей из нескольких дисциплин в последние годы, потому что его выбросы включают несколько видов химически активные разновидности азота (RNS) и реактивнооксигенных видов (ров). Наши предыдущие исследования показали цитопротективный эффект APPJ против Оксидативный стресс индуцированного повреждения. Целью настоящего исследования является предоставить подробный в vitro протокол лечения относительно применения нейропротекторной гелия APPJs на лишение индуцированной травмы глюкозы в клетках SH-SY5Y. SH-SY5Y человеческой нейробластомы производные клеточная линия была сохранена в RPMI 1640 среднего дополнены 15% плода телячьей сыворотки. Культура средних затем было изменено на RPMI 1640 без глюкозы до лечения APPJ. После инкубации 1 ч в инкубаторе клетки жизнеспособность клеток определяли с использованием клеток подсчета Kit 8. Результаты показали, что, по сравнению с группой лишение глюкозы, клетках, обработанных с APPJ выставлены жизнеспособность клеток значительно возросли в зависимости от дозы, с 8 s/также отмечаться как оптимальную дозу. Тем временем поток гелия был не влияет на обесценение лишение индуцированной клетки глюкозы. Наши результаты показали, что APPJ могут потенциально использоваться как метод лечения заболеваний центральной нервной системы, связанных с лишением глюкозы. Этот протокол также может использоваться как цитопротективного приложение для других ячеек с различными нарушениями, но клеточной культуры и условий лечения APPJ следует скорректировать и лечения доза должна быть относительно низкой.
Introduction
Взрослый мозг почти исключительно использует глюкозу как субстрат для метаболизма энергии при нормальных физиологических условиях. Человеческий мозг составляет только 2% от веса тела, но потребляет около 25% всего глюкозы в пределах тела1. Это хорошо документирована что дисфункция метаболизма глюкозы является одним из основных патологических изменений при ишемическом инсульте и различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезни Гентингтона (HD) и болезнь Паркинсона (PD) 2,3. Недостаток глюкозы и зрением глюкозы или Оксидативное фосфорилирование можно непосредственно воздействие производства АТФ и далее побуждать смерти нейронные клетки, который может увеличить риск нейрональных дисфункции, предполагая, что поддержание жизнеспособности клеток или Откладывание клетки травмы после того, как лишение глюкоза может быть разумный подход для лечения этих заболеваний. Исследование эффектов нейропротекторной через глюкозы модуляции, упором на противовоспалительные агенты, ионного канала модуляторы, поглотители свободных радикалов, нейротрофических факторов, и т.д. был интерес. Однако перевод этих подходов нейропротекторной от скамьи в клинической практике не был успешным4.
Атмосферного давления плазмы струй (APPJs) являются новый вид атмосферных низкой температуры газового разряда технологии, которая привлекает внимание многих исследователей из нескольких дисциплин в последние годы. APPJs были использованы на протяжении десятилетий в различных биомедицинских приложений, таких как рак клеток лечение, бактериальных инактивации, свертываемость крови, заживление ран, устным медицины, и т.д.5,6, из-за своих выбросов нескольких типов химически активные разновидности азота (RNS) и реактивнооксигенных видов (ров) (рис. 1)7. Предыдущих приложений био медицины плазмы главным образом на окислительного и nitrative нагрузку на8бактерий, клеток и тканей. Однако APPJ также может быть «обоюдоострый меч», так как RNS и ROS важных внутриклеточных сигнальных молекул, относящиеся к многие физиологические и патофизиологических процессов9. Оксид азота (NO) управляет широкий спектр биологических процессов и играет двойную роль в человеческом теле, особенно в центральной нервной системе (ЦНС). Низкий уровень не показали их нейропротекторной деятельности как в пробирке и в естественных условиях через несколько путей сигнал10. Наши предыдущие исследования впервые сообщили, что гелий APPJ-индуцированной не участвовал в нейропротекторной эффект APPJ против Оксидативный стресс индуцированного повреждения11. Однако воздействие APPJs на других повреждений не сообщалось. Таким образом цель настоящего исследования-обеспечить в vitro лечения протокола относительно применения нейропротекторной гелия APPJ на лишение индуцированной травмы глюкозы в клетках SH-SY5Y. Отличается от предыдущих исследований, наши протокол используется низкодозированные плазменной обработки для применения нейропротекторной без последствий чрезмерной плазмы индуцированной травм, указав, что лечение APPJ может использоваться потенциально как Роман «нет наркотиков доноров «для будущих исследований и даже для клинических перевода. Этот протокол было также предложено, чтобы использоваться как цитопротективного приложение для других типов клетки с различными нарушениями, но условия лечения APPJ следует повторно скорректированные и лечения доза должна быть относительно низкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка устройства APPJ
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Проконсультируйтесь все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Пожалуйста, используйте практики безопасности при выполнении всех экспериментов, в том числе использование вытяжного шкафа и средства индивидуальной защиты (защитные очки, защитные перчатки, лабораторный халат и т.д.). Протокол требует от стандартной ячейки обработки методов (стерилизации, восстановление клеток, клеток пассированый, замораживание клеток, окрашивание клеток, и т.д.).
- Выбрать кварцевая трубка с внутренним диаметром 1 мм и наружным диаметром 3 мм. гладкие разрезов на обоих концах с помощью полировки фольги.
- Использовать никелированные иглы из нержавеющей стали диаметром 1,0 мм как электрод высокого напряжения. Растереть его кончик с радиусом кривизны 0,05 мм. Насадка
- обернуть алюминиевой фольги (2 мм в ширину) вокруг кварцевая трубка на 1 см от кварцевая трубка. Зафиксировать точку иглы из нержавеющей стали на 1 см от конца алюминиевой фольги. Использование алюминиевой фольги кольцо как низкого напряжения электрода.
2. Приобретение самолетов
- для обеспечения сигнала переменного тока, Подключите усилитель мощности высокого напряжения к функции сигнала генератора, который служит в качестве источника питания. Для записи сигналов приложенное напряжение на электроде высокого напряжения, подключите один конец зонда высокого напряжения к цифровой осциллограф и подключите другой конец к источнику питания. Для защиты схемы, используйте 2 k Ω резистор как резистора защитного. Соедените цепь по схеме, как показано на рис. 2.
Предостережение: Не прикасайтесь высоковольтных линий. - Постоянно проходят гелия (объёмная, 99,999%) над кварцевая трубка и контролировать скорость потока газа при стабильной Стандартный 1,4 литра в минуту (ОДС).
Примечание: Мы не используем фильтр перед обработкой клеточных культур. Объемная доля гелия, используемых в эксперименте — 99,999%, и большинство микроорганизмов не может жить в этих условиях. - Включите питание осциллограф, генератор сигнала и усилитель мощности высокого напряжения. Поверните ручку регулировки частоты до 5 кГц. Постепенно увеличивайте напряжения к значению пик пик, 6 кв.
Примечание: Струи достаточно долго (около 3 см) когда пик пик напряжения в иглу значение около 6 кв.
3. Подготовка клетки SH-SY5Y
- растут SH-SY5Y человеческой нейробластомы производные клеточная линия в колбе 2 25 см в RPMI 1640 среднего дополнены 15% плода телячьей сыворотки (ФБС). Сохранить клетки в увлажненные инкубатора, содержащих 5% CO 2 и 95% воздуха при 37 ° с.
- Когда клетки достичь слияния 85%, тщательно аспирационная культуры средств массовой информации и добавить трипсин 0.25% 1 мл + 0.1% ЭДТА в ячейки.
- После 15 s инкубации при комнатной температуре, тщательно аспирационная трипсина и добавить 2 мл RPMI 1640, содержащий 15% FBS нейтрализовать.
- Нежно Пипетка вверх и вниз, мытье в нижней части скважины, до тех пор, пока полностью отсоединяется монослоя SH-SY5Y.
- Подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и регулировка концентрации клеток до 2 x 10 5 клеток/мл, добавив RPMI 1640 средний + 15% FBS, а затем передачи 100 мкл суспензии клеток в каждой скважине плиту 96-луночных.
- Позволяют клеткам прикрепить за 12 ч в инкубаторе ячейки перед началом лечения APPJ.
4. APPJ лечение SH-SY5Y
- отрегулируйте расстояние между сопла кварца метро и платформы, где будут размещаться пластину 96-луночных до 3 см. Убедитесь, что луч может коснуться поверхности питательной среды.
Примечание: Не расстояние измеряется от нижней части пластины. Сначала она корректируется до 3 см между сопла кварцевая трубка и платформой, используемой для размещения 96-луночных пластина. - Перед началом лечения APPJ, изменить питательной среды в каждой скважины, за исключением контроля скважин RPMI 1640 без глюкозы среднего.
- Место пластину под APPJ насадку и убедитесь, что струи может стрелять вертикально в каждой скважине.
- Клетки лечения в отдельных скважинах с APPJ 0 s, 1 сек, 2 s, 4 s, 8 s и 12 s.
Примечание: APPJ генерируется ионизирующего гелия ( рис. 1). Клетки, ранены лишением глюкозы рассматриваются 4 s и 8 s поток гелия для устранения последствий гелия на клетки. Все процедуры должны выполняться в трех экземплярах.
5. Жизнеспособность Assay клетки
Примечание: не изменяйте среднего в этом шаге.
- После APPJ лечения, инкубации клеток на 1 ч в инкубаторе ячейки.
- Добавить 10 мкл раствора клеток подсчета Kit-8 (CCK-8) в каждой скважине.
- Инкубации клеток при 37 ° C для 4 х.
Примечание: SH-SY5Y линия клетки чувствителен к глюкозы лишение условий 12. Жизнеспособность клеток уменьшается почти на 50% после лишения глюкозы 1 h, что является условием жизнеспособности оптимальное ячейки для исследования фармакодинамики. CCK-8 имеет не цитотоксичности клетки и клетки инкубируют с реактивом CCK-8 для другой 4 ч в условиях лишений глюкозы после APPJ лечения для проверки жизнеспособности клеток. После 8 h лишение глюкозы и APPJ лечения защитный эффект APPJ была значительно уменьшена, поскольку Лонг продолжительность лишения глюкозы привела к серьезному повреждению клеток SH-SY5Y. Нет никаких свидетельств живых клеток после 24 ч глюкозы лишение 11. - Измерения оптической плотности на 450 нм с Считыватель микропланшетов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные выражаются как среднее ± SD по меньшей мере три независимых экспериментов. Группы результаты были проанализированы для дисперсии с использованием дисперсионного анализа. Все анализы были проведены с использованием программного обеспечения для статистического анализа Призма и p < 0,05 был порог для статистической значимости.
Жизнеспособность клеток была измерена после 4 ч инкубации CCK-8. Как показано на рисунке 3, лишение глюкозы снижение жизнеспособности клеток SH-SY5Y 44.1 ± 2,6% по сравнению с контрольной группой (клетки обычно культивировали в RPMI 1640 носитель, содержащий 15% FBS). APPJ лечения значительно увеличили жизнеспособность клеток в зависимости от дозы на оптимальную дозу 8 s/хорошо, и жизнеспособность клеток достигла 62.27 ± 3,1%. Поток газа не отразилось на обесценение лишение индуцированной клетки глюкозы (Таблица 1).
Рисунок 1: типичный RNS и ROS реакции APPJ выбросов в. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема экспериментальной установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: защитный эффект на глюкозы лишение индуцированного повреждения SH-SY5Y клеток от APPJ. Клетки были относиться с APPJ и подвергаются лишению глюкозы за 1 ч, после чего жизнеспособность клеток было определено с помощью анализа CCK-8. Планки погрешностей представляют собой среднее ± SD. *** P < 0,001 против контроля; #P < 0,05 и ##P < 0.01 против группы лишение глюкозы (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Группы | Жизнеспособность клеток (управления %) | |||
| Управления | 100 ± 3.7% | |||
| Глюкоза лишение | 44.1 ± 2,6% *** | |||
| APPJ лечение + глюкоза лишение | 1 s | 49.3 ± 2,8% | ||
| 0 1 | 53.0 ± 2,7% | |||
| 4 s | 60.4% ± 2.3# | |||
| : 1 | 62.3 ± 3,1%# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2,7% | |||
| Он потока + глюкоза лишение | 4 s | 45.4 ± 2,4% | ||
| : 1 | 44.1 ± 3,1% | |||
Таблица 1: процент жизнеспособность данных SH-SY5Y клетки после лишения глюкозы с или без лечения APPJ. P < 0,001 против контроля; #P < 0,05 и ##P < 0.01 против группы лишение глюкозы (n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SH-SY5Y клетки линии клеток человека нейробластомы производные и широко используются как модель соответствующую ячейку в vitro исследования нейротоксичности или нейропротекции12. SH-SY5Y линия клетки был чувствителен к глюкозы лишение условий. Жизнеспособность клеток снизился почти на 50% после лишения глюкозы 1 h, который является условием жизнеспособности оптимальное ячейки для исследования фармакодинамики. Кроме того CCK-8 реагент не цитотоксичности клетки и клетки инкубировали с реактивом CCK-8 для другой 4 ч в условиях лишений глюкозы после APPJ лечения для проверки жизнеспособности клеток. В текущем исследовании мы предоставляем подробную в vitro протокол лечения относительно применения нейропротекторной APPJ на лишение индуцированного повреждения глюкозы SH-SY5Y клеток.
Модификации и устранение неполадок
Время инкубации CCK-8 может быть короче, если цвет в каждом также существенно изменилась. Но если плотность клеток SH-SY5Y ниже 1 х 104 клетки на колодец, клетки будет мертвым после лишения глюкозы и APPJ лечения. Также рекомендуется уменьшить скорость потока газа, обеспечивая, что плазменный луч может коснуться поверхности питательной среды. APPJ также может использоваться в качестве цитопротективного агента для других нейронов связанных клеточных линий (HT-22, нейро 2A или даже начальное нейронов) с различными нарушениями (гипоксии, оксидативный стресс и т.д.), но клеточной культуры и условий лечения APPJ следует скорректированы, и лечения доза должна быть относительно низкой. Мы пытались уменьшить расстояние в этом параметре APPJ поколения, и мы обнаружили, что плазменной струи может непосредственно повлиять на вложение SH-SY5Y клеток, которые могут привести к ячейке травм (SH-SY5Y клетки легко были отсоединены от их сторонником государства). Мы считаем, что лечение расстояния должна основываться на характеристики клеток и терпимости к лечению плазменной струи.
Ограничения метода
Текущий протокол только сосредоточена на в vitro нейропротекторной влияние APPJ на глюкозы лишение ранения SH-SY5Y клетки. Предыдущие исследования показали, что вдыхание плазмы может улучшить сердечной функции миокарда крыс модель13. Расследовать метод лечения в естественных условиях , для защиты мозга по-прежнему необходима дальнейшая работа.
Значение в отношении существующих методов
Предыдущие исследования плазмы медицины уделялось больше внимания возможности инактивации бактерий, раковых клеток и тканей из-за окислительного и nitrative стресса, вызванного APPJ лечения14. Наш протокол, используемый для нейропротекторной приложений без последствий чрезмерного плазмы индуцированной травм, указав, что лечение APPJ могут потенциально использоваться как Роман «Нет доноров наркотиков» для будущих исследований и даже низких доз Плазменная обработка для клинических перевода.
Важнейшие шаги в рамках протокола
Наиболее важным этапом в этом протоколе-чтобы убедиться, что APPJ лечения доза является относительно низким, поскольку лечение с APPJ будет усугубить повреждения клеток и непосредственно вызывать гибель клеток. Другим важным шагом является контролировать продолжительность лишения глюкозы или клетки будут умирать и цитопротекторный эффект APPJ будет значительно сокращено. Чистого гелия, вместо того, чтобы гелий смешанного с небольшим количеством O2 или воздуха, был использован. Когда используется гелий, смешанного с небольшим количеством O2 или воздуха, будет увеличиваться количество рос в плазме. Это очень трудно для постановки диагноза, когда происходят сложные плазменные химических реакций.
Будущие приложения
Стоит также отметить, что лечение APPJ был применен после индукции лишения глюкозы на SH-SY5Y клетки, указав, что APPJ могут потенциально использоваться как метод лечения заболеваний, связанных с лишением глюкозы в центральной нервной системе, особенно ишемического инсульта. Таким образом это необходимо для будущих исследований для оценки условий лечения нейропротекторной эффекта APPJ, как в одиночку, так и в сочетании с другими агентами нейропротекторной в разные периоды после лишения глюкозы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов были объявлены по отношению к этой бумаги.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в инновационный фонд Пекин нейрохирургический институт (2014-11), Национальный фонд естественных наук Китая (№ 11475019 и 81271286) и Пекине естественных наук фонда (№ 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
- Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
- Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
- Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339 (2015).
- Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005 (2012).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
- Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049 (2016).
- Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
- Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401 (2017).
- Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309 (2014).
- Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).
