Summary
本协议描述了通过肾盂向小鼠肾脏注入质粒 DNA 的方法, 以在肾脏中特异性地产生转基因表达。
Abstract
水动力注射创造了一个地方, 高压环境, 染各种组织与质粒 DNA 和其他物质。水力尾静脉注射, 例如, 是一种行之有效的方法, 肝脏可以转染。这篇手稿描述了水动力学原理的应用, 直接注射小鼠肾脏与质粒 DNA 的肾脏特异基因表达。小鼠被麻醉, 肾脏由侧面切口暴露, 紧接着是快速注射含有质粒 DNA 的溶液直接进入肾盂。针保持十秒, 切口部位缝合。第二天, 活体动物成像, 免疫印迹, 或组织化学可以用于检测基因表达, 或其他适合于转基因选择的化验方法被用来侦测感兴趣的蛋白质。发表的延长基因表达的方法包括转介导的转基因融合和环磷酰胺治疗, 以抑制对转基因的免疫应答。
Introduction
水动力尾静脉注射技术已成为小鼠肝脏中获得高水平基因表达的常用方法1,2。肾脏也被这种技术转染在一个更低的水平, 大约100倍少的3。在这里描述的水动力肾盂注射提供了一种简单的方法, 通过物理手段来控制器官表达的特异性, 使用了以前在肝脏中建立的同样的流体力学原理4,5, 肌肉6, 和其他器官7,8。此方法通过使用压力和速度将含有 DNA 的液体强制注入细胞, 同时对快速解析的器官造成损伤, 从而在活体动物体内transfects 细胞9。使用行之有效的手术技术, 通过侧面切口10可视化肾脏, 并通过胰岛素注射器单注射, 我们发现成功转染各种类型的肾细胞, 主要是间质成纤维细胞,小管, 收集管道11。解剖这些小鼠已经表明, 其他器官没有转染的水平足够高, 以可视化的荧光成像技术11。由于该技术是病毒, 使用质粒 DNA 转染允许快速和容易地制备所需的试剂注射。
我们使用局部水动力注射来表达抗氧化剂谷胱甘肽 s-转移酶 A4, 胰岛素样生长 factor-1 受体, 和激素促红细胞生成素在肾脏, 所有与预期的生物效应11,12,13. 对管理路线、注射量、DNA 用量和启动子选择的详细评估已执行11。此外, piggyBac转系统和/或环磷酰胺治疗抑制免疫反应的转基因已经显示出改善长期基因表达的结果11。其他调查人员在大鼠成功使用肾静脉途径, 在超过一个月14的时间段内实现高转染效率。然而, 由于大多数哺乳动物的遗传模型都是小鼠模型, 通常在小鼠身上进行的表型模仿人类疾病的基因矫正, 首先是作为概念验证。我们将肾静脉注射与肾盂注射进行比较, 发现肾盂注射优于肾静脉 (约十倍以上) 和存活11。肾盂是一种理想的进入肾脏的途径, 因为它具有足够的柔韧性, 能够耐受尿液生产的波动, 并且即使在肾积水期间扩张, 也能维持其结构完整性。此外, 注射到肾盂肾盂允许进入肾脏, 而不刺穿肾脏胶囊, 使注入的液体可以明显保留肾脏优于实质注射液。其他的小鼠器官除了血管以外没有其他的通路, 但肾脏的泌尿间隙是理想的注射部位。此外, 注入肾静脉导致血液渗漏到腹腔。用磁共振成像估计野生型小鼠肾脏的总肾体积约为0.2 厘米3, 因此单个肾脏的体积与肾盂水动力注入的液体量大致相等。注入 (100 µL)15。在此, 我们已经提供了所有细节的细微差别的水动力肾盂注射协议, 以实现再生转染肾脏。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了贝勒医学院和范德堡大学医学中心的机构动物护理和使用委员会 (IACUCs) 的批准。
1. 准备注射用的 DNA 溶液
- 选择质粒 (s) 仔细地表达转基因, 以最大限度的可取的特点, 以提高转染效率和转基因表达。
注: 水动力肾盂注射质粒表达荧光标记 TdTomato、激素促红细胞生成素 (Epo) 和萤火虫荧光已被描述为11。如果没有一个成熟的转基因转染效率的测定方法, 通过引入10µg 荧光表达质粒 (如增强的萤火虫荧光) 对注射用稀释的 DNA 进行荧光活动物成像。- 选择适用于应用的最小质粒。
注: 小质粒一般染细胞优于大质粒。例如, zeomycin 抗性基因和 R6K 起源的复制是很小的, 所以利用这些元素的质粒骨干将减少质粒的大小。 - 从哺乳动物的启动子中表达转基因。
注: 转染的肾细胞类型, 基因表达的长度, 以及基因表达的强度都将受到启动子的选择的影响。请参见伍达德et al。为比较巨细胞病毒 (CMV; 本构病毒), 伸长 factor-1 α (EF-1α; 本构内生), 伽玛氨转移酶 (γGT; 小管特异), 和 podocin (NPHS2; 足特异)11。 - 采用病毒积分系统如转, 如果更高的长期基因表达水平是可取的11,16。对于早期读数少于5天后的研究, 转基因的集成是不必要的。
- 选择适用于应用的最小质粒。
- 使用一种商业方法, 如无内毒素 maxiprep 试剂盒, 准备注射用质粒 DNA。小心避免通过实验室引入内毒素。
注意: DNA 溶液中的内毒素会引起动物的严重免疫反应, 损害实验并可能杀死动物。- 最后的 DNA 分离洗涤步骤完成后, 确保没有乙醇留下的视觉检查和气味。使用凝胶加载提示删除可见滴。在室温下或在37-60 ° c 的烤箱中, 将含有 DNA 颗粒的管子倒在实验室细致的任务雨刷器上。在残留乙醇蒸发后立即重, 防止颗粒 overdrying。
注: 残留的乙醇干扰了分光光度计对 DNA 浓度的读取和对肾脏的介绍是不可取的。 - 重的 dna 颗粒在相同的缓冲区, 将用于注射 (水动力传递缓冲区; 100-300 µL), 以限制在化学成分的变化, dna 缓冲溶液的组之间。
注意: 不要在试剂盒附带的洗脱缓冲液中重 DNA 颗粒。在 "TE" 缓冲制剂中常见的 EDTA 螯合剂可能影响肾脏和心血管功能。根据颗粒大小, 洗在100-300 µL 的流体动力传递缓冲器, 以达到高浓度。完全稀释的 dna 的最终浓度将介于 100 ng/µL (10 µg/小鼠剂量) 和 500 ng/µL (50 µg/小鼠剂量) 之间, 所以 dna 的浓度应该超过这一点。 - 在缓冲液中充分重 DNA 颗粒。将球团放在流体动力输送缓冲液中, 在室温下至少一小时或隔夜在4° c 前转移至无菌离心管, 以确保 DNA 完全溶解。
- 在分光光度计或另一种已建立的方法上读取质粒 DNA 浓度。
注: 读数应重复进行, 如有必要, 可进行额外的复制。如果260/280 的比率低于 1.8, 那么制剂就会受到 RNA 或其他物质的污染, 所以扔掉它, 再准备 DNA。 - 将质粒 dna 悬浮在-20 ° c 的注射缓冲液中, 放入一个手动除霜冷藏箱内, 以避免 dna 的降解。
注: 以这种方式储存, DNA 制剂将持续多年。通过限制消化和琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 的完整性。被涂抹在车道上的 dna 已经退化, 不能使用, 而产生正确大小的脆带的 dna 可以用于注射。
- 最后的 DNA 分离洗涤步骤完成后, 确保没有乙醇留下的视觉检查和气味。使用凝胶加载提示删除可见滴。在室温下或在37-60 ° c 的烤箱中, 将含有 DNA 颗粒的管子倒在实验室细致的任务雨刷器上。在残留乙醇蒸发后立即重, 防止颗粒 overdrying。
- 准备稀释的质粒 DNA 溶液注入肾盂。
注意: 请仔细考虑控制组。对于许多研究而言, 由于注入本身会导致损伤, 并可能影响实验结果11, 因此包含了单纯的、仅注射的控制。- 在室温下, 将无内毒素的 DNA 洗解冻在工作台的常温下。
- 计算注射所需的 dna 数量, 并为每个组准备稀释的 dna。管理10-50 µg 的质粒 DNA 带到总体积为100µL 与水动力传递缓冲每只老鼠。
注: 举一个例子, 计算为3只老鼠注射10µg/小鼠的 DNA 质粒, 浓度为0.5 µg/µL 如下。- 准备足够多的 DNA 溶液, 以增加大约20% 的注射器和针头中的死亡空间。为3只老鼠, 准备一个混合在3.5x。计算出溶液中µg 的 DNA 质量。这里将是10µg x 3.5 = 35 µg。
- 计算每只老鼠注射100µL 所需的总溶液量。在这种情况下, 它将是100µL x 3.5 = 350 µL 总体积。
- 计算量的股票质粒 DNA 添加到解决方案。在这种情况下, 它将是35µg/0.5 µg/µL = 70 µL 的股票质粒 DNA。
- 通过减去所需的稀释 dna 总量 (步骤 1.3.2.2), 计算添加到稀释 dna 溶液中的缓冲体积 (步骤 1.3.2.3)。在这种情况下, 它将是350µL-70 µL = 280 µL 流体输送缓冲器。
- 在实验室的长凳上使用无菌技术的商用过滤器技巧, 在无菌离心管中制备溶液。
注: DNA 溶液可在室温下制备并贮存于当日发生的注射剂。不要给老鼠注射感冒溶液, 因为这样会降低体温, 但变暖是不必要的。
2. 进行水动力肾盂注射手术
- 仔细挑选老鼠做手术。
注意: 应变特异性的差异尚未被观察到, 但可能是可能的。大多数注射都是在 C57BL/6 或 FVB 的背景。肾盂注射在6-12 周大的小鼠中作用最好。在超过16周的小鼠中, 荧光成像的失败率高达 50%, 原因不明。与年龄相关的失败率已被观察到的水动力尾静脉注射到肝脏, 所以这可能是一个普遍限制与水动力注射的原则。沿着同样的路线, 其他人已经表明, 水动力尾静脉注射到纤维化大鼠肝是不一样的有效的健康肝, 所以它可能是可能在肾脏纤维变性的设置肾水动力注射不会是有效的, 但未直接测试17。 - 为手术准备小鼠和 DNA 注射器。
- 用氯胺酮和嗪麻醉老鼠。
- 使用动物设施所需的正确个人防护设备, 如一次性实验室围裙、手术面罩和腈手套。
- 一次与2-4 只老鼠一起工作, 在500毫升的塑料烧杯中对每只老鼠进行称量, 精确到0.1 克. 计算在正常2生理盐水中稀释的24毫克/毫升氯胺酮和0.9% 毫克/毫升嗪的正确用量, 以腹腔注射对每只小鼠进行管理 (请参阅更多关于腹腔注射的参考视频)18. 使用公式 (50 µL + (5 µL) x (重量 (g)), 或者在与当地兽医团队和 IACUC 协商后根据另一个公式计算。
- 通过腹腔注射的标准技术注入鼠标。将鼠标放在纸桶中, 直到鼠标静止不动。
注意: 小鼠已经准备好接受手术, 当它们不再对脚趾夹紧试验做出反应时。给小鼠在最初注射20-60 µL 后, 继续对脚趾夹紧试验进行20-30 分钟的反应, 这取决于反应的强度。 - 将鼠标放在一个 water-circulated 的热垫上, 用蓝色的垫子覆盖, 并在两眼中放置兽医软膏, 以防止角膜干燥。
- 将鼠标背部的左侧从肩部刮到臀部, 然后用剃须刀为宠物梳洗设计。去掉松散的毛发和碎屑。
- 准备一个单独的注射器, 其中含有100µL 稀释的 DNA 为每个麻醉鼠标, 确保没有气泡。
- 使用无菌 29G x ½ "0.5 毫升 U-100 胰岛素注射器与永久连接的针头没有安全。
注: 注射器类型是至关重要的。这个量规可以快速注射。永久连接的针防止溶液泄漏。安全的存在会阻碍肾盂的进入。在材料表中指定的注射器在注射过程中比其他品牌测试时滑动更均匀。 - 将注射器装入〜120µL, 并拉下柱塞, 在顶部创建一个空间。用笔敲击, 直到所有气泡上升到顶部。拿起针, 小心地压低活塞, 以消除所有的空气, 直到一滴形成在针尖的针头。不应该有任何可见的气泡存在, 因为这些可能会导致空气栓塞, 将杀死动物。
- 完成压抑的活塞, 直到有100µL 在注射器通过排空过剩的 DNA 溶液到原来的离心管。如果必要的话, 小心地贴上标签, 在不育的褶皱上放置装满的注射器以保持不育, 如果正在进行工作的设施不允许扼要针。
- 使用无菌 29G x ½ "0.5 毫升 U-100 胰岛素注射器与永久连接的针头没有安全。
- 用氯胺酮和嗪麻醉老鼠。
- 进行注射手术。
- 准备手术现场将无菌的褶皱放在热垫上, 将无菌的手术工具放在无菌的褶皱上, 而不接触它们。拿起鼠标, 并把它放在视野。调整照明以照亮区域。
- 去除三3.15% 氯己定的葡萄糖酸和70% 异丙醇皮肤防腐拭子的包装和地方附近的动物。
- 换上无菌手术手套。在切口部位开始的圆周运动中, 用一种新的洗必泰/乙醇拭子擦拭动物三次。
- 找到切口站点, 如图 1A所示。用镊子捏皮肤, 用剪刀使皮肤层从脊柱和胸腔下面的大约1厘米的伤口。一旦切割网站约1厘米长, 做一个类似的切割网站下面, 在肌肉层。
注意: 使切口的长度正确, 使肾脏勉强通过切口, 然后由切口本身保持到位。切口太小, 肾不能外露;太大, 肾脏会不断地滑回腹腔。 - 找到肾脏
注意: 它可能是可见的白色脂肪组织。脾脏也位于动物的左侧。这些器官的颜色可以视觉上被区分, 因为脾脏是黑暗的栗色, 而肾脏是深红色橙色。这是不可取的操作脾, 因为它可以很容易破裂。 - 在不接触肾脏的情况下, 通过手指 (图 2C) 将稳定、轻柔的压力放在腹部, 轻轻地将其暴露在腹腔内。如有必要, 用闭合的镊子轻轻地将不需要的器官推回腹部。不要使用开放式镊子, 因为这可能会损害肾脏或其他器官。
- 一旦肾脏脱离了腹部, 轻轻地将它从周围的脂肪中分离出来, 就足以形象化肾盂, 一个小白点 (图 1B)。将多余的脂肪推到一边或在必要时移除。请务必不要切除肾上腺, 位于靠近肾脏的顶极, 或肾脏胶囊。
- 使用闭合钳向下推肾右侧, 使肾盂保持在视线内, 抓住负载胰岛素注射器与右手和握住它平行的工作表面与针指向在肾盂 (图 2E)。将针小心地插入固定肾脏的肾盂, 如图 1B所示。
- 在三秒内快速注入解决方案。约1/3 的肾脏可以清除和改变颜色的白色。
注: 在注射后肾囊内的液体积聚以及血肿的形成是常见的。为了达到足够的 DNA 转染水平, 需要进行一些损伤检测。 - 保持针到位约十年代, 以防止回流的解决方案。然后小心地慢慢地取出针。通过轻轻伸展切口部位并使用闭合钳将器官返回腹腔。
- 用5-0 可吸收的缝合线缝合动物的肌肉层, 放置2-4 独立的结。
- 缝合动物的皮肤层与5-0 或6-0 吸收尼龙缝合线, 放置2-4 独立结。
注: 在放置无菌珠浴后, 手术工具可重新使用, 并冷却下来。
图1。正确的切口位置和针放置的水动力肾盂注射.A) 切口 (红线) 应位于大约1厘米, 从脊柱和约1厘米以下的小鼠的胸腔。B) 肾脏通过侧面切口显露后, 肾盂应位于肾脏中间的一个小的淡黄明/白点。注射不应干扰肾静脉、肾动脉或输尿管。胰岛素注射器的针直接插入肾盂, 显示深度约0.5 厘米, 并迅速在2-3 秒抑郁症.请单击此处查看此图的较大版本.
图2。手术步骤进行肾盂水动力注射质粒 DNA.a) 钳捏皮肤, 让外科医生用手术刀做一个1厘米的侧面切口, 首先通过皮肤层, 然后通过肌肉层。B) 用两对闭合钳打开手术伤口, 如果可能的话, 肾脏在腹部可视化。C) 在腹部轻轻按压, 不直接接触任何器官, 肾脏通过侧面切口显露。D) 从肾脏轻轻地切开脂肪, 尽可能少地扰乱肾, 以获得肾盂。E) 按压左侧肾脏的右侧以更好地显示肾盂, 注射器用拇指放在降压剂上, 针小心而牢固地放在肾盂中。F) 在 < 3 s 注射液后, 可在接受大部分注射的肾脏区域观察到清除。G) 无菌紫乔可吸收缝合线用于在肌肉层中制造2-4 独立结节。H) 无菌的蓝色尼龙吸收缝合线用于在皮肤层中制造2-4 独立的结。请单击此处查看此图的较大版本.
- 从手术和术后监测中恢复。
- 根据机构对疼痛控制的 IACUC 要求, 为小鼠提供镇痛药。例如, 如果要避免药相关的肾脏损伤, 则每8-12 ĥ皮下注射丁丙诺啡, 术 48 h。
- 将小鼠放在热垫上, 由调查员参加, 直到完全移动胸骨卧床。当完全恢复时, 将小鼠返回到一个干净的笼子里, 从笼中放少量的寝具, 以减少压力。不要把老鼠放在小老鼠的手术里。
注意: 小鼠的病情会迅速改善, 在24-48 小时内出现正常行为。 - 给那些看起来有压力的小鼠提供生理盐水和增加镇痛剂以改善他们的病情。如果小鼠不能快速恢复, 测量鼠标重量, 并安乐小鼠已经失去了超过20% 的初始体重。安乐小鼠出现尿毒症或其他垂死。表 1中详细介绍了可能存在的健康问题。
注意: 小鼠有时会移除外缝合线或缝合线在伤口闭合前松动。不完整的皮肤层的肌肉层缝合不良会导致切口部位出现疝, 显示为凸出。在这种情况下, 将鼠标置于麻醉下 (异氟醚比氯胺酮/嗪快), 并尽快修复新的缝合线的手术部位。如果吸收皮肤缝合10-14 天后仍然保持, 取出。有时老鼠可能会移除笼友的缝合线或打斗。将攻击小鼠移到自己的笼子里, 以防止它们在发现这种行为后伤害其他老鼠。 - 当健康或实验终点达到时, 用二氧化碳吸入或异氟醚过量安乐小鼠, 其次是根据安乐死的标准手术程序的第二种安乐死方法, 如颈椎脱位地方在机关
| 因为 | 发病 | 受影响的老鼠数量 | 症状 | 立即行动 | 长期解决方案 | ||
| DNA 含有内毒素 | 6-40 小时后。 | 可能会影响到每一个被污染的 DNA 准备的老鼠。 | 呼吸问题, 严重疼痛的征兆, 器官衰竭, 死亡。 | 安乐受影响的老鼠。检查每一个注射成分的内毒素与鲎试剂裂解。 | 使用内毒素无 maxiprep 试剂盒, 只有无菌和新的或氢氧化钠处理的实验室。使用商业购买的内毒素测试的缓冲液来稀释 DNA。 | ||
| 麻醉过量 | 在手术过程中, 无论是在 DNA 注射之前还是之后。 | 可能只影响更年轻, 更小, 或更瘦的老鼠。 | 在加热垫、排尿时停止呼吸。 | 减少剩余小鼠的麻醉。 | 双重检查准备和协议为药量准确性。排除 "小鬼"。如果使用适当剂量, 请咨询兽医。 | ||
| 注射用注射器或针头中的气泡 | 肾盂注射后立即。 | 除非所有的注射器不小心加载, 这只会影响一只老鼠。 | 喘口气。 | 检查剩余的注射器是否有气泡的迹象。 | 仔细准备注射器, 敲击注射器以除去底部的气泡。改善照明条件, 以更好地可视化气泡。 | ||
| 手术部位的开放性 | 12-72 h 后 | 一个或多个鼠标。有时整个笼子。 | 裂开的伤口, 通常没有其他的苦恼 | 重复缝合, 在异氟醚麻醉下, 用无菌技术仔细修复伤口。可能需要用盐水冲洗, 或者用剪刀把伤口的边界去掉。 | 如果所有的小鼠都有非常短或缺失的缝合线, 可能会有一只老鼠将它们移除, 这样老鼠就可以分开了。改善缝合技术。使用独立节点。 | ||
| 手术部位疝 | 48 + h 后 | 一个或多个鼠标。 | 丘在外科手术部位可见。 | 在异氟醚麻醉下采用无菌技术, 切开愈合后的皮肤, 显露肌层疝。在腹膜中更换器官, 用可吸收的缝合线修复肌肉层, 并关闭该部位。 | 这表明肌肉层的缝合不良。改善缝合技术。使用独立节点。 | ||
| 肾衰竭 | 48 + h 后 | 一个或多个鼠标。 | > 20% 的体重下降, 可能成为尿毒症, 驼背的姿势 | 提供生理盐水, 增加或延长镇痛。如果没有发现改善, 牺牲受影响的小鼠。 | 改变动物的疾病状态, 使其不那么严重。改变转基因不太强或诱导。在疾病进展的早期 timepoint 注射小鼠。 | ||
| 脓肿或感染 | 手术后几天到几周 | 一个或多个鼠标。 | 可扪的脓肿或脓毒症的迹象 | 安乐受影响的老鼠。请求尸检确认疑似感染。 | 这可能发生在手术条件和注射没有足够的无菌。所示的程序是对正常免疫系统的小鼠, 但必须采取进一步的预防措施, 在设置免疫功能低下的动物, 如那些处理环磷酰胺。 | ||
表1。表肾盂注射方案中可能遇到的健康问题.虽然列出的健康问题并不常见, 但在过程中可能会出现一些与调查人员有关的错误。这一表可能有助于预防和诊断健康问题, 以及执行可能的补救措施, 防止今后发生这种问题。在实践中, 调查人员应该期望不常见的健康问题和死亡率由于程序。
3. 评估注射效率和转基因效果
- 对所需的转基因进行成熟的检测, 以评估转染效率。仔细使用正负控制, 以确保化验是具体的。
注意: 根据启动子的选择, 小鼠在1天可能有最强的转基因表达;总是在注射后的第一周内。 - 通过引入10µg 荧光表达质粒 (如增强的萤火虫荧光) 对稀释后的 DNA 进行注射, 对荧光进行活体动物成像。
- 清洁所有暴露于老鼠的表面。将小鼠的第一笼放入室内, 并将其密封。通过检查量具确保有足够的异氟醚进行实验;如果没有, 添加异氟醚, 直到水平达到 "最大" 线。启动异氟醚的流动, 把异氟醚的表盘转到 3.5, 氧气到2。
- 将每只小鼠腹腔注射100µL, 解冻30毫克/毫升素。记录时间。
- 打开软件, 通过单击橙色和黄色鼠标图标来控制成像设备。在 "选择/添加用户 id" 下, 从 "用户 id" 旁边的下拉菜单中选择正确的缩写。单击 "确定"。在顶部菜单栏上, 单击 "获取", 然后从下拉菜单中选择 "自动保存到..."。选择该文件夹或创建一个新文件夹以将数据保存到。
- 转到右下角的图像采集框。检查自动设置如下: 分, 中等;F/停止, 1 为发光, 8 为照片;发射过滤器, 开启;成像模式, 检查旁边的发光, 照片, 叠加, 和对齐只。单击 "初始化" 以初始化系统并等待初始化完成, 然后将 "视图字段" 更改为 "E" 以图像五鼠标。
- 打开麻醉油管的阀门, 使机器内的 nosecones 管理异氟醚。将动物放在成像机内, 并在他们的胃上, 他们的背部面对摄像头, 以可视化肾脏。如果要对一个以上的笼子进行成像, 将下一个笼子放进异氟醚室。
- 5-10 分钟后素注射, 按 "获取" 图像。
- 在右侧的 "工具调色板" 上, 单击 "图像调整"。在 "颜色标尺" 之下, 减少 "Min" 酒吧直到表示是明显的在所有期望小鼠, 形象化象紫色在每只老鼠肾脏。如果任何老鼠不显示表达, 注入的小鼠与100µL 的素和等待至少3分钟前重新。
- 如果图像具有饱和像素, 则由于饱和像素的存在会导致对转染效率的低估, 减少曝光时间和重新获得图像的数量。尽可能低的曝光时间是0.5 秒。
- 如果图像在第一次曝光时仅显示微弱的基因表达, 则增加曝光时间2分钟, 重新获取。每次夺回图像时, 数据都自动在所选的文件夹中, 以便以后所有图像都可以进行进一步分析。
- 对随后的老鼠笼重复成像步骤。
- 从成像机中取出鼠标。关掉煤气清洁房间, nosecones 和成像阶段。关闭计算机程序。
注: 软件将要求 "保存数据集"。这是指对数据集所做的操作, 而不是对其本身的操作。- 单击 "是" 以保存对比例和感兴趣区域 (roi) 的更改。单击 "否" 可恢复为图像的原始设置。
- 对于数据分析, 请打开软件。在 "工具调色板" 上单击 "ROI 工具"。单击圆圈图标, 然后在下拉菜单中单击 "1", 在图像窗口中放置一个新的 ROI, 其周围有四平方的红色椭圆表示。调整投资回报率的大小, 将鼠标光标放在红色方块上, 然后拖动以将紫色区域覆盖在注入的肾脏上。
- 当光标悬停在 roi 的红色方块上时, 右键单击, 然后选择 "重复 roi" 以在图像窗口中创建新的 roi, 并将其移动到下一鼠标。重复这个过程, 直到图像中的所有小鼠都对注入的肾脏有一个 ROI。
- 在直接位于图像上方的菜单中, 将 "单位" 从 "计数" 改为 "发光 (光子)"。要导出 roi 数据, 请在 "工具调色板" 中单击 "roi 工具", 然后单击 "铅笔/标尺" 图标以创建测量的电子表格。在数据分析和统计方案的选择中, 使用 "平均亮度" 测量进行进一步分析。
- 按描述的11执行剖面着色。
注: 注射不染整个肾脏相等地, 因此不同的部分将获取不同的转染效率11。像荧光乳胶微球这样的珠子的共注射可能有助于确定预期为转基因阳性的区域 (图 3D)11。染色方案的优化是非常重要的。 - 在转染肾脏中进行免疫印迹, 以确定感兴趣的基因。
注: 蛋白质提取器官的收获必须在冰上进行。再次, 不要使用一小部分的器官, 因为这个区域可能没有被转染好。转染是不均匀分布在整个器官, 所以结合不同的区域和池。肾盂水动力注射质粒生成激素促红细胞生成素导致红细胞压积适度升高, 因此有望在循环11中发现分泌的转基因产品。 - 对于转基因的长期高层次表达, 结合环磷酰胺等免疫抑制剂的积分向量系统。对转基因的免疫反应发生在注射后的最初几个星期, 并且是健壮的11。
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Representative Results
手术和注射技术是简单的执行一旦掌握, 不需要主要设备或昂贵的材料。如果新的侧切口肾脏手术, 一个训练日在几个老鼠计划为安乐死应该允许在哪些小鼠没有恢复在手术以后, 因为第一次尝试在这个手术可能比正常花费更长的时间。另外, 熟悉类似技术的调查人员可能会发现它很简单。请仔细按照图 1中的插图和图 2中的图案方向进行。为了正确地放置切口, 外科医生可以用手指把老鼠的胃推到它的一侧。肾脏是由一个小肿块, 上升附近的脊柱与温和的腹压, 和切口应该在这个区域 (图 1和图 2)。重要的是, 使切口通过皮肤和肌肉层的正确大小 (图 1)。如果切口太大, 肾脏会轻易滑回腹腔, 使注射困难。如果切口太小, 就很难将肾脏从腹腔内推出, 器官损伤就会发生。另一个重要的一点是在肾盂放置针。外科医生应该用闭合的钳把肾脏压下来, 然后在与工作表面平行的角度将针插入肾盂, 这样大部分的注射量就会直接进入肾脏实质 (图 2)。重要的是要尽快进行注射, 以诱导肾转染所需的水动力压力。
不同品系、年龄、体重和/或性别的小鼠在肾脏的位置和肾脏周围的脂肪数量上有差异, 因此可能需要进行一些调整来与感兴趣的小鼠合作。如果可能, 第一次手术的尝试, 从其中恢复小鼠应包括立即读出肾脏特异基因表达, 如荧光成像 (图 3A)。如果使用小鼠, 预期的结果是, 所有的老鼠将有一个亮度在一个数量级 (图 3B)。有时, 即使在第二次注射素, 它是明显的成像, 老鼠或小鼠没有成为转染的水平比其他人或一些注射小鼠甚至完全缺乏基因表达。由于转基因分娩失败, 这些小鼠可能被排除在研究之外。如果许多小鼠缺乏基因表达, 那么外科医生应该减少注射 DNA 溶液的时间。由于注射的高压而未能引起必要的损伤, 是基因表达持续缺乏的最可能的罪魁祸首。在手术后, 应仔细监测小鼠的潜在健康问题 (见表 1 , 以解决潜在的健康问题, 并在必要时与该机构的兽医小组进行协商)。在最初的训练期之后, 手术本身的时间应该少于十分钟。手术期应尽可能短, 每次操作一只老鼠, 以防止组织在手术过程中脱水。这一过程的大部分时间是由于氯胺酮/嗪麻醉的诱导和恢复。作为一个团队工作的两个经验丰富的人员应该每天进行多达十次的手术, 其中十五是合理的最大值。
研究人员应该期望在注射后的头几天内, 少量的细胞对转基因有很高的阳性反应。这些阳性细胞将在注射液渗入肾脏 (图 3C-d) 周围区域的修补程序中进行本地化。肾脏的某些部分对转染细胞是完全阴性的。这种负性区域也将缺乏红细胞, 并有完全正常的组织学, 因为注射没有达到这些地区。染色协议和促进剂应仔细优化, 以捕获基因表达。研究人员应预期, 转染的细胞类型将是可变的, 基因表达水平在低比例的细胞中的转染很高, 和细胞内的蛋白质的本地化可能不会如预期的, 由于高水平的表达式 (图 3D)。
图3。水动力肾盂注射导致荧光和 TdTomato 肾特异基因表达.(a) FVB 7-8 周的老年雄性小鼠接受了水动力肾盂注射20µg pTEeL, 一种质粒表达增强萤火虫荧光从 EF-1α启动子。小鼠 2, 3 和5也注射了20µg 的荧光报告质粒。(B) 从 (A) 中所示的小鼠获得的亮度的点图。(C 和 D)只给小鼠提供了流体动力学传递缓冲器 (C) 或 (D) 荧光微球 (亮绿点) 和 pEF1α-TdTomato 表达红色荧光记者 TdTomato 从 EF-1α启动子。tetragonolobus 凝集素 (LTA; 绿色) 染色, 用抗 RFP 抗体染后显示转染细胞, 以放大 TdTomato 信号 (red)。细胞核被 DAPI (蓝色) 染色。(C) 和 (D) 中显示的图像是 13.2 mm x 17.5 mm. 误差线表示平均值的标准误差。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本协议中, 描述了一种在肾脏中专门实现可再生基因表达的健壮方法。在一位经验丰富的外科医生的手里, 我们发现被这种技术转染的老鼠的比例在50-100% 的范围内, 这取决于老鼠的年龄和转基因的读数的敏感性。在接受piggyBac转的小鼠中, 荧光基因表达的水平超过了几个月的背景, 并在接受相同转11的免疫缺陷小鼠中完全保持了几个星期。尽管许多细胞在注射部位附近的转基因区域中染色明亮, 但总转染效率相对较低 (图 3D)。最重要的材料, 以达到预期的结果是注射注射器本身。这必须是一个 29G x ½ "胰岛素注射器与附加针头和没有安全阻碍注射。注射必须快, 在三秒内。质粒 dna 的制备应是纯的, 具有非常低的内毒素和细菌基因组 dna 水平19。
可以想象, 注射其他物质, 如 RNA, 病毒, 或蛋白质, 可能以类似的方式进行。肾盂的优势, 作为进入其他注射部位的试验, 如肾静脉或直接注射肾实质。那些注射导致了流血和更低的基因表示11。因为肾盂是一种弹性结构, 有时需要举行尿液回流, 它可能更好地伸展和容纳针。没有观察到 DNA 溶液或尿液从胰岛素注射器所产生的孔中渗漏, 这表明肾盂被迅速修复。例如, 注射液 transfects 肾脏的确切机制没有深入研究, 就像对肝脏一样。未来的电子显微镜研究可以进一步阐明这一机制。注射的逆行性质优先于水动力尾静脉注射法逆转肝静脉的流量20和其他成功的肾脏转染方法通过肾静脉注入12,13,14,21. 可能需要肾脏损害的最佳转染效率, 所以我们假设, 转染发生通过对细胞膜的破坏造成的快速, 大容量注射。足、小管、集气管均与尿液空间直接接触, 其主要功能是过滤和浓缩尿。
虽然可再生和肾脏特异, 这种方法是有限的相对较低的转染效率观察 (图 3D)。水动力肾盂注射不是一个替代发明的转基因动物驱动从肾脏特定的启动子, 其中每个细胞的某一亚型的动物将表达的基因感兴趣。相反, 这种方法最适合于基因转移方法的疾病, 其中少数纠正细胞将有戏剧性的影响的表型, 分泌激素或其他物质通常由肾脏产生, 或创建稀有细胞的数量对肾脏的修复或再生有一定的积极作用。另外, 它也可以用相反的方式来发展一个新的肾脏损伤模型, 引入一个具有负面影响的转基因。
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Disclosures
作者没有任何披露和声明没有利益冲突。
Acknowledgments
退伍军人事务部的职业发展奖 [BX002797] 支持 L.E.W. 和国立卫生研究院 [R01-DK095867] 和美国心脏协会 [15GRNT25700209] 支持 j。c国立卫生研究院 [DK093660], 退伍军人事务部 [BX002190] 和范德比尔特肾脏疾病中心支持 M.H.W。这种材料是在弗吉尼亚州田纳西河谷医疗保健系统资源和使用设施的支持下工作的结果。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic - Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia - Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads - 15" x 21" - need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic - Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
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