Summary
Det här protokollet beskriver en metod för att injicera plasmid DNA i mus njuren via njurbäckenet att producera transgenens uttryck specifikt i njuren.
Abstract
Hydrodynamiska injektion skapar en lokal, högtrycks miljö för att transfect olika vävnader med plasmid DNA och andra ämnen. Hydrodynamiska svans ven injektion, exempelvis är en väletablerad metod som levern kan vara transfekterade. Detta manuskript beskriver en tillämpning av hydrodynamisk principer genom injektion av mus njure direkt med plasmid DNA för njure-specifika genuttryck. Möss är sövd och njurarna utsätts av en flank snitt följt av en snabb injektion av en plasmid DNA-innehållande lösning direkt in i njurbäckenet. Kanylen hålls på plats i tio sekunder och webbplatsen snittet sys. Följande dag, levande djur imaging, Western blot eller immunohistokemi kan användas till assay genuttryck eller andra analyser som passar transgenens val används för detektion av proteinet av intresse. Publicerade metoder för att förlänga genuttryck inkluderar transposon-medierad transgenens integration och cyklofosfamid behandling för att hämma immunförsvaret till att transgenens.
Introduction
Hydrodynamiska svans ven injektionsteknik har blivit ett vanligt förekommande sätt att uppnå höga nivåer av genuttryck i mus lever1,2. Njurarna är också transfekterade genom denna teknik på en mycket lägre nivå, cirka 100 gånger mindre3. Den hydrodynamiska njurbäcken injektionen beskrivs här ger ett enkelt sätt att styra specificitet orgel uttryck genom fysikaliska processer använder samma hydrodynamiska principer som har fastställts tidigare i levern4,5 , muskel6och andra organ7,8. Denna metod transfects celler i levande djur i vivo med hjälp av tryck och hastighet för att tvinga vätska innehållande DNA i cellerna samtidigt förmå skada till det organ som är snabbt löst9. Med väletablerade kirurgiska tekniker för att visualisera njuren via en flank snitt10 tillsammans med en enda injektion av insulinspruta upptäckte vi har framgångsrika transfection av olika typer av njurceller, främst interstitiell fibroblaster, tubuli och samlande kanal11. Dissektion av dessa möss har visat att andra organ inte är transfekterade på nivåer som är tillräckligt hög för att visualisera av luciferas imaging tekniker11. Eftersom tekniken är icke-virala, tillåter användning av plasmid DNA för transfection snabb och enkel beredning av reagensen krävs för injektion.
Vi har använt lokaliserade hydrodynamiska injektioner för att uttrycka den antioxidant glutation S-transferas A4, insulin-liknande tillväxtfaktor-1 receptorn och hormonet erytropoietin i njuren, alla med förväntade biologiska effekter11, 12 , 13. detaljerad utvärdering av administreringsväg, injektionsvolym, DNA dosering, och arrangören val har varit utfört11. Båda piggyBac transposon systemet och/eller cyklofosfamid behandling att undertrycka immunreaktion till transgenens har dessutom visat sig förbättra långsiktiga gen uttryck resultat11. Andra utredare har använt en njurvenen strategi i råtta med framgång, att uppnå hög transfection effektivitet för tidsperioder på mer än en månad14. Men genetiska korrigeringen av fenotyper härma mänskliga sjukdomar utförs vanligtvis i möss först som ett proof-of-concept eftersom mest däggdjur genetiska modeller musmodeller. Vi jämförde njurvenen injektion till njurbäckenet injektion och fann att injektion i njurbäckenet var överlägsen njurvenen genuttryck (cirka tio gånger högre) och överlevnad11. I njurbäckenet är en idealisk väg träder i njuren eftersom det är tillräckligt flexibel för att tolerera fluktuationer i urinproduktion och är ofta kunna bibehålla sin strukturella integritet även när vidgade under hydronefros. Dessutom injektion i njurbäckenet tillgång till njuren utan piercing njure kapseln, vilket gör att den injicerade vätskan behålls synbart av njuren bättre än intraparenchymal injektion. Andra musen organ har inte en rutt träder än kärlsystemet, men urin utrymmet i njuren är en idealisk injektionsstället. Dessutom, resulterade i den nedsatt ven i läckage av blod i bukhålan. Den totala njure volymen av vildtyp mus njurar har uppskattats av magnetisk resonanstomografi vara cirka 0,2 cm3, så volymen av en enda njure är ungefär lika med mängden vätska injiceras av njurbäckenet hydrodynamiska injektion (100 µL)15. Häri, har vi gjort tillgängliga alla detaljerade nyanserna av protokollet hydrodynamiska njurbäckenet injektion att uppnå reproducerbara transfection av njure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning (IACUCs) av kommittéer Baylor College of Medicine och Vanderbilt University Medical Center.
1. Förbered den DNA-lösningen för injektion
- Välj plasmid(s) att uttrycka transgene(s) noggrant för att maximera de önskvärda egenskaperna för att förbättra transfektionsprotokoll effektivitet och transgenens uttryck.
Obs: Hydrodynamiska njurbäckenet injektion av plasmider att uttrycka den fluorescerande markören TdTomato, hormonet erytropoietin (Epo) och firefly luciferas har varit tidigare beskrivna11. Om det inte finns en väl utvecklad analys för transfection effektivitet för transgenens, utföra levande djur avbildning av luciferas genom att införa 10 µg av luciferas-uttryckande plasmid såsom förbättrad firefly luciferas i utspädda DNA för injektion.- Välj minsta plasmiden som är praktiska tillämpningen.
Obs: Små plasmider generellt transfect celler bättre än stora plasmider. Exempelvis är den zeomycin motstånd-genen och R6K ursprung replikering små, så utnyttja dessa element i plasmiden ryggraden kommer minska plasmid storlek. - Uttrycka transgenens från däggdjur främjare.
Obs: De njure celltyp transfekterade, längd av genuttryck och styrka av genuttryck kommer alla att påverkas av promotorn valet. Se Woodard et al. för en jämförelse av cytomegalovirus (CMV, konstituerande viral), elongation factor-1 alpha (EF-1α; konstituerande endogena), gamma-glutamyltransferas (γGT; tubuli-specifika) och podocin (NPHS2; podocyte-specifika)11. - Anställa en icke-virala integrerande system såsom transposoner om långsiktiga gen uttryck högre är önskvärt11,16. För studier med tidig avläsning mindre än 5 dagar efter injektion är integration av transgenens onödiga.
- Välj minsta plasmiden som är praktiska tillämpningen.
- Förbereda plasmid DNA för injektion med en kommersiell metod såsom ett endotoxinfria maxiprep kit. Noga med att undvika att införa endotoxiner via labware.
Obs: Närvaro av endotoxiner i DNA lösningen kommer framkalla en svår immunsvar i ämnet djuret, att äventyra experimentet och eventuellt döda djuret.- Efter sist tvättningen DNA isolering är klar, se till att ingen etanol som finns kvar av visuell inspektion och lukt. Använd gel-lastning tips för att ta bort synliga droppar. Torka rören som innehåller DNA pelleten uppochner på laboratoriet grannlaga uppgift torkare vävnader i rumstemperatur eller i ett 37-60 ° C ugn med konstant övervakning. Återsuspendera pelleten omedelbart efter resterande etanol har avdunstat för att förhindra overdrying av pelleten.
Obs: Kvarstående etanol stör med spektrofotometer läsningen av DNA koncentrationen och introduktion till njuren är inte önskvärt. - Återsuspendera DNA pelleten i samma buffert som används för injektion (hydrodynamisk leverans buffert, 100-300 µL) för att begränsa variationen i den kemiska sammansättningen av DNA buffertlösningen mellan grupperna.
Obs: Inte Återsuspendera DNA pelleten i eluering buffertlösningen som medföljer kitet. Kelatbildare EDTA förekommer allmänt i ”TE” buffert preparat kan påverka njurarna och kardiovaskulär funktion. Beroende på pelleten storleken, eluera i 100-300 µL hydrodynamiska leverans buffert för att uppnå en hög koncentration. Den slutliga koncentrationen av fullt utspädda DNA kommer att vara mellan 100 ng/µL (10 µg/mus dos) och 500 ng/µL (50 µg/mus dos) så lager DNA koncentrationen bör överstiga detta. - Fullt Återsuspendera DNA pelleten i buffert. Lämna pelleten i hydrodynamiska leverans buffert i ursprungliga röret i rumstemperatur i minst en timme eller över natten vid 4 ° C före överföring till en steril mikrofugrör att säkerställa att DNA är helt upplöst.
- Läs plasmid DNA koncentrationen på en spektrofotometer eller genom en annan etablerad metod.
Obs: Avläsningar bör göras i två exemplar med ytterligare replikat vid behov. Om förhållandet 260/280 understiger 1,8, preparatet är förorenad med RNA eller ett annat ämne så ignorera det och förbereda DNA igen. - Store plasmid DNA resuspended i injektion buffert vid-20 ° C inne i en låda i en handbok avfrosta frysen för att undvika nedbrytning av DNA.
Obs: Lagras på detta sätt, kommer att DNA preparatet pågå i många år. Kontrollera integriteten för DNA genom begränsning digest och agaros gelelektrofores. DNA som är utsmetad nedåt gränden har försämrats och kan inte användas medan DNA som producerar skarpa band med rätt storlek kan användas för injektion.
- Efter sist tvättningen DNA isolering är klar, se till att ingen etanol som finns kvar av visuell inspektion och lukt. Använd gel-lastning tips för att ta bort synliga droppar. Torka rören som innehåller DNA pelleten uppochner på laboratoriet grannlaga uppgift torkare vävnader i rumstemperatur eller i ett 37-60 ° C ugn med konstant övervakning. Återsuspendera pelleten omedelbart efter resterande etanol har avdunstat för att förhindra overdrying av pelleten.
- Förbereda den utspädda plasmid DNA lösningen för injektion i njurbäckenet.
Överväg att kontroll för noggrant. För många studier ingår naiv och buffert endast injiceras kontroller eftersom själva injektionen orsakar skador och kan påverka den experimentella resultat11.- Frosta av endotoxinfria DNA elueras i hydrodynamiska leverans buffert vid rumstemperatur på bänken.
- Beräkna mängden DNA behövs för injektioner och förbereda den utspädda DNA för varje grupp. Administrera 10-50 µg av plasmid DNA förde till en total volym av 100 µL med hydrodynamiska leverans buffert per mus.
Obs: Till exempel beräkningarna att injicera 3 möss med 10 µg/mus av en DNA-plasmid som har en koncentration av 0,5 µg/µL är följande.- Bered tillräckligt DNA har cirka 20% extra för lastning av sprutor och döda plats i nålen. För 3 möss, förbereda en blandning på 3.5 x. Beräkna massan av DNA i µg som bör vara i lösningen. Här skulle det 10 µg x 3,5 = 35 µg.
- Beräkna den totala volymen av lösning som önskas för Injicera 100 µL per mus. I det här fallet skulle det 100 µL x 3,5 = 350 µL totala volym.
- Beräkna volymen av lager plasmid DNA att lägga till lösningen. I det här fallet skulle det 35 µg / 0,5 µg/µL = 70 µL av lager plasmid DNA.
- Beräkna volymen av buffert att lägga till den utspädda DNA-lösningen genom att subtrahera volymen av lager DNA lagt till (steg 1.3.2.3) från den totala volymen utspädda DNA som är önskat (steg 1.3.2.2). I det här fallet skulle det 350 µL - 70 µL = 280 µL hydrodynamiska leverans buffert.
- Bered lösningar i sterila microfuge rör med kommersiellt tillgängliga filter pipettspetsar med steril teknik på bänken lab.
Obs: DNA lösningar kan vara beredd och förvaras i rumstemperatur för injektioner ska ske samma dag. Injicera inte möss med en kall lösning, eftersom detta kommer att sänka sin kroppstemperatur, men uppvärmningen är onödiga.
2. utföra hydrodynamiska njurbäckenet injektion operationen
- Välj möss noggrant för kirurgi.
Obs: Stamspecifika skillnader har ännu inte observerats men kan vara möjligt. De flesta injektioner har varit på C57BL/6 eller Kandeekane bakgrunder. Njurbäckenet injektioner fungerar bäst i möss som är 6-12 veckor gamla. Hos möss som är större än 16 veckor, upp till en 50% felfrekvens av luciferas är imaging möjligt av oklara skäl. Den samma åldersrelaterade felfrekvensen har observerats för hydrodynamiska svans ven injektioner till levern så detta kan vara en allmän begränsning som avser principen om hydrodynamiska injektion. I samma riktning, andra har visat att hydrodynamisk svans ven injektion i fibrotiska råtta lever inte lika effektivt som frisk lever, så det kan vara möjligt att i inställningarna för nedsatt fibros njurbäckenet hydrodynamiska injektionen inte kommer lika effektivt, men Detta har inte testat direkt17. - Förbereda möss och DNA sprutor för kirurgi.
- Söva möss med ketamin och xylazin.
- Sätta på rätt personlig skyddsutrustning krävs av djuranläggningen, såsom disponibel lab förkläde, kirurgiska ansiktsmask och handskar i Nitril.
- Arbetar med 2-4 möss på samma gång, väger varje mus i en 500 mL plast bägare på en skala som stämmer till 0,1 g. beräkna rätt mängd 24 mg/mL ketamin och 2 mg/mL xylazin utspädd i vanlig 0,9% koksaltlösning att administrera till varje mus genom intraperitoneal injektion (se refererade video för mer om intraperitoneal injektion) 18. använda formel (50 µL + ((5 µL) x (vikt (g))), eller alternativt beräkna enligt en annan formel efter samråd med lokala veterinär teamet och IACUC.
- Injicera musen av intraperitoneal injektion av standardtekniker. Placera musen i en papper hink tills musen är orörligt.
Obs: Möss är redo för operation när de inte längre svarar på tå-nypa testet. Ge möss som fortsätter att svara på tå-nypa testa 20-30 min efter den första injektionen 20-60 µL mer bedövningsmedel, beroende på styrkan i svaret. - Plats med musen på en vatten-cirkulerade hetta madrassera täckt med blå filtdyna och plats vet salva i båda ögonen att förebygga korneal uttorkning.
- Raka vänster sida av baksidan av musen från Axel till gumpen och flank till ryggraden med en rakapparat utformad för sällskapsdjur grooming. Ta bort löst hår och skräp.
- Förbereda en separat spruta innehållande 100 µL utspädda DNA för varje sövda mus, vilket gör att det inte finns några luftbubblor.
- Använd en steril 29G x ½ ”0,5 mL U-100 insulinspruta med en permanent fastsatt nål utan en säkerhet.
Obs: Spruta typ är av avgörande betydelse. Denna mätare möjliggör en snabb injektion. Den permanent fastsatt nål förhindrar lösningen från att läcka ut. Förekomsten av en säkerhet kommer att hindra tillgång till i njurbäckenet. De sprutor som anges i tabellen material glider mer jämnt under injektion än andra märken som testas. - Fyll sprutan till ~ 120 µL och dra kolven nedåt för att skapa ett utrymme på toppen. Tryck med en penna tills all luft bubblor stiger upp. Hålla nålen, noga att trycka ned kolven för att ta bort all luft tills en droppe bildar på spetsen av nålen. Det bör inte vara några synliga bubblor som är närvarande, eftersom dessa kan orsaka en luftemboli som kommer att döda djuret.
- Sluta trycka ned kolven tills det finns 100 µL i sprutan av tömning överflödigt DNA lösning i den ursprungliga mikrofugrör. Noga märka om det behövs och placera de laddade sprutorna på en steril draperi att upprätthålla sterilitet om anläggningen där arbete utförs inte tillåter regummering av nålar.
- Använd en steril 29G x ½ ”0,5 mL U-100 insulinspruta med en permanent fastsatt nål utan en säkerhet.
- Söva möss med ketamin och xylazin.
- Utföra injektion kirurgi.
- Förbereda platsen för operation. Placera en steril draperi över hetta madrassera och tomma sterila kirurgiska verktyg på den steril duk utan att röra dem. Plocka upp musen och placera den i synfältet. Justera belysning för att lysa upp området.
- Ta bort tre 3,15% klorhexidin glukonat och 70% isopropylalkohol hud antiseptiska svabbprover från paketen och placera nära djuret.
- Ändra in i sterila operationshandskar. Arbetar i en cirkelrörelse början på webbplatsen snitt, provstickan djuret med en ny klorhexidin/spritsudd tre gånger.
- Leta upp snittet webbplatsen som visas i figur 1A. Nyp i huden med pincett, använd sax för att göra ett snitt i huden skikt ca 1 cm från ryggraden och under bröstkorgen. När snittet webbplatsen är ca 1 cm långa, gör en liknande skär webbplats nedan, i muskellagrar.
MÄRKA Göra snittet rätt längd så att njurarna att bara knappt komma genom snittet och sedan hållas på plats genom snittet sig själv. Alltför små snitt och njurarna inte kan bli exponerade. för stor och njuren kommer kontinuerligt glida in i bukhålan. - Leta upp njuren.
Obs: Det kan vara synlig bland vit fettväv. Mjälten är också beläget på vänster sida av djuret. Färgen på dessa organ kan differentieras visuellt, som mjälten är en mörkt rödbrun medan njuren är en mörk röd-orange. Det är inte önskvärt att manipulera mjälten som det kan vara enkelt spruckit. - Utan att röra njuren, försiktigt avslöja det från bukhålan genom stadig, milda påtryckningar på buken med fingrarna (figur 2 c). Använda slutna pincett att försiktigt trycka oönskade organ tillbaka in i buken vid behov. Använd inte öppna tången eftersom det kan skada njurarna eller andra organ.
- När njurarna är ur buken, försiktigt separat från de omgivande fett precis tillräckligt för att visualisera njurbäckenet, en liten vit prick (figur 1B). Tryck överflödigt fett till en sida eller ta bort om det behövs. Glöm inte att ta bort binjuren, ligger nära den övre pol njuren eller njure kapseln.
- Med stängt pincett till tryck nedåt på höger sida av njuren så att njurbäckenet förblir i vyn, greppa den inlästa insulinspruta med höger hand och håll den parallellt med arbetsytor med nålen riktad mot njurbäckenet (figur 2E). Stick in nålen försiktigt i njurbäckenet av immobiliserade njure som visas i figur 1B.
- Injicera lösningen snabbt inom tre s. Ungefär en tredjedel av njure kan rensa och ändra färg till vitt.
Obs: Det är vanligt att iaktta vätska uppbyggd i de njure kapsel följande injektion samt bildandet av en hematom. Vissa skador är nödvändigt för att uppnå en tillräcklig nivå av DNA transfection för upptäckt. - Håll nålen på plats för ca 10 s för att förhindra återflödet av lösningen. Sedan försiktigt och långsamt dra ut nålen. Returnera orgeln till bukhålan genom försiktigt sträcker sig snittet webbplatsen och använda stängt pincett.
- Sutur muskellagrar av djuret med 5-0 resorberbara suturer, utsläppande 2-4 oberoende knop.
- Sutur hudlagret djuret med 5-0 eller 6-0 icke-absorberbara nylon suturer, utsläppande 2-4 oberoende knop.
Obs: Kirurgiska verktyg kan återanvändas efter att placera i ett sterilt pärla bad och kyls ner.
Figur 1. Rätta snittet webbplatsen och nål placering för hydrodynamiska njurbäckenet injektioner. (A) snittet (röda linjen) bör vara beläget ungefär 1 cm från ryggraden och ca 1 cm nedanför bröstkorgen av musen. (B) efter njuren är exponerad via flanken snittet, bör njurbäckenet ligger som en liten gulaktig klar/vit prick halvvägs ner njuren. Injektionen bör inte störa den nedsatt ven, nedsatt artär eller urinledaren. Nålen på sprutan insulin sätts direkt in i njurbäckenet som visas till ett djup av ca 0,5 cm och snabbt nedtryckt i 2-3 s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. De kirurgiska åtgärder för att utföra njurbäckenet hydrodynamiska injektion av plasmid DNA. (A) pincett Nyp i huden så att kirurgen att göra en ~ 1 cm flanken snitt med en skalpell, först genom hudlagret, sedan genom muskellagrar. B) med två par stängt pincett att öppna kirurgiska såret, njuren är visualiseras i buken om möjligt. (C) med lätt tryck på buken, utan att vidröra någon organ direkt, exponeras njuren genom flanken snittet. (D) fett är försiktigt dissekerade från njuren, störa så lite som möjligt att få tillträde till njurbäckenet. (E) att trycka till höger i den vänstra njuren att bättre visualisera njurbäckenet, sprutan hålls med tummen på depressor och nålen placeras försiktigt men bestämt in i njurbäckenet. (F) följande den < 3 s injektion, clearing kan observeras i områdena i njuren som fått huvuddelen av injektionen. (G) steril lila vicryl resorberbara suturer används för att göra 2-4 oberoende knop i muskellagrar. (H) steril blå nylon icke-resorberbara suturer används för att göra 2-4 oberoende knop i hudlagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Återhämtning från kirurgi och postoperativ övervakning.
- Ge möss med smärtstillande enligt institutets IACUC krav för smärtkontroll. Till exempel administrera buprenorfin subkutant varje 8-12 h för 48 h postoperativt om NSAID-relaterade njurskada är undvikas för studien.
- Hålla mössen på värme pad och deltog av prövaren tills fullt mobila med sternala koordinationsrubbning. När helt återställd, tillbaka möss till en ren bur som innehåller en liten mängd sängkläder från deras hem bur att minska stress. Gör inte hus möss utsatts för kirurgi med naiva möss.
Obs: Villkora av mössen kommer att förbättras snabbt, förekommer få normala beteende inom 24-48 h. - Ge salthaltiga vätskor och ökad smärtlindring till möss som visas stressad att förbättra deras tillstånd. Om möss inte tillfrisknar snabbt, mäta musen vikt och avliva möss som har förlorat mer än 20% av sin initiala kroppsvikt. Euthanize möss förekommer uremiskt eller annars döende. Möjliga hälsoproblem beskrivs i tabell 1.
Obs: Möss bort ibland deras yttre suturer eller suturerna lossnat innan sårslutning. Stackars suturering av muskellagrar med en intakt hud lager kan resultera i ett bråck på webbplatsen snitt indikeras av utbuktande. I sådana fall Placera musen under anestesi (isofluran är snabbare än ketamin/xylazin) och reparera operationsområdet med nya suturer så snart som möjligt. Om icke-absorberbara hud suturer kvarstår efter 10-14 dagar, ta bort dem. Möss kan ibland ta bort deras bur-kompisar suturer eller slåss. Ta bort angriparen möss till deras egen bur med anrikning att hindra dem från att göra illa andra möss så snart sådant beteende identifieras. - När hälsa eller experimentella slutpunkter nås, eutanasi möss av koldioxid inandning eller isofluran överdosering följt av en sekundär metod för dödshjälp såsom cervikal dislokation enligt normalförfarande för dödshjälp i Placera vid institutionen
| Orsak | Uppkomsten | Antal möss påverkas | Symtom | Omedelbara åtgärder | Långsiktig lösning | ||
| DNA som finns endotoxiner | 6-40 h efter injektion. | Kan påverka varje mus som gett förorenade DNA beredning. | Andningsproblem, tecken på svår smärta, organsvikt, död. | Avliva de drabbade möss. Testa varje injicerade komponent för endotoxiner med Limulus Amebocyte Lysate. | Använd endotoxinfria maxiprep kit och endast sterila och nya eller NaOH-behandlade labware. Använd en kommersiellt tillgängliga, endotoxin-testade buffert att späda ut DNA. | ||
| Anestesi överdosering | Under operation, antingen före eller efter DNA injektion. | Kan påverka endast yngre, mindre eller smalare möss. | Upphöra andning samtidigt på värmedyna, urinering. | Minska anestesi för återstående möss. | Dubbelkolla förberedelse och protokoll för dosering noggrannhet. Utesluta ”hastigheter”. Rådfråga veterinär om lämplig dos användes. | ||
| Luftbubbla i sprutan eller nål för injektion | Omedelbart efter njurbäckenet injektion. | Om inte alla sprutor lastades slarvigt, påverkar detta endast en mus. | Kippar efter andan. | Kontrollera återstående sprutor för tecken på luftbubblor. | Sprutor noggrant förbereda, trycka på sprutan för att ta bort bubblor längst ned. Förbättra ljusförhållanden bättre visualisera bubblor. | ||
| Öppnandet av operationsområdet | 12-72 h efter injektion | En eller flera möss. Ibland hela buren. | Gapande sår, oftast inga andra nöd | Upprepa suturering för att reparera såret noggrant under isofluran anestesi med steril teknik. Kan behöva vattna med koksaltlösning eller ta bort såret kantlinjer med sax. | Om alla möss har mycket kort eller saknas suturer, kan det finnas en mus att ta bort dem, så möss kan avskiljas. Förbättra suturering teknik. Använda oberoende knop. | ||
| Bråck på operationsstället | 48 + h efter injektion | En eller flera möss. | Gravhögen är synliga på operationsområdet. | Under isofluran anestesi med steril teknik, skär läkta huden för att avslöja bråck av muskellagrar. Ersätta organ i bukhinnan, reparera muskellagrar med resorberbara suturer och stänga webbplatsen. | Detta indikerar dålig suturering av muskellagrar. Förbättra suturering teknik. Använda oberoende knop. | ||
| Njursvikt | 48 + h efter injektion | En eller flera möss. | Vikt förlust av > 20%, möjligen blir uremiskt, böjd kroppshållning | Ge koksaltlösning och öka eller förlänga analgesi. Om ingen förbättring observeras, offra de drabbade möss. | Ändra tillståndet sjukdomen av djuret att göra det mindre allvarliga. Ändra den transgenens vara mindre stark eller inducerbara. Injicera möss vid en tidigare tidpunkt i sjukdomsförloppet. | ||
| Abcess eller infektion | Dagar till veckor efter operation | En eller flera möss. | Påtaglig abcess eller tecken på sepsis | Avliva de drabbade möss. Begäran obduktion bekräfta misstänkt infektion. | Detta kan inträffa när den kirurgiska villkor och injektioner inte är tillräckligt sterilt. Det förfarande som visas är för möss med ett normalt immunförsvar men ytterligare försiktighetsåtgärder måste vidtas i inställningen av immunsupprimerade djur såsom de behandlas med cyklofosfamid. | ||
Tabell 1. Tabell över potentiella hälsoproblem som uppstått under protokollet njurbäckenet injektion. Även om de lista hälsoproblem inte är gemensam, finns det ett antal utredare-relaterade fel som kan uppstå under förfarandet. Denna tabell kan vara till stöd i förebyggande och diagnos av hälsoproblem samt för genomförandet av möjliga åtgärder för att förhindra att sådana problem uppstår i framtiden. Med praxis, bör utredare förvänta sig sällan hälsoproblem och dödlighet på grund av förfarandet.
3. bedöma injektion effektivitet och transgenens effekter
- Använd en väl utvecklad analys för den önskade transgenens för att bedöma transfection effektiviteten. Använd positiva och negativa kontroller noga kontrollera analysen är specifika.
Obs: Beroende på val som Promotorn, möss kommer troligen att ha det starkaste transgenens uttrycket på dag 1; alltid inom den första veckan efter injektionen. - Utföra levande djur avbildning av luciferas genom att införa 10 µg av luciferas-uttryckande plasmid såsom förbättrad firefly luciferas i utspädda DNA för injektion.
- Ren alla ytor utsatta för möss. Placera den första buren av möss i plenisalen och försegla den stängs. Se till att det finns tillräckligt isofluran för experimentet genom att kontrollera gage; om inte, Lägg till isofluran tills nivån når raden ”max”. Initiera flödet av isofluran genom att vrida ratten för isofluran att 3.5 och syre till 2.
- Injicera varje mus av intraperitoneal injektion med 100 µL av tinade 30 mg/mL luciferin. Registrera tid.
- Öppna programvaran för att styra avbildning maskinen genom att klicka på musikonen orange och gula. Välj rätt initialerna från den nedrullningsbara menyn bredvid ”User ID” under ”Välj/Add User ID” Klicka på ”OK”. På den övre menyraden, klicka på ”förvärv” och välj ”Spara automatiskt till...” från droppa-ned menyn. Välj mappen eller skapa en ny mapp för att spara data till.
- Gå till rutan bild förvärv i det nedre högra hörnet. Kontrollera att automatiska inställningar är följande: Binning, medium; F/Stop, 1 för självlysande, 8 för fotografi; Utsläpp Filter, öppen; Imaging läge, kontrollerar bredvid självlysande, Fotografi, överlägg och justering endast. Klicka på ”Starta” för att initialisera systemet och vänta för initiering till slut, sedan ändra ”synfältet” till ”E” för att bilden fem möss.
- Vrid ventilen för den anestesi slangar så att nosecones inuti maskinen administrerar isofluran. Placera djuren inuti avbildning maskinen i önskad ordning på deras magar med ryggen vänd kameran ovan att visualisera njuren. Om mer än en bur ska avbildas, placera nästa buren i isofluran kammaren.
- 5-10 min efter luciferin injektion, tryck på ”Hämta” för att ta bilden.
- ”Verktygspaletten” på höger sida, klicka på ”bild justera”. Under ”färgskala” minska ”Min” Bar tills uttryck är tydlig i alla förväntade möss, visualiseras som lila över varje mus njure. Om några möss inte visar uttrycket, återfå möss med 100 µL av luciferin och vänta minst 3 min innan autentiseringsbiljett.
- Om bilden har mättat pixlar, minska exponeringstiden och hämta igen för att få en kvantitativ bild eftersom närvaron av mättade pixlar kommer resultera i att underskatta transfection effektivitet. Den lägsta möjliga exponeringstiden är 0,5 s.
- Om bilden visar endast svag genuttryck på första exponeringstiden, öka exponeringstiden upp till 2 min och återfå. Varje gång bilden är återtogs, är uppgifterna har sparats automatiskt i den valda mappen så att alla bilder är tillgängliga för vidare analys senare.
- Upprepa imaging steg för efterföljande burar av möss.
- Ta bort mössen från imaging maskin. Stänga av gasen. Ren kammaren, nosecones och bildbehandling scenen. Stäng programmet.
Obs: Programmet kommer att fråga till ”Spara datamängden”. Detta avser de manipulationer som gjort att datamängden, inte data själv.- Klicka ”Ja” för att spara ändringar till omfattningen och regioner av intresse (ROIs). Klicka på ”Nej” för att återgå till de ursprungliga inställningarna för bilderna.
- Öppna programvaran för dataanalys. Paletten ”verktyg” Klicka på ”ROI verktyg”. Klicka på cirkel-ikonen och klicka på ”1” i den nedrullningsbara menyn att placera en ny ROI i bildfönstret som indikeras av en röd oval med fyra rutor runt den. Justera storleken på ROI genom att placera muspekaren över en röd fyrkant och dra för att omsluta området lila överliggande injicerade njuren.
- Med markören över en röd fyrkant på ROI, högerklicka och välj ”Duplicera ROI” för att skapa en ny ROI i bildfönstret och flytta den till nästa musen. Upprepa proceduren tills alla möss i bilden har en ROI över injicerade njure.
- I menyn direkt ovanför bilden, ändra ”enheter” från ”räknas” till ”Radiance (fotoner)”. För att exportera ROI data, i ”verktygspaletten”, klicka ”ROI verktyg” Klicka på ikonen penna/linjalen för att skapa ett kalkylblad av mätningar. Använd ”Avg Radiance” mätning i ytterligare analys i data analys och statistik program för val.
- Utföra färgning av sektioner som beskrivs11.
Obs: Injektionen inte transfect hela njuren lika så olika sektioner kommer att fånga olika transfection effektivitetsvinster11. Samtidig injektion av pärlor såsom fluorescerande latex mikrosfärer kan hjälpa till att identifiera regioner förväntas vara transgenens-positiv (figur 3D)11. Optimering av protokollet färgning är oerhört viktigt. - Utföra Western blot för att identifiera gen av intresse i transfekterade njuren.
Obs: Skörd av organ för protein extrakt måste göras på is. Återigen, Använd inte en liten bit av orgeln eftersom detta område inte kan har transfekterats väl. Transfection är ojämnt fördelad i hela orgeln så kombinera olika områden och samla dem. Njurbäckenet hydrodynamiska injektion av en plasmid som producerar hormonet erytropoietin resulterade i en blygsam ökning i hematokrit, så det förväntas att utsöndras transgenens produkter ska finnas i omlopp11. - För långvarigt hög nivå uttryck av transgener, kombinera en integrerande vector systemet med immunsuppressiva medel såsom cyklofosfamid. Immunsvaret mot transgenens sker över först flera veckor efter injektion och är robust11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgi och injektion tekniken är enkla att utföra en gång behärskar, kräver ingen större utrustning eller dyra material. Om nya flanken-snitt njure kirurgi, bör en träningsdag på flera möss planerad till dödshjälp tillåtas där mössen inte är återställda efter operationen eftersom det första försöket på denna operation kan ta mycket längre tid än normalt. Alternativt, utredare bekant med liknande tekniker kan vara ganska enkelt. Följ noga på bilden i figur 1 och bildmässiga anvisningarna i figur 2. För att korrekt placera snittet, kan kirurgen använda fingrar trycka på musens mage medan den lägger på sin sida. Njuren är visualiseras genom en liten knöl som stiger nära ryggraden med mild buktryck och snittet bör göras över detta område (figur 1 och figur 2). Det är viktigt att göra snitt genom hud och muskel lagren i rätt storlek (figur 1). Om snittet är för stor, njuren kommer enkelt kan glida tillbaka i bukhålan, försvårar injektion. Om snittet är för liten, blir det svårt att driva njuren ur bukhålan och organskada kan uppstå. En annan viktig punkt är placering av nålen i njurbäckenet. Kirurgen bör pressa njuren ned med stängt pincett och sedan för in nålen i njurbäckenet vinkel parallellt med arbetsyta så att de flesta av injektionsvolymen går direkt in i njure parenkymet (figur 2). Det är viktigt att injektionen utföras så snabbt som möjligt att inducera hydrodynamiska trycket krävs för njure transfection.
Möss i olika stammar, ålder, vikt eller kön har skillnader i position i njurar och mängden fett kring njuren, så vissa justeringar kan vara nödvändigt att arbeta med möss av intresse. Den första kirurgiska försök som återvinns möss bör om möjligt innehålla en omedelbar avläsning av njure-specifika genuttryck, såsom luciferas imaging (figur 3A). Om unga möss används, är det förväntade resultatet att alla möss har en utstrålning som är inom en storleksordning (figur 3B). Ibland, även efter en andra injektion av luciferin framgår det av imaging att en mus eller möss lyckats bli transfekterade på en nivå som är jämförbar med andra eller att vissa injicerade möss även helt saknas i genuttryck. Sådana möss kan uteslutas från studien på grund av misslyckade transgenens leverans. Om många av möss saknar genuttryck, bör då kirurgen minska tiden för injektion av DNA lösningen. Underlåtenhet att framkalla den nödvändiga skadan genom det höga trycket av injektion är den mest sannolika boven för konsekventa brist på genuttryck. Möss bör följas noggrant följande kirurgi för potentiella hälsoproblem (se tabell 1 för potentiella hälsoproblem med åtföljande lösningar och samråda med institutionens veterinära team som behövs). Efter en inledande utbildningsperioden, bör operationen själv ta mindre än tio minuter. Kirurgiska perioden bör göras så kort som möjligt genom att driva på en mus samtidigt för att förhindra uttorkning av vävnader under operation. Merparten av investeringen i tid i den här proceduren är på grund av induktion av återhämtning från den ketamin/xylazin bedövningsmedel. Två erfarna personal arbetar som ett team bör förvänta sig att utföra upp till tio operationer per dag, med femton som högst rimligt.
Forskare bör räkna med ett lågt antal celler att färga mycket positivt för transgenens inom de första dagarna efter injektionen. Dessa positiva celler kommer att vara lokaliserade i fläckar omgivande områden där injektionen vätska infiltreras njuren (figur 3 c-D). Vissa delar av njuren blir helt negativ för transfekterade celler. Sådana negativa områden kommer också vara saknas i erytrocyter och har helt normal histologi sedan injektionen inte nådde dessa områden. Färgning protokoll och initiativtagare ska optimeras noggrant för att fånga genuttryck. Utredarna bör förvänta sig att cellen typer transfekterade kommer vara variabel, de gen uttryck inom låg andelen celler transfekterade är höga och lokaliseringen av proteiner inuti cellerna kanske inte som förväntat på grund av höga nivåer av uttryck (figur 3D).
Figur 3. Hydrodynamiska njurbäckenet injektion resulterar i njure-specifika genuttryck luciferas och TdTomato. (A) Kandeekane 7-8 vecka gamla manliga möss fick hydrodynamiska njurbäckenet injektioner av 20 µg av pTEeL, en plasmid uttrycker enhanced firefly luciferas från EF-1α arrangören. Möss 2, 3 och 5 var också injiceras med 20 µg av fluorescerande reporter plasmid. (B) dot tomt strålglans erhållits från möss visat (a). (C och D) Möss fick antingen hydrodynamisk leverans buffert ensam (C) eller (D) fluorescerande mikrosfärer (ljusa gröna prickar) och pEF1α-TdTomato uttrycker röd fluorescerande reportern TdTomato från EF-1α arrangören. Proximala tubuli var målat av Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA; grön) och transfekterade celler visas efter färgning med anti-RFP antikropp att förstärka TdTomato signalen (röd). Kärnorna är färgade av DAPI (blå). Bilderna som visas i (C) och (D) är 13,2 mm x 17,5 mm. felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskrivs en robust metod för att uppnå reproducerbara genuttryck specifikt i njuren. I händerna på en måttligt erfaren kirurg har vi hittat procentandelen av möss transfekterade genom denna teknik att vara i storleksordningen 50-100%, beroende på mus ålder och känsligheten hos avläsningen av transgenens. Nivån på luciferas genuttryck var över bakgrunden i flera månader i möss som fick piggyBac transposoner och underhålls helt för flera veckor hos immunsupprimerade möss som får samma transposoner11. Medan många celler färgas ljust för transgenens i områden nära injektionsstället, transfection totaleffektiviteten var relativt låg (figur 3D). Den viktigaste materiellt för att uppnå det önskade resultatet är injektionssprutan själv. Detta måste vara en 29G x ½ ”insulinspruta med en fastsatt nål och ingen säkerhet för att hindra injektionen. Injektionen måste vara snabb, inom tre s. Plasmid DNA beredning bör vara ren, med mycket låg endotoxin och bakteriell genomisk DNA nivåer19.
Det är tänkbart att injektioner av andra ämnen, såsom RNA, virus eller protein, kan göras på ett liknande sätt. I njurbäckenet var överlägsen som en väg av posten till andra injektionsställen som testas, till exempel njurvenen eller direktinsprutning av njure parenkymet. Dessa injektioner ledde till blödningar och lägre gen uttryck11. Eftersom njurbäckenet är en elastisk struktur som ibland krävs att hålla urinen rinner tillbaka, kan det vara bättre kunna sträcka och rymma nålen. Läckage av urin från hålet skapad av insulin sprutan eller DNA lösningen har inte observerats, vilket tyder på att njurbäckenet repareras snabbt. Den exakta mekanismen genom vilken den injicerade vätskan transfects njuren har inte studerats på djupet har för levern, till exempel. Framtida elektronmikroskopi studier kan belysa denna mekanism ytterligare. Retrograd beskaffenhet injektionen har prioritet däri hydrodynamiska svans ven injektion metod vänder flödet av nedsatt ven20 och andra framgångsrika metoder för njure transfection har injicerat via njurvenen12, 13 , 14 , 21. njurskada är sannolikt krävs för optimal transfection effektivitetsvinster så vi hypotes att transfection sker via skador till cellmembranet orsakad av snabb, hög volym injektionen. Podocytes, tubuli, och samla kanaler har direkt gränssnitt med urin utrymme som sin viktigaste funktion är att filtrera och koncentrera urinen.
Även om reproducerbara och njure-specifika, begränsas denna metod av den relativt låga transfection effektivitet observerades (figur 3D). Hydrodynamiska njurbäckenet injektion är inte ett substitut för skapandet av en transgena djur som driver transgenens från en njure-specifika promotorn, där varje cell i en viss subtyp i djuret skulle uttrycka genen av intresse. Hellre denna metod är anpassad till genen överföring strategier för sjukdomar där ett litet antal korrigerade celler skulle ha en dramatisk effekt på fenotypen, för utsöndringen av hormoner eller andra ämnen som normalt produceras av njure eller för att skapa en befolkningen av sällsynta celler som kommer att utöva viss positiv effekt på njuren till reparera eller återskapa den. Alternativt kan det också användas på motsatt sätt att utveckla en ny modell av njurskada genom att införa en transgenens med en negativ inverkan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja och förklara någon intressekonflikt.
Acknowledgments
En karriär Development Award från Department of Veterans Affairs [BX002797] stödde L.E.W. och National Institutes of Health [R01-DK095867] och American Heart Association [15GRNT25700209] stöds J.C. National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] och Vanderbilt centrum för njursjukdom stöds M.H.W. Detta material är resultatet av arbete stödjas med resurser och användning av anläggningar på VA Tennessee Valley Healthcare System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic - Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia - Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads - 15" x 21" - need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic - Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
