Summary
このプロトコルでは、具体的には腎臓における導入遺伝子発現を生成する腎盂を介してマウス腎臓にプラスミド DNA を注入する方法をについて説明します。
Abstract
流体の注入は、プラスミド DNA や他の物質と様々 な組織を使ってローカル、高圧環境を作成します。流体尾静脈注射、たとえば、肝臓を導入することができます確立された方法です。この原稿では、マウス腎臓腎臓特異的遺伝子発現のプラスミド DNA の直接注入による流体力学的原則の適用について説明します。マウスを麻酔し、腎臓、腎盂に直接プラスミド DNA 含有溶液の高速注入が続いて側腹部切開によって公開されています。針は 10 秒の場所に保管し、切開部位を縫合します。次の日、ライブ動物イメージング、遺伝子発現を測定するために使用可能性があります西部のしみまたは免疫組織化学または興味の蛋白質の検出選択の遺伝子に適した他のアッセイを使用します。遺伝子発現を延長する公開されたメソッドには、遺伝子に免疫応答を抑制するトランスポゾンを介した遺伝子統合およびシクロフォスファミド治療が含まれます。
Introduction
流体の尾静脈注入法マウス肝1,2遺伝子発現の高いレベルを達成するために一般的に使用される方法となっています。腎臓は、はるかに低いレベル、約 100 以下3でこの手法によっても transfected します。ここで説明した流体力学的腎盂インジェクションは肝4,5 以前確立されている同じ流体力学的原則を使用して物理的な手段によってオルガン式の特異性を制御する簡単な方法を提供します。、筋肉6、および他の器官7,8。このメソッドは、圧力を使用して、生きた動物体内で細胞を transfects し、同時に、すぐに臓器への損傷を誘発する細胞に含まれている DNA の流体を強制的にスピード解決9。インスリン注射器で注射と一緒に逃げ面切開10を介して腎臓を視覚化する確立された手技を使用して、さまざまな種類の腎臓の細胞、主に間質細胞の成功したトランスフェクションを発見しました。細管と収集の管11。これらのマウスの解剖は、他の臓器がイメージング テクニック11ルシフェラーゼによる可視化するのに十分高いレベルでトランスフェクションいないことを示しています。技術は非ウイルス性なので、transfection のためプラスミッド DNA の使用は注入に必要な試薬を高速かつ簡単に準備を許可します。
抗酸化物質グルタチオン S トランスフェラーゼ A4、インスリン様成長因子-1 受容体と期待される生物学的効果11,とすべての腎臓のホルモンのエリスロポエチンを表現するのにローカライズされた流体の注射を使用しています。12,13。 プロモーター選択 DNA 投与量、注入量の管理のルートの詳細な評価が実行される11をされています。さらに、両方piggyBacトランスポゾン システムおよび/またはシクロホスファミド治療遺伝子を免疫反応を抑制するためは、長期的な遺伝子発現の結果11を改善するために示されています。他の研究者は、1 ヶ月14より大きいの期間の高いトランスフェクション効率を達成する成功をラット腎静脈アプローチを使用しています。しかし、人間の病気を模倣した表現型の遺伝的補正通常実行されますマウスの最初概念実証として以来、ほとんどの哺乳類の遺伝学的モデルは、マウス モデル。我々 は腎静脈注射腎盂注入を比較し、腎盂への注入が遺伝子発現 (約 10 倍高い) と生存11腎静脈よりも優れていたことを発見します。腎盂は腎臓への参入の理想的なルートは、尿の生産の変動を許容する柔軟性が、水腎症の間に拡張した場合でもその構造の整合性を維持することがしばしばです。また、腎盂への注入は、野末注入より腎臓によって保持される目に見えないに体液が注入された腎被膜のピアスをせず腎臓へのアクセスを許可しました。他のマウスの臓器、血管以外のエントリのルートを持っていないが、腎臓の尿の空間は理想的な注射。また、腎静脈への注射は腹腔内に血液の漏れになりました。野生型マウスの腎臓の全腎容積単一の腎臓のボリュームは流体によって腎盂流体注入量とほぼ等しいので、約 0.2 cm3、磁気共鳴画像と推定されています注入 (100 μ L)15。ここで、利用可能にした腎臓の再現可能なトランスフェクションを達成するために流体力学的腎盂注入プロトコルの詳細なニュアンスのすべて。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアと薬の Baylor の大学、ヴァンダービルト大学医療センターの使用委員会 (IACUCs) によって承認されています。
1. 注射用 DNA の解決を準備します。
- トランスフェクション効率と遺伝子発現の向上に望ましい特性を最大化するために慎重に transgene(s) を表現する plasmid(s) を選択します。
注: TdTomato 蛍光マーカー、ホルモンのエリスロポエチン (Epo) とホタルのルシフェラーゼを表現するプラスミッドの流体力学的腎盂注入は前述11をされています。遺伝子のトランスフェクション効率のよく発達したアッセイはない、希薄 DNA 注入のために強化されたホタルのルシフェラーゼなどルシフェラーゼ発現プラスミドの 10 μ g を導入することによってルシフェラーゼのライブ動物イメージングを実行します。- 実用的なアプリケーションには、最小のプラスミドを選択します。
注: 小さいプラスミッドはセルの大型プラスミドより一般的に transfect します。たとえば、zeomycin 耐性遺伝子と複製の R6K 起源、小さな、プラスミドのサイズを小さく、プラスミド バックボーンでこれらの要素を利用しました。 - 哺乳類のプロモーターから遺伝子を表現します。
注: 腎細胞型 transfected で遺伝子発現の長さと遺伝子発現の強さすべて受けますプロモーター選択。ウッダードらを参照してください。サイトメガロ ウイルスの比較について (CMV 構成; ウイルス)、伸長因子 1 α (EF 1 α; 構成内因性)、ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼ トランスフェラーゼ (γGT; 尿細管固有) と podocin (NPHS2; ポドサイト固有)11。 - 望ましい11,16長期発現量が高い場合は、トランスポゾンなどの非ウイルス性統合システムを採用してください。投与 5 日後より早いリードアウトと研究、transgene の統合は必要ではありません。
- 実用的なアプリケーションには、最小のプラスミドを選択します。
- エンドトキシン maxiprep キットなど商業法を用いた注射用プラスミド DNA を準備します。実験器具を介してエンドトキシンの導入は慎重に避けます。
注: DNA の解決のエンドトキシンの存在実験を損なうこととおそらく動物を殺す実験動物に重篤な免疫応答を引き出すでしょう。- 最後の DNA 分離洗浄ステップの完了後、目視及び臭気によりエタノールが残っていないことを確認します。ゲルの読み込みヒントを使用すると、目に見える水滴を削除できます。逆さまの研究室繊細なタスク ワイパー組織常温または常時監視で 37-60 ° C のオーブンで DNA の餌を含んでいる管を乾燥させます。ペレットのオーバードライを防ぐために残留エタノールが蒸発した後にすぐにペレットを再懸濁します。
注: 残留エタノール DNA 濃度の分光光度計読書と干渉し、腎臓への導入は望ましくありません。 - インジェクション (流体配信バッファー; 100-300 μ L) グループ間 DNA バッファー溶液の化学組成の変化を制限するために使用される、同じバッファーに DNA ペレットを再懸濁します。
注: はない、キットに付属している溶出バッファー溶液中 DNA ペレットを再懸濁します。キレート剤 EDTA"TE"バッファー準備で一般的に見られる可能性があります腎と心血管機能に影響を与えます。ペレットのサイズに応じて高濃度を達成するために流体配信バッファーの 100-300 μ L の溶出します。100 ng/μ L (10 μ g/マウス線量) と 500 ng/μ L (50 μ g/マウス線量) の完全希薄化 DNA の最終濃度になりますので、ストックの DNA 濃度はこれを超える必要があります。 - 完全にバッファーに DNA ペレットを再懸濁します。DNA が完全に解散したことを確認する滅菌 microfuge の管に転送する前に 4 ° C 1 時間以上室温でまたは一晩元管内流体配信バッファーでペレットを残します。
- 分光光度計または別の確立された法によるプラスミド DNA 濃度を読み取る。
注: 必要に応じて、測定値は追加の複製と複製で行う必要があります。260/280 比が 1.8 以下の場合準備が RNA に汚染されてまたは別の物質はのでそれを破棄し、再び DNA を準備します。 - ストア プラスミド DNA のマニュアルでは、ボックス内の-20 ° C で注入バッファーで再停止される解凍 DNA の分解を避けるために冷凍してください。
注:、この方法が格納されている、DNA の準備は多くの年のために続きます。制限のダイジェストと agarose ゲルの電気泳動によって DNA の整合性を確認します。車線の下塗られる DNA が劣化して、正しいサイズの鮮明なバンドを生成する DNA は、注入に使用できますは使用できません。
- 最後の DNA 分離洗浄ステップの完了後、目視及び臭気によりエタノールが残っていないことを確認します。ゲルの読み込みヒントを使用すると、目に見える水滴を削除できます。逆さまの研究室繊細なタスク ワイパー組織常温または常時監視で 37-60 ° C のオーブンで DNA の餌を含んでいる管を乾燥させます。ペレットのオーバードライを防ぐために残留エタノールが蒸発した後にすぐにペレットを再懸濁します。
- 腎盂への注入のため希釈プラスミド DNA 溶液を準備します。
メモ: コントロールを検討して慎重にグループ化します。多くの研究の注射そのものの損傷を引き起こし、11実験結果に影響を与える可能性がありますので、世間知らずとバッファー注入専用コントロールが付属。- ベンチに常温流体配信バッファーで溶出エンドトキシン フリー DNA を解凍してください。
- 注射に必要な DNA の量を計算し、グループごとに希釈した DNA を準備します。10-50 μ g のプラスミド DNA マウスあたり流体配信バッファー 100 μ L の総ボリュームになったを管理します。
注: たとえば、0.5 μ g/μ L の濃度がある DNA のプラスミッドの 10 μ g/マウスでマウス 3 を注入するための計算通りです。- 約 20% 注射器や針のデッド スペースの読み込みのための余分を持っている十分な DNA 溶液を準備します。3.5 でミックスを準備 3 マウスの x。解決策はあるべき μ g の DNA の質量を計算します。3.5 = 35 x 10 μ g であろうここで μ g。
- マウスあたり 100 μ L 注入の望まれる解決の合計量を計算します。この場合、× 3.5 = 350 100 μ L であろう μ L 容量。
- ストック プラスミド DNA ソリューションに追加する量を計算します。この場合、それは 35 μ g になる/0.5 μ g/μ L = 70 μ L 在庫プラスミド DNA の。
- 目的 (手順 1.3.2.2) 希薄 DNA 量から DNA を追加 (ステップ 1.3.2.3) 株式の量を減算して希釈した DNA 溶液に追加するバッファーのボリュームを計算します。この場合、350 μ L - 70 μ L であろう 280 μ 流体配信バッファーを =。
- 市販フィルター ピペット チップを用いた実験室ベンチで無菌の滅菌 microfuge の管でソリューションを準備します。
注: DNA ソリューション可能性があります準備し、その日に発生する設定注射用常温保存します。これは自分の体温を下げるが、温暖化は必要ではありません、冷溶液とマウスを挿入しません。
2. 流体腎盂注入手術を行う
- 手術のために慎重にマウスを選択します。
メモ: ひずみに固有な相違はみられていないが可能性があります。ほとんどの注射は、C57BL/6 または FVB 背景にされています。腎盂の注射は 6-12 週齢のマウスに適しています。16 週間以上のマウスでまでルシフェラーゼによる 50% の故障率イメージング可能です不明な理由。これは流体の注入の原理に関する一般的な制限がありますので、肝臓に流体尾静脈注射用同じ年齢関連の故障率を観察されています。同じ線に沿って流体尾静脈注入ラット線維化肝が腎線維症腎盂流体注入の設定として有効になりませんが可能がありますので健康な肝臓として効果的ではありません他の人を示しましたが、これはされていない17を直接テストします。 - 手術のため、マウスや DNA の注射器を準備します。
- ケタミン ・ キシラジンとマウスを麻酔します。
- ニトリル手袋、外科マスク、使い捨てラボ エプロンなどの動物施設に必要な正しい個人用保護具に置きます。
- スケールは 0.1 を正確に 500 mL のプラスチック ビーカーにそれぞれのマウスの重量を量る 2-4 マウスの同時使用、g. 腹腔内投与による各マウスを管理する通常の 0.9% 生理食塩水で希釈した 24 mg/mL ケタミンと 2 mg/mL キシラジンの適切な量を計算します。 (腹腔内投与詳細参照されているビデオを参照してください)18します。 数式を使用して (50 μ l + ((5 µL) (重量 (g)) x)、またはローカル獣医師チームと IACUC 協議後別の数式に従って計算または。
- 手技による腹腔内投与によるマウスを挿入します。マウスがモバイルになるまで紙バケツにマウスを配置します。
注: マウスが手術の準備ができている彼らはもはやつま先ピンチ テストに対応です。つま先ピンチに応答し続ける与えるマウスは、20-60 μ L より麻酔、応答の強さに応じて初期注入後 20-30 分をテストします。 - 場所水循環熱パッドの上でマウスが青いパッドと場所獣医軟膏角膜の乾燥を防ぐために両方の目で覆われて。
- ペット手入れ用シェーバーと肩から臀部と背骨に脇腹をマウスの背中の左側を剃る。抜け毛やゴミを削除します。
- 気泡がないように各麻酔下のマウスの希薄 DNA の 100 μ L を含む別の注射器を準備します。
- 安全なし完全に取り付けられている針で滅菌 29 x ½"0.5 mL U-100 インシュリン注射を使用します。
注: 注射器型は非常に重要です。このゲージは、高速注入が可能です。恒久的に取り付けられている針がソリューションから漏れてできなくなります。安全性の存在は、腎盂へのアクセスが低下します。材料表で指定された注射器をテスト他のブランドよりも注入時より均等に滑空します。 - 〜 120 μ L に注射器を読み込み、上部スペースを作成するプランジャーをプルダウンします。すべてトップに気泡上昇の空気までをペンでタップします。針の先端に液滴が形成されるまで、すべての空気を削除するプランジャーを押し下げる慎重に針を持ちこたえて。これらは動物を殺し、空気塞栓症を引き起こす可能性があります、任意の目に見える気泡はないはず。
- 元および microfuge の管に過剰な DNA 溶液を空にして注射器で 100 μ L があるまでプランジャー気のめいる終了します。慎重にラベルを必要に応じて、作業が実行されている施設は、針のおさらいを許可されていない場合、無菌性を維持するために滅菌ドレープでロードされた注射器を配置します。
- 安全なし完全に取り付けられている針で滅菌 29 x ½"0.5 mL U-100 インシュリン注射を使用します。
- ケタミン ・ キシラジンとマウスを麻酔します。
- 注入手術を行います。
- 手術のため、サイトを準備します。それらに触れることがなく熱パッドと滅菌ドレープの上に空の生殖不能手術器具に滅菌ドレープを置きます。マウスをピックアップし、ビューのフィールドにそれを配置します。領域を照らすための照明を調整します。
- パッケージから 3 3.15% クロルヘキシジン グルコン酸と 70% イソプロピル アルコール皮膚消毒綿棒を取り出し、動物の近くに置きます。
- 滅菌手術用手袋に変更します。切開部位、綿棒を動物新しいクロルヘキシジン ・ アルコール綿棒で円形モーション開始で働いて 3 回。
- 図 1 aに示すように、切開部位を探します。ピンセットで皮膚をつまんで、皮膚に約 1 cm 脊柱からと胸郭のすぐ下のレイヤーにカットすることはさみを使用します。カットのサイトが約 1 cm 長いには、筋層以下、似たようなカットのサイト。
メモ: は、辛うじて切開と切開自体によって場所で保たれる腎臓を許可する右の長さ切開をください。あまりにも小さな切開や腎臓に公開できません。大きすぎると腎臓が継続的に腹腔内にスリップします。 - 腎臓を探します。
注: 場合によっては、白色脂肪組織の間で表示があります。脾臓は動物の左側にもあります。これらの器官の色は、区別される視覚的に、脾臓は暗い栗色腎臓は濃い赤オレンジ色。それすることができます簡単に破裂した脾臓を操作することはお勧めしません。 - 腎臓を触れることがなく優しく公開腹腔内から (図 2) の指腹部の安定した、穏やかな圧力を置くことによって。優しく必要に応じて不要な器官を腹部にプッシュ バックするのに閉じたピンセットを使用します。腎臓や他の臓器に損傷を与える可能性があります開く鉗子は使用しないでください。
- 腎臓は腹部からは、一度軽く別周辺から脂肪腎盂、小さな白いドット (図 1 b) を可視化するだけ。1 つの側面に余分な脂肪をプッシュまたは必要に応じて削除します。副腎、腎臓、または腎被膜の上極の近くにあるを削除しないでください。
- プッシュ ダウン右側腎臓の腎盂がビュー内に残っているので、右手で読み込まれたインスリン注射器をつかんで鉗子閉鎖して、腎盂 (図 2 e) で先のとがった針で作業面に平行に保持します。図 1 bに示すように、針を固定化腎臓の腎盂に慎重に挿入します。
- 3 秒以内に急激に溶液を注入します。腎臓の約 3 分の 1 がオフし、色を白に変更します。
注: 血腫の形成と同様、腎臓のカプセルの注射で流体の蓄積を観察する一般的です。いくつかの損傷は検出用 DNA トランスフェクションの十分なレベルを達成するために必要です。 - 約 10 のための場所で針を保つソリューションの逆流を防止します。その後、慎重に、ゆっくりと針を抜きます。軽く切開部位をストレッチして腹腔内器官の鉗子閉鎖を返します。
- 5-0 吸収性縫合糸、2-4 独立ノットを配置することで、動物の筋層を縫合します。
- 5-0、6-0 ナイロンの非吸収性縫合糸で 2-4 独立ノットを配置する動物のスキン層を縫合します。
注: 手術器具が滅菌ビーズお風呂で配置した後再利用し、冷却します。
図 1。流体力学的腎盂注射の正しい切開サイトと針配置します。A) 切開 (赤い線) がする必要があります約背骨から 1 cm と 1 cm 程度マウスの胸郭のすぐ下に位置します。B) 後腎臓を側腹部切開を介して公開する腎盂は腎臓の下の小さな黄色がかったクリア/ホワイト ドット中間として配置されなければなりません。尿管、腎動脈、腎静脈注射を邪魔する必要があります。インスリン注射器の針は約 0.5 cm の深さに示すように、腎盂に直接挿入し、2-3 s に落ち込んですぐにこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。プラスミド DNA の腎盂流体注入の手術手順です。A) 鉗子は、外科医は、次に筋層を介して皮膚の層を通して最初メスと ~ 1 cm 側腹部切開を作ることを許可するように皮をつまみます。B) 閉じ鉗子で手術創、腎臓を開くの 2 つのペアを使用して、可能であれば腹部内可視化されます。C) すべての臓器に直接触れることがなく、腹部に穏やかな圧力で腎臓は側腹部切開を通じて公開されます。D) 脂肪は優しく、腎盂へのアクセスを達成するために可能な限り少し邪魔、腎臓から解剖します。E) 押すと右側より左の腎臓の腎盂を視覚化し、注射器は主に親指で開催され、針は慎重に、しかし確実に配置されます, 腎盂。F) 以下、< 射出の大部分を受け取った腎臓のエリアのクリア、3 s 注射を発生可能性があります。G) 滅菌紫 vicryl 吸収性縫合糸は、2-4 独立ノットは、筋層に使用されます。H) 滅菌の青いナイロンの非吸収性縫合糸は、皮膚の層に 2-4 独立ノットを作るに使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 手術と術後監視からの回復。
- 疼痛コントロールのための機関の IACUC 要件に応じて鎮痛剤をマウスを提供します。たとえば、管理ブプレノルフィン皮下注射 48 時間ごとの 8-12 h 術後研究使用を避けるために NSAID 関連の腎損傷している場合。
- 熱マウス パッド、胸骨の横臥とまで完全にモバイル調査官が出席してください。完全に回復したときは、ストレスを軽減するホーム ケージから寝具の少量を含むきれいなケージにマウスを返します。なく、家マウス素朴なマウスと手術を受けるを行います。
注: マウスの状態はすぐに 24-48 時間以内に通常動作に改善されます。 - 自分の状態を改善するために強調表示されますマウスを生理食塩水液と増加鎮痛効果を与えます。マウスがすぐに回復しない場合、マウスの重量を測定し、初期体重の 20% 以上を失っているマウスを安楽死させます。尿毒症やそれ以外の場合瀕死表示マウスを安楽死させます。可能な健康上の問題は、表 1に記載されています。
注: マウスは時々 自分の外側の縫合糸を削除または創閉鎖前に縫合糸が緩みます。無傷の皮膚層と筋層の貧困層の縫合は、膨らんだによって示される切開部位でヘルニアで起因できます。このような場合は、麻酔下でマウスを置きます (イソフルランはケタミン ・ キシラジンより高速です) と、できるだけ早く新しい縫合糸で手術部位を修復します。10-14 日後に皮膚の非吸収性縫合糸が残っている場合は、それらを削除します。時折マウスは、彼らのかご仲間の抜糸や戦う可能性があります。このような動作を識別するとすぐに、他のマウスを傷つけることからそれらを防ぐための濃縮と自分のケージにアグレッサー マウスを削除します。 - 健康または実験的エンドポイントに達すると、安楽死による二酸化炭素吸入やイソフルラン過剰摂取で安楽死のための標準操作手順によると頚部転位などの安楽死法二次続いてマウス機関配置します。
| 原因 | 発症 | 影響を受けるマウスの数 | 症状 | 即時アクション | 長期的なソリューション | ||
| DNA に含まれるエンドトキシン | 6-40 h 後注入。 | 汚染された DNA の準備を与えられたすべてのマウスに影響を与える可能性があります。 | 呼吸困難、激しい痛み、臓器不全、死の兆候。 | 影響を受けるマウスを安楽死させます。カブトガニ含まライセートと大原の各挿入されたコンポーネントをテストします。 | エンドトキシン maxiprep キットと滅菌や新しい NaOH 処理の実験器具のみを使用します。DNA を希釈するのに商業的ご購入、エンドトキシン テストのバッファーを使用します。 | ||
| 麻酔の過剰摂取 | 手術前に、または DNA 注入後。 | 若いより小さい、またはスリム マウスのみに影響を与える可能性があります。 | 加熱パッド、排尿中に呼吸をしなくなります。 | 残りのマウスのための麻酔を減少させます。 | 調製と投与量の正確さのためのプロトコルを再確認してください。「ラント」を除外します。適切な投与量を使用した場合は、獣医を参照してください。 | ||
| 注射器や注射用の針で気泡 | 腎盂注入を直後です。 | すべての注射器をうっかりロードされた場合を除き、これは、1 つのマウスをのみ影響します。 | 息を切らしてください。 | 空気の泡の兆候を残りの注射器を確認してください。 | 下部に泡を削除する注射器をタップ、慎重に注射器を準備します。泡をうまく視覚化する照明条件を改善します。 | ||
| 手術部位の開口部 | 投与後 12-72 h | 1 つまたは複数のマウス。時々 全体のケージ。 | 傷口の開いた傷、通常その他苦痛 | 生殖不能の技術とイソフルラン麻酔下慎重に傷を修復するため縫合を繰り返します。生理食塩水で洗浄またはハサミで傷の罫線を削除する必要があります。 | すべてのマウスがある非常に短いまたは行方不明の縫合糸は、マウスを分離することがありますので、それらを削除する 1 つのマウスがあります。縫合技術を向上します。独立したノットを使用します。 | ||
| 手術部位でヘルニア | 48 + h 投与後 | 1 つまたは複数のマウス。 | 恥丘は、手術部位で表示されます。 | 生殖不能の技術とイソフルラン麻酔下で治癒の切り傷筋層のヘルニアを明らかにします。腹膜内の臓器を交換、吸収性縫合糸で筋層を修復し、サイトを閉じる。 | これは、貧困層の筋層縫合を示します。縫合技術を向上します。独立したノットを使用します。 | ||
| 腎臓障害 | 48 + h 投与後 | 1 つまたは複数のマウス。 | 重量の損失 > 20%、おそらく、尿毒症になる猫背姿勢 | 増加し鎮痛を延長または生理食塩水を提供します。改善が認められなかった場合は、影響を受けるマウスを犠牲します。 | 重症度の低い動物の病気の状態を変更します。強いまたは誘引可能な遺伝子を変更します。病気の進行で以前 timepoint でマウスを挿入します。 | ||
| 膿瘍や感染症 | 数日から数週間の術後 | 1 つまたは複数のマウス。 | 明白な膿瘍や敗血症の徴候 | 影響を受けるマウスを安楽死させます。感染を確認するため死体解剖を要求します。 | これは、手術の条件と注射は十分に滅菌できない場合に発生します。示す手順は、通常の免疫システムを持つマウスが免疫不全動物などの設定に注意が取られなければならないさらにシクロフォスファミドします。 | ||
テーブル 1。腎盂注入プロトコル中に検出された潜在的な健康上の問題のテーブル。記載されている健康上の問題は一般的ではありません、プロシージャのコース中に発生する調査官に関連するエラーの数があります。予防と健康上の問題だけでなく、将来的に発生するからこのような問題を防ぐために潜在的な救済策の実施のための診断の援助のこのテーブルがあります。練習では、捜査官は、間欠的な健康上の問題と手順による死亡率を期待してください。
3. 注入効率と導入効果を評価します。
- トランスフェクション効率を評価するために目的の遺伝子のためのよく発達したアッセイを使用します。正と負のコントロールを使用して、慎重に試金は特定かどうかを確認します。
注: プロモーターの選択に応じてマウス可能性が最強の発現 1 日目。常に内注入最初の週。 - 注射用希釈した DNA に強化されたホタルのルシフェラーゼなどルシフェラーゼ発現プラスミドの 10 μ g を導入することによってルシフェラーゼのライブ動物イメージングを実行します。
- マウスに触れるすべての表面をきれいにします。商工会議所とシャット ダウン シールにマウスの最初のケージを配置します。ゲージをチェックすることによって、実験のため十分なイソフルランがあることを確認します。ない場合は、レベルに達する"max"ラインまで、イソフルランを追加します。3.5 にイソフルラン ダイヤルと 2 に酸素を回してイソフルランの流れを開始します。
- 解凍 30 mg/mL ルシフェリン 100 μ L で腹腔内投与による各マウスを注入します。時間を記録します。
- オレンジと黄色のマウス アイコンをクリックして画像のマシンを制御するソフトウェアを開きます。"選択/追加ユーザー ID、"["ユーザー ID"の横にあるドロップ ダウン メニューから正しい頭文字を選択します。"OK"をクリックします。上部のメニュー バーを取得する」をクリックし、ドロップ ダウン メニューから「自動保存...」を選択します。フォルダーを選択するか、データを保存する新しいフォルダーを作成します。
- 右下隅で、イメージの取得] ボックスに移動します。自動設定は、次のとおりチェック: ビニング、媒体;F/ストップの 1 写真; 発光性 8排出フィルター、開かれています。のみ発光、写真、オーバーレイ、および配置の横にあるチェック モードをイメージングします。システムを初期化、初期化が完了するを待つと 5 マウスを画像に"E"を「フィールドのビュー」を変更し「初期化」をクリックします。
- マシンの内部 nosecones イソフルランを管理しているように、麻酔のチューブのバルブを回します。腎臓を視覚化するために上記のカメラに直面して彼らの背中で、お腹の目的の順序でイメージング マシン中の動物を配置します。1 つ以上のケージがイメージを作成する場合は、イソフルラン麻酔室に次のケージを配置します。
- ルシフェリンの注入、5-10 分、画像を撮影する「獲得」を押します。
- 「ツール パレット」、右側に「画像調整」をクリックします。「カラー スケール」の下で式が各マウス腎臓紫として可視化、すべての予想されるマウスで明らかになるまで"Min"バーを減少。任意のマウスは、式を表示しない場合のルシフェリン 100 μ L でマウスを膨らませてし、再取得する前に、少なくとも 3 分を待ちます。
- 画像は、ピクセルを飽和が、露光時間を減少し、飽和ピクセルの存在がトランスフェクション効率を過小評価に起因するので、定量画像を取得するを再取得します。最低の可能な露光時間は 0.5 秒。
- 画像は、最初の曝露時にのみかすかな遺伝子発現を示している場合は、2 分と再取得までの露光時間を増やします。イメージを奪還すると、たびにデータは、選択したフォルダーに自動保存されたすべての画像は後でさらに分析に使用できるように。
- マウスの後続のケージの画像処理手順を繰り返します。
- 画像のマシンから、マウスを削除します。ガスを止めます。商工会議所、nosecones、およびイメージングのステージをきれい。コンピューター プログラムを閉じます。
注: ソフトウェアを「Dataset の保存」する尋ねますこれは、データセット、データ自体ではなく、操作を指します。- 規模および興味 (ROIs) の地域に変更を保存する「はい」をクリックします。画像の設定を元に戻す「いいえ」をクリックします。
- データ分析用ソフトウェアを開きます。「ツール パレット」「ROI ツール」をクリックします。サークル アイコンをクリックし、その周りに 4 つの正方形の赤い楕円形によって示されるように画像ウィンドウで新しい ROI を配置するドロップ ダウン メニューで「1」をクリックします。赤い四角形の上にマウス カーソルを置くと、注入された腎臓を覆う紫色の領域を囲むにドラッグすることによって、ROI のサイズを調整します。
- ROI に赤の広場をカーソルで右クリックし、画像ウィンドウで新しい投資収益率を作成し、次のマウスに移動する「ROI の複製」を選択します。イメージですべてのマウス注入された腎臓に投資収益率を持っているまで、手順を繰り返します。
- 画像の上に直接メニューの「数」から「ラディアンス (光子)」の「ユニット」を変更する.投資収益率データを「ツール パレット」をエクスポートする「ROI ツール」をクリック測定のスプレッドシートを作成する鉛筆/定規アイコンをクリックします。選択したデータ分析や統計プログラムでさらに分析で「Avg ラディアンス」測定を使用します。
- 説明11セクションの染色法を実行します。
注: 注射はない transfect 全体腎臓同様にので、別のセクションは、異なるトランスフェクション効率11をキャプチャします。蛍光ラテックス微粒子の領域を同定するのに役立つなどビーズの共射出は遺伝子陽性 (図 3 D)11と予想。汚損のプロトコルの最適化は非常に重要です。 - Transfected 腎臓の興味の遺伝子を識別するために西部のしみを実行します。
注: 氷の上の蛋白質のエキスのための器官の収穫を行う必要があります。もう一度、この領域可能性がありますいないがされて導入も、オルガンの小さなスライスを使用しないでください。トランスフェクションは、臓器全体均等に配られるのでさまざまな分野を組み合わせるし、それらをプールします。ホルモンのエリスロポエチンの生産プラスミドの腎盂流体注入は、分泌された遺伝子の製品を循環11で発見されるべきこととそう、ヘマトクリット値に適度な上昇で起因しました。 - Transgenes の長期的な高度な表現、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤と統合のベクトル システムを組み合わせます。遺伝子に対する免疫応答は最初の上後数週間注入が発生し、堅牢な11です。
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Representative Results
手術および注入の技術はマスターならば、主要な機器や高価な材料を必要としないを実行する簡単です。側腹部切開腎手術に新しい、安楽死を予定していくつかのマウスの 1 つの訓練日で許可するか、マウスがない回復手術この手術の最初の試行は、通常よりも長くかかる場合がありますので。また、同様の手法に精通している研究者の場合は、非常に簡単な場合があります。図 1の図と図 2の絵の方向に慎重に従ってください。切開を正しく配置するには、外科医は、それはその側で産む中マウスの胃にプッシュする指を使用できます。腎臓、穏やかな腹部圧力と背骨近く上がる小さなしこりによって可視化され、この領域 (図 1および図 2) を切開する必要があります。正しいサイズ (図 1) の皮膚と筋層切開をすることが重要です。切開が大きすぎる場合、腎臓が腹腔内に戻って容易に滑る、注入が困難します。切開が小さすぎる場合、腹腔内から腎臓をプッシュすることは困難であろうし、臓器の損傷が発生する可能性が。もう一つの重要なポイントは、腎盂内の針の配置です。外科医必要があります閉じ鉗子で腎臓を押し、針を斜めに腎盂に挿入作業面に平行噴射量のほとんどが入る直接腎臓実質 (図 2)。注射が腎臓の transfection のために必要な流体圧力を誘導するためにできるだけ早く実行することが重要です。
異なる系統、年齢、重量、および/または性のマウスが腎臓およびいくつかの調整の関心のマウスで動作する必要がありますので、腎臓の周りの脂肪量の位置に違いがあります。可能であれば、そこからマウスを回復手術の最初の試みは、ルシフェラーゼ (図 3 a) をイメージングなどの腎臓固有の遺伝子発現の即時読み出しを含める必要があります。若いマウスを使用している場合、予想結果は、すべてのマウスは (図 3 b) 一桁の内にある輝きを持つことです。時折、ルシフェリンの 2 回目投与後もそれを感じ取ることがマウスまたはマウスは他の人に匹敵するレベルで導入となってできませんでしたまたはいくつかの注入されたマウスは遺伝子発現に欠けているも完全にイメージで。このようなマウス遺伝子の障害が発生した配信による研究から除外すること。マウスの多くは遺伝子発現を欠いている場合、外科医は DNA 溶液の注入の時間を減らす必要があります。噴射の高圧により必要な障害を誘発する失敗は、遺伝子発現の一貫性の欠如の原因です。マウスは、潜在的な健康上の問題 (それに伴うソリューションの潜在的な健康上の問題と金融機関の獣医チームと相談して必要に応じて、表 1を参照) を注意深く監視された手術をする必要があります。最初のトレーニング期間、手術自体は 10 分未満を取る必要があります。手術の時期は可能な限り短く時手術中に組織の乾燥を防ぐために 1 つのマウスで操作することにより行ってください。この手順では時間の投資のほとんどは、誘導とケタミン ・ キシラジン麻酔からの回復のためです。2 つの経験豊富な人材がチームとしての作業は、妥当な上限として 15 歳と 1 日あたり 10 個まで手術を実行するはずです。
研究者は、注入に続く最初の数日以内、transgene のポジを染色する細胞の数が少ないはずです。これらの陽性の細胞は、周辺地域の注射液が (図 3-D) の腎臓を浸透してパッチでローカライズされます。腎臓の一部は transfected セルの完全にマイナスになります。このような負の領域また赤血球に欠けているし、注入がこれらの区域に達しなかったので完全に正常組織があります。染色プロトコルとプロモーターは遺伝子発現をキャプチャする慎重に最適化する必要があります。調査官は種類 transfected セルが変数になります、トランスフェクション細胞の割合が低い内遺伝子発現レベルが高いと細胞内蛋白質のローカリゼーションは、のレベルが高いため期待どおりにできない場合がありますを期待すべき式 (図 3 D)。
図 3。ルシフェラーゼと TdTomato の腎臓特異的遺伝子発現結果を流体力学的腎盂注入。(FVB A) 7-8 週古い男性マウスの pTEeL、20 μ g 流体腎盂注射を与えられた発現するプラスミド EF 1 α プロモーターからホタルのルシフェラーゼを強化されています。また、蛍光レポーター プラスミドの 20 μ g を注入したマウス 2、3、および 5。(ドット B) (A) に示すようにマウスから得られた輝きのプロット。(C と D)マウスは、流体配信バッファーだけで (C) (D) 蛍光マイクロスフィア (明るい緑のドット) や pEF1α TdTomato EF 1 α プロモーターから赤の蛍光レポーター TdTomato を表現するに与えられました。ロータス炭素の分配凝集素 (LTA; 緑) で染色して近位尿細管、(赤) TdTomato 信号を増幅する反 RFP 抗体で染色後 transfected セルが表示されます。核が染色 DAPI によって (青)。示されている画像の (C) と (D) は、13.2 mm × 17.5 mm。 誤差範囲が平均値の標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、腎臓における具体的に再現性のある遺伝子発現を達成するための手法を説明します。適度に経験豊富な外科医の手の中、我々 はマウスの年齢に応じて、50-100% の範囲で遺伝子の読み出しの感度であるためこの手法で導入したマウスの割合を発見しました。ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルは、トランスポゾンpiggyBacを受信マウスの数ヶ月は、背景の上、受信同じトランスポゾン11免疫不全マウスで数週間完全に維持されます。一方、多くの細胞は注射部位に近いエリアの transgene の鮮やかなステンド グラス、トランスフェクション効率は比較的低い (図 3 D)。望ましい結果を達成するために最も重要な材料は、注射器自体です。これは、添付の針と注射を阻害する安全性なし 29 x ½"インスリン注射をする必要があります。注射は、3 秒以内に高速である必要があります。プラスミッド DNA の準備は非常に低エンドトキシンと細菌ゲノム DNA レベル19では、純粋なする必要があります。
同様に RNA、ウイルス、タンパク質などの他の物質の注射を行うことができることが考えられます。腎盂はテスト、腎静脈、腎実質の直接注入など他の注射部位へのエントリのルートとして優れていた。これらの注射は、出血と低い遺伝子式11につながった。腎盂は時々 尿の逆流を保持するために必要な弾性構造、ストレッチし、針を収容することができる方ことがあります。DNA ソリューションまたはインスリン注射器により作成された穴から尿の漏れは観察されていない、腎盂が迅速に修復することを示唆しています。正確なメカニズムを注入流体 transfects 腎臓研究されていない深さでたとえば肝臓のためあり。将来の電子顕微鏡を用いた研究が解明このさらに。射出の逆行性の性質は、優先順位で流体の尾静脈注入法20肝静脈の流れを反転させるし、腎臓トランスフェクションの他の成功した方法が腎静脈12,を介して注入13,14,21. 腎臓の損傷は、最適なトランスフェクションの効率はので、我々 はその遺伝子仮説で行われる損傷高速、大容量の注入によって引き起こされる細胞膜に必要な可能性があります。足、尿細管と収集ダクトとして彼らの主要な機能は、フィルターし、尿を濃縮尿のスペースと直接インターフェイスがあります。
再現性のある、腎臓固有、このメソッドは、比較的低トランスフェクション効率を観察 (図 3 D) によって制限されます。流体力学的腎盂注射は動物の特定のサブタイプのすべてのセルが興味の遺伝子を表現する腎臓固有プロモーターから遺伝子を運転遺伝子組換え動物の作成に代わるものではありません。この方法は遺伝子移転手法病気の少数の修正された細胞が表現型に劇的な効果を持っている、通常、腎臓によって生成される他の物質やホルモンの分泌またはの作成に適応ではなく、修復または再生成する腎臓にいくつかの肯定的な効果を発揮する希少な細胞の人口。また、負の影響を持つ遺伝子を導入することによって腎障害の新しいモデルの開発に反対の方法でも使用することができます。
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Disclosures
著者が開示し、利害の対立を宣言しない何もありません。
Acknowledgments
L.E.W. および健康の国民の協会 [R01 DK095867] キャリア開発賞から復員部の [BX002797] がサポートされており、米国心臓協会 [15GRNT25700209] サポート j. c.健康の国民の協会 [DK093660]、復員軍人援護局の部 [BX002190] およびヴァンダービルト腎臓病センター サポート M.H.W.この資料は、VA テネシー州の谷の医療系施設のリソースとサポート作業の結果です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic - Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia - Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads - 15" x 21" - need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic - Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
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