Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

يصف لنا هنا مقايسة الخلية الحرة بيوكيميائية فلوروميتريك للبت في هدل-وبيروكسيد. هذا الفحص السريع واستنساخه يمكن استخدامها لتحديد دالة الحميد في دراسات واسعة النطاق، ويمكن أن تسهم في فهمنا للدالة الكوليسترول الجيد في الأمراض التي تصيب البشر.

Abstract

مستويات الكوليسترول في الدم (HDL-C) منخفض الكثافة lipoprotein واحدة من تنبؤ السلبية مستقلة أقوى من أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (الرسوم التعويضية). هيكل ووظيفة الحميد بدلاً من HDL-C يمكن التنبؤ بدقة أكثر تصلب الشرايين. تحدث عدة الحميد البروتين والدهن التغييرات التركيبية التي تنال من الدالة الحميد في الولايات الملتهبة مثل تصلب الشرايين. الدالة الحميد يتحدد عادة بالخلية على أساس فحوصات مثل الإنزيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم ولكن هذه الاختبارات لها عدة عيوب عدم توحيد. فحوصات مجانية من الخلية قد تعطي تدابير أقوى الحميد وظيفة مقارنة بفحوصات يستند إلى الخلية. ويضعف أكسدة الحميد الحميد الدالة. الحميد دوراً رئيسيا في النقل بيروكسايد المادة الدهنية وهي المتعلقة بكمية عالية من الدهون الأكاسيد الفوقية الشاذ الحميد الدالة. ينبغي النظر في التفاعلات الدهن-التحقيق عند تفسير نتائج الأسفار غير الانزيمية فحوصات لقياس حالة الأكسدة الدهنية. وهذا دافع لنا لتطوير أسلوب الانزيمية الخلية الحرة بيوكيميائية لتقييم الحميد بيروكسايد محتوى الدهون (هدلوكس) أن يسهم في الخلل الوظيفي الحميد. يستند هذا الأسلوب على البيروكسيديز الفجل إنزيم (HRP) و fluorochrome Amplex الأحمر التي يمكن تحديدها كمياً (بدون الكوليسترول أوكسيديز) محتوى الدهن بيروكسايد كل مغ من HDL-C. هنا بروتوكول تحديد ديسكريبيدفور HDL-وبيروكسيد استخدام الكاشف فلوروتشرومي. يمكن الحد من تقلب المقايسة بالتوحيد الصارم للظروف التجريبية. أعلى هدلوكس القيم المرتبطة بانخفاض وظيفة المضادة للأكسدة الكوليسترول الجيد. قراءات من هذا التحليل المقترنة مع قراءات لفحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، تدابير بديلة لأمراض القلب والأوعية الدموية والتهاب النظامية والخلل المناعي وتعمل يرتبط بها من مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض. وهذا النهج التقني هو وسيلة قوية لتقييم دالة الكوليسترول الجيد في الأمراض البشرية فيها التهاب النظامية والأكسدة والدهون المؤكسدة لها دور رئيسي (مثل تصلب الشرايين).

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (الرسوم التعويضية) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1،2. وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن انخفاض مستويات البروتين الدهني الكثافة (HDL) الكوليسترول عموما ترتبط عكسيا مع المخاطر لتطوير تصلب الشرايين1،2. على الرغم من اعتماد العديد من الدراسات بدور أثيروبروتيكتيفي الحميد1،2، هو الآلية التي يخفف الحميد بدء وتطور تصلب الشرايين معقدة 3،4. ومن ثم، اقترح أن هيكل معقد ووظيفة الحميد بدلاً من المستوى المطلق قد التنبؤ أكثر دقة بتصلب الشرايين 5،6،،من78. تحدث عدة الحميد البروتين والدهن التغييرات التركيبية التي تنال من الدالة الحميد في الولايات الملتهبة مثل تصلب الشرايين. هذه ط) خفض بنسبة الكولسترول في الدم افلوكس المحتملة 9، ثانيا) إنقاص للالتهابات وزيادة البروتينات برو-الالتهابات المرتبطة بالحميد 6،7، ثالثا) انخفاض مستويات مضادات الأكسدة عامل والنشاط و HDLs القدرة تمنع أكسدة "البروتين الدهني منخفض الكثافة" (لدلوكس)10 والرابع) زيادة الدهن هيدرو فوق أكسيد تركيز المحتوى والأكسدة النشاط (هدلوكس)9،11. فحوصات قوية أن تقييم وظائف بليوتروبيك الحميد (مثل efflux الكولسترول، الدالة المضادة للأكسدة) قد تكمل تصميم الحميد-HDL-C في العيادة.

هو عادة بالأساليب المستندة إلى الخلية مثل الكوليسترول efflux المقايسة8،12،،من1314تقييم الدالة الحميد. هذه الأساليب والقيود الرئيسية بما في ذلك تغايرية مهمة فيما يتعلق بأنواع الخلايا المستخدمة ونوع قراءات أفادت، والافتقار إلى التوحيد وآثار الخلط الثلاثية 7،15. هذه العيوب تثير صعوبات لدراسات سريرية كبيرة16. فحوصات مجانية من الخلية قد تعطي تدابير أقوى الحميد وظيفة مقارنة بفحوصات يستند إلى الخلية. افلوكس نسبة الكولسترول في الدم واحدة من أهم وظائف الحميد ولكن فإنه لا يمكن تحديده إلا بفحوصات يستند إلى الخلية. نهج أخرى لتحديد دالة الحميد مثل البروتيوميات17،،من1819،20،21،،من2223، 24 وفحوصات إنزيمية الوحيدات يستند إلى الخلية الحميد الدالة 17،،من2225 لا تم توحيد ولا يمكن استخدامها في الدراسات الإنسانية الواسعة النطاق.

وقد هدل الهامة المضادة للأكسدة أثيروبروتيكتيفي تأثير5،6،،من78. وقد تحدد وظيفة المضادة للأكسدة الكوليسترول الجيد حضور LDL في السابق الخلية الحرة فحوصات فلوروميتريك 26. هذه الأساليب فلوروميتريك البيوكيميائية الحميد مضادات الأكسدة مهمة وضعت أصلاً نافاب محمد والن فوغلمان و الزملاء على26. على الرغم من أن العديد من الدراسات البشرية قد استخدمت هذه الأساليب لتحديد الحميد الدالة 17،،من1819،،من2021،22،23 ،24، الدهون (الكوليسترول الجيد)-المادة الدهنية (LDL) والتفاعلات fluorochrome الدهن قد تحد من إمكانية تكرار نتائج لهذه الخلية الحرة غير الانزيمية البيوكيميائية فحوصات الحميد الدالة27،28.

الفائدة الأخيرة ركزت على العواقب الوظيفية لأكسدة الكوليسترول الجيد هو نتيجة لأكسدة كل من الدهون والبروتينات داخل الحميد 27،،من2930. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أكسدة الكوليسترول الجيد يضعف الحميد الدالة 27،،من2930. الحميد دوراً رئيسيا في النقل بيروكسايد المادة الدهنية وهي المتعلقة بكمية عالية من الدهون الأكاسيد الفوقية الشاذ الحميد الدالة. وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد الحميد الدالة 9،17،،من2031 الحميد محتوى الدهون بيروكسايد ونظرا لمحدودية المعروفة لفحوصات مسبقة الحميد الدالة7، 15،،من2732، قمنا بتطوير أسلوب بديل فلوروميتريك التي يوضحها الحميد دهن محتوى بيروكسايد (هدلوكس) 32. يستند هذا الأسلوب الإنزيم الفجل البيروكسيديز (HRP) و fluorochrome Amplex الأحمر التي يمكن تحديدها كمياً (بدون الكوليسترول أوكسيديز) محتوى الدهن بيروكسايد كل ملغ من الكوليسترول الجيد-ج 32. البيوكيميائية مبدأ المقايسة يرد في الشكل 1. وقد أظهرنا أن هذا النهج القائم على الأسفار ليس لديه قيود مسبقة الحميد الدالة فحوصات27،28. تم زيادة صقل هذا التحليل وموحدة في المختبر حيث أنه يمكن استخدامه موثوق في الدراسات الإنسانية واسعة النطاق حتى مع البلازما cryopreserved 32،،من3334، 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42-قراءات من هذا الإنزيم يرتبط مع قراءات لفحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، تدابير بديلة لأمراض القلب والأوعية الدموية والتهاب النظامية والخلل المناعي وتعمل يرتبط بها من مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39-هنا، يمكننا وصف هذا الأسلوب بسيطة، لكنها قوية لقياس الدهن الحميد بيروكسايد المحتوى (هدلوكس). يمكن استخدام هذا التحليل كأداة للإجابة على الأسئلة البحثية الهامة فيما يتعلق بالدور وظيفة الكوليسترول الجيد في الأمراض البشرية فيها التهاب النظامية والأكسدة والدهون المؤكسدة لها دور رئيسي (مثل تصلب الشرايين)32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب باستخدام العينات البيولوجية البشرية بموافقة الأخلاق من الجامعة "كاليفورنيا لوس أنجليس"، ولوس أنجليس ولجنة "الأخلاقيات البشرية مستشفى الفريد"، ملبورن.

ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات الدالة fluorochrome الحميد المقايسة (انظر المناقشة) 32. أدناه ونحن سوف تصف البروتوكول الذي يعطي نتائج أكثر اتساقا واستنساخه. نظرة عامة التحليل ويبين الشكل 2-

1-"تجهيز العينة"

المصل طازجة وغير هيموليزيد
  1. الاستخدام (يمكن جمعها في أنابيب فاصل المصل) أو سترات البلازما التي تم الحصول عليها بعد 12-14 ساعة صيام. في حالة استخدام عينات cryopreserved، تتضمن عنصر التحكم المناسب كما هو موضح في هذا البروتوكول-

2. اليوم 0-التحضير للمقايسة

  1. تحضير عمل تخطيط للتجربة مع الضوابط المناسبة، والعينات وإنشاء نسخ متماثلة. قم بتشغيل كل عينة على الأقل في تريبليكاتيس. ممثل 96 تخطيطاً جيدا ويرد في الشكل 3-
  2. حساب كافة وحدات التخزين من الكواشف التي سيتم استخدامها مقايسة على أساس عدد من العينات و replicates.
    ملاحظة: تشمل وحدة تخزين 10% إضافية في كل سهم العامل للتأكد من أن هناك ما يكفي وحدة التخزين لكل كاشف للتجربة محددة.
  3. تسمية أنابيب كل ما يلزم لجميع الخطوات المختلفة للتحليل مثلاً لفصل الكوليسترول الجيد، وقياس HDL-c (اختياري) وفي فلوروتشروميساي-

3. يوم 1--إعداد الضوابط

    1. إنشاء نموذج عنصر تحكم من البلازما المجمعة أو المصل إعداد التحكم المجمعة الخاصة بالدراسة من دراسة جميع العينات. في حالة تشغيل عينات 20 في كل لوحة في ثلاث نسخ، الجمع بين 10 ميليلتر من كل نموذج في عنصر تحكم 200 ميليلتر المجمعة. تعطي قاسمة منفصل لعنصر التحكم هذا المجمع للمختبرات السريرية لتحديد قيمة عنصر التحكم هذا الحميد-ج.
      ملاحظة: استخدم عنصر التحكم هذا المجمع لتوحيد المقايسة وحساب ليعرف كل شيء ممكن (مثل نوع المصل مصفوفة مقابل البلازما، ودورات تجميد أذاب، نعد) والارباك غير معروف قد تؤثر على تجريبية تقلب 27 ، 28-
  2. الإعداد الخاصة بمختبر مراقبة الجودة (جمعية قطر الخيرية)
    1. إعداد مخزون كبير من الكوليسترول الجيد في كل مختبر (على سبيل المثال الحميد معزولة عن 5 مل بلازما من المانحين صحي 10) وكريوبريسيرفي مختبرين عدة من هذا المخزون إلى أدنى حد من دورات تجميد أذاب.
    2. استخدام على الأقل 10 مختلفة وإنشاء نسخ متماثلة من هذا المخزون لتحديد متوسط قيمة هدلوكس. نطاق مقبول من هدلوكس قياس القيم لكل عينة QC المدرجة في كل والرزن داخل < 15 في المائة معامل الاختلاف من متوسط قيمة هذه.
      3. إعطاء
    3. قاسمة منفصل لعنصر التحكم هذا المجمع للمختبرات السريرية لتحديد قيمة عنصر التحكم هذا (مثلاً 40 مغ/دل) الحميد-ج.
      ملاحظة: اتباع نهج مفصل كيفية استخدام الدم من بنوك الدم لإنشاء عناصر التحكم هذه قد سبق وصف 27 ، ، من 28 32. استخدام جمعية قطر الخيرية إضافية حسب الحاجة (مثل واحد من متبرع سليم يعرف أن لها وظيفة الحميد طبيعية وواحدة من إحدى الجهات مانحة التي من المعروف أنها غير طبيعي إلى حد كبير الحميد الدالة.
  3. الأمثل للإشارات الخلفية والقيم الفارغة (اختياري)
    1. لتقليل الخلفية، إضافة المقدار المناسب من كاتالاز (1-4 U/mL) في المتوسط الحضانة إلى سرعة إزالة المشكلة ح 2 س 2 بسبب تأكسد الجو العفوي من المخازن المؤقتة.
      ملاحظة: حيث يتم يجري طرح القيم من الآبار فارغة (لا الكوليسترول الجيد) من قيم العينات الحميد والنتائج يجري ذكرت بالنسبة لعنصر تحكم مجمعة (التي يتم تضمينها في نفس اللوحة جيدا 96)، وجدنا أن هذه الخطوة لا ليس عمليا أفك t النتائج. وهكذا، الاستغلال الأمثل للإشارات الخلفية مع كاتالاز يمكن حذفها، إذا لزم الأمر.

4. يوم 1--فصل من الكوليسترول الحميد هطول الأمطار باستخدام

ملاحظة: استخدم كاشف عجلت الكوليسترول موحدة متاحة تجارياً لعزل المصل apoB المستنفد وفقا للشركة المصنعة ' s تعليمات. هذه الكواشف تستخدم على نطاق واسع في فحوصات قياس الألوان لتحديد مستويات الكولسترول الحميد.

  1. استخدام الطازجة (أو ذوبان الجليد) عينة البلازما أو المصل.
  2. مزيج من كميات متساوية (مثلاً 80 ميليلتر) من البلازما و "يعجل بالكوليسترول الحميد الكاشف" (20% w/v البولي إثيلين غليكول في المخزن المؤقت جليكاين في pH 10.0 (25 درجة مئوية))-
  3. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  4. الطرد المركزي في 1000-2000 × ز للحد الأدنى 10
  5. نضح المادة طافية (الحميد الكسر)-
  6. من الناحية المثالية استخدام فورا الحميد معزولة فلوروتشروميساي الحميد وبيروكسيد. ومع ذلك، إذا كان يتم تشغيل عدة عينات في نفس اليوم وخطوات أخرى مثل قياس تركيز الكوليسترول كما فعلت، ثم تخزين الحميد معزولة في 4 درجات مئوية واستخدامها في اليوم التالي للدالة فلوروتشروميهدل المقايسة.

5. يوم 1--تصميم من HDL-C في الحميد معزولة

ملاحظة: هذا اختياري إذا كان يتم استخدام القيمة من HDL-C من المختبرات السريرية لتطبيع هدلوكس بمقدار الكوليسترول الجيد-ج.

باستخدام معيار قياس الألوان فحوصات
  1. كوانتيفي الكوليسترول من البلازما، 27. إضافة 50 ميليلتر من "كاشف الكولسترول" في كل بئر وتحديد تركيز الكوليسترول باستخدام قارئ لوحة اللونية ومعيار الكولسترول في كل مجموعة.

6. يوم 2: إعداد الكواشف

  1. حلول "إعداد برنامج الصحة الإنجابية" والكولسترول لحل HRP 5 يو/مليلتر (النطاق 1-10 U/mL)-
  2. إعداد 20 مم الحلول فلوروتشرومي (مثلاً، Amplex الأحمر): ذوبان الجليد قنينة من كاشف fluorochrome و [دمس] إلى درجة حرارة الغرفة. قبل الشروع في الاستخدام، حل كاشف فلوروتشرومي (1 ملغ) في 200 ميليلتر من [دمس]. تخزين حل الأرصدة المجمدة في ≤-20 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  3. إعداد عناصر إيجابية وسلبية: استخدام 1 X ' رد فعل المخزن المؤقت ' دون نسبة الكولسترول في الدم و 20 مم ح 2 س 2 يعمل الحل كعنصر تحكم سلبية وإيجابية، على التوالي.

7. التحليل 2-فلوروتشرومي اليوم

  1. إضافة 50 ميليلتر من 1 س رد فعل المخزن المؤقت فارغة (مراقبة سلبية).
  2. اختياري: إضافة الحل العامل 20 مم من ح 2 س 2 كمراقبة إيجابية في كل لوح.
  3. لتقليل تقلب التجريبية وضمان أن إضافة الكواشف وعينات تتم دائماً وفي الوقت المناسب، إجراء إضافات جميع العينات في 96 جيدا أسفل المائدة المستديرة، واضحة، البوليسترين أو البولي بروبلين لوح منفصل (لوحة 1). ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل كميات محددة إلى 3 96-جيدا لوحات (لوحات 2-4: بوت البوليبروبيلين، مسطحةتوم، أسود) (أن يكون تخطيط متطابقة) ( الشكل 2 و الشكل 3). على سبيل المثال، أولاً بإضافة 160 ميليلتر من الحميد معزولة في كل بئر/عينة من لوحة 1
    1. وثم باستخدام ماصة الأقنية نقل 50 ميليلتر من الكوليسترول من كل بئر/عينة في لوحات أسود 96-جيدا. تغيير نصائح بين كل صف/عمود واستخدم التلميحات غير المصفاة لجميع التحويلات.
  4. ترك عينات في الآبار. عدم تجاهل. وهناك أية خطوات الغسيل بين إضافة الكواشف.
  5. إضافة 50 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية الحل 5 يو/مليلتر (0.25 يو) لكل بئر.
    ملاحظة: استخدم برنامج الصحة الإنجابية قبل إضافة الكاشف فلوروتشرومي.
  6. احتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. عدم تجاهل عينات بعد الحضانة (أي خطوات الغسيل بين إضافات كواشف).
  7. إضافة 50 ميليلتر من فلوروتشروميريجينت لتركيز نهائية من 300 ميكرون. عند هذه النقطة، هو رد فعل مجموع حجم 150 ميليلتر. مزيج جيد وحماية من الضوء.
  8. تقييم قراءات الفلورسنت (في الظلام) كل دقيقة ما يزيد على 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع قارئ لوحة نيون (530/590 nm مرشحات).
    ملاحظة: استخدام فاصل زمني أقصر لمدة 60 دقيقة مع عينات جديدة. وقد وجدنا أن الفحص 120 دقيقة يعطي المزيد من البيانات القابلة لإعادة الإنشاء باستخدام عينات cryopreserved.
  9. تسجيل البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة.

8. تحليل بيانات 3 اليوم

  1. تسجيل الأسفار (وحدات التعسفي) في 120 دقيقة بعد إضافة فلوروتشرومي الكاشف لجميع العينات بما في ذلك الآبار فارغة وكافة عناصر التحكم.
  2. حساب متوسط قيمة الوحدات الفلورية (استناداً على الأقل تريبليكاتيس) (HDL ox_sample). لا تأخذ القيم المتطرفة (> 2 الحزب الديمقراطي الصربي من متوسط القيمة) في الاعتبار-
    3. طرح
  3. fluorescence الخلفية باستخدام المعادلة التالية:
    Equation 1
  4. التطبيع لكمية الكولسترول الحميد (HDL-C): تطبيع قيمة وبيروكسيد دهني هدلوكس لكل عينة (بما في ذلك عنصر التحكم المجمعة) عن طريق HDL-C) (mg/dl). في المقطع "النتائج"، يقدم الحميد الثور ن قياس هدلوكس (HDL-C) ليعكس التعديل ل HDL-c استخدام المعادلة التالية:
    Equation 2
  5. توحيد التعبير عن قيمة وبيروكسيد دهني هدلوكس كل عينة ضد قيمة عنصر تحكم مجمعة. تطبيع n (HDL-C) هدلوكس دهن وبيروكسيد قيمة لكل عينة (تعديل HDL-c) بنون (HDL-C) هدلوكس دهن وبيروكسيد قيمة عنصر التحكم المجمع. في المقطع "النتائج"، يرد الحميد ثور تدبيرا ثور نهدل تعكس التسوية بالنسبة لتقلب التجريبية والحميد-جيم. استخدام المعادلة التالية:
    Equation 3
    ملاحظة: هذا النهج مشابه للنهج التجريبية الأخرى المتبعة للحد من تقلب التجريبية من القياسات مثل وطبعت الدولية نسبة (INR) 44 ، 45. وقد تم التحقق من صحة هذا النهج في الدراسات السريرية 32 ، ، من 33 34 ، ، من 35 36 ، 37 ، 38 ، 39-
  6. إجراء مراقبة جودة النتائج التجريبية باستخدام عينات مراقبة الجودة القياسية. ينبغي لكل مختبر إنشاء ضوابط الجودة الخاصة بهم (جمعية قطر الخيرية). ومن الناحية المثالية هناك مراقبة الجودة نهدلوكس من عينة مع الحميد مختلة المعروفة ومراقبة الجودة نهدلوكس من عينة من المانحين صحية [مثل استخدام المجمع عينة من البالغين الشباب الذين هم المانحون بنك الدم المتبعة ولا الثوي معروفة وعوامل الخطر بالنسبة أمراض القلب والأوعية الدموية بما في ذلك التدخين]. عنصر التحكم هذا الأخير توحد النتائج بين المعامل المختلفة. متوسط قيم هذه جمعية قطر الخيرية هي replicates 5 على الأقل على أساس المنشأة (عادة نستخدم 10 replicates لهذه الخطوة الهامة).
    1. الاختيار ما إذا كان قياس جمعية قطر الخيرية في كل تحليل قد قيم داخل النطاق المتوقع للقيم. افتراض تقلب تجريبية كحد أقصى مقبول بنسبة 15%، ينبغي أن تدخل جميع القيم المقاسة التجريبية في 15 في المائة من متوسط القيم المعروفة للمنشأة ومراقبة الجودة. استخدام المعادلات التالية:
      Equation 4
      Equation 5
      ملاحظة: إذا كانت أما لمراقبة نوعية شملت عينات ( عادي مقابل الحميد مختلة) يعطي قيم هدلوكس خارج النطاق المتوقع (التي أنشئت في كل مختبر) ثم كرر التجربة.
  7. إجراء مراقبة جودة النتائج التجريبية باستخدام معامل الاختلاف (CV) لقياس التغير التجريبية: كرر جميع العينات مع CV % > 15%. استخدام المعادلة التالية:
    Equation 6
    ملاحظة: مقايسة البينية النموذجية (ضمن نفس لوحة) والتحليل بين الوكالات (بين لوحات مختلفة) تجريبية تقلب < 15%. 2) نموذجي السيرة الذاتية داخل مقايسة ما بين 1-7% وإينتيراساي نموذجي السيرة الذاتية ما بين 3-10%-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم إضافة 50 ميليلتر من كل عينة الحميد في كل بئر كما في الخطوة 7، 3. 50 ميليلتر من حل HRP 5 يو/مليلتر (0.25 U) ثم تضاف إلى كل جيدا كما هو الحال في الخطوة 7، 5. هي المحتضنة عينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية كما هو الحال في الخطوة 7، 6. ثم تتم إضافة 50 ميليلتر من كاشف فلوروتشرومي في كل بئر كما في الخطوة 7.7 (تركيز النهائية من 300 ميكرون). ويتم تقييم قراءات الفلورسنت (في الظلام) ثم كل دقيقة أكثر من 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع قارئ لوحة نيون (530/590 nm مرشحات). الأسفار تمثيلية البيانات لعنصر التحكم فارغاً، المجمعة، عينة مع الحميد مختلة المعروفة وعينه مع الحميد طبيعية تظهر في الشكل 4. تظهر بيانات تمثيلية الخام وتحليل النتائج باستخدام المعادلات المبينة في المادة 8 من البروتوكول خطوة بخطوة في الجدول 1- في هذا المثال، استخدمت عينات الحميد الطازجة وعادة يتم الحصول على قيم هدلوكس أعلى مع الحميد الطازجة. على سبيل المثال، قد الحميد المعروف أن فحوصات مستقلة استناداً إلى اختلال وظيفة الحميد ومن شخص مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية تقريبا إضعاف كمية أعلى نسبيا من بيروكسيد دهني مقارنة الحميد المجمعة من المشاركين صحية. يبين الشكل 5 نتائج دراسة الممثل مع المواضيع المعروفة بضعف الحميد الدالة28،32. وكان الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية حوالي 60% أعلى يعني محتوى الدهن الحميد بيروكسايد (كل مغ من HDL-C) مقارنة بالأشخاص غير المصابين. في دراساتنا المنشورة السابقة مع الحميد cryopreserved، هذا الأسلوب كان قادراً على إثبات مالا يقل عن 10% من الاختلافات النسبية في هدلوكس مقارنة بالحميد من مراقبة المجموعات (بدون المرض مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية المزمنة)36،37، 38.

Figure 1
الشكل 1: تحديد الحميد دهن بيروكسايد محتوى كل كمية محددة من HDL-C.
في حالات التهاب النظامية والأكسدة زاد الحميد الدهن الأكاسيد الفوقية (لوه) (هدلوكس) التي ترتبط بضعف الحميد الدالة. برنامج الصحة الإنجابية يحفز أكسدة fluorochrome غير الفلورية إلى الأحمر نيون ريسوروفين. هذه الأكسدة يمكن أن تكون مدفوعة بالأكاسيد الفوقية الذاتية موجودة في رد فعل (OH-) والدهن الحميد الأكاسيد الفوقية (لوه-). دون الكوليسترول أوكسيديز، ريسوروفين (مع برنامج الصحة الإنجابية) يمكن قياس الدهن الحميد مضمن محتوى بيروكسايد كمية محددة من الكوليسترول. يتم طرح إنتاج الخلفية أوه-نتيجة لأكسدة الهواء المخزن المؤقت من قراءات الفلورسنت لكل بئر. وقد ريسوروفين أوتوفلوريسسينسي الحد الأدنى في معظم العينات. وكان هذا الرقم معدلة 32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على سير العمل فلوروتشروميساي الحميد وبيروكسيد.
اليوم 0: التحضير المقايسة: A) 96 تخطيطات لوحة جيدة التصميم، وتقدير حجم حاجة عينات (البلازما/مصل) والكواشف (HRP الإنزيم، fluorochrome كاشف، مخازن، وكاشف شماعة)، تسمية أنابيب
يوم 1: إعداد المقايسة وعزل الحميد: A) إعداد عناصر التحكم (الدراسة المجمعة الخاصة بعنصر التحكم، وضوابط الجودة، عناصر إيجابية وسلبية) ب) الحميد هطول الأمطار باستخدام كاشف الوتد.
يوم 2: إعداد المقايسة (إذا لم تفعل في 1 يوم) والانزيم فلوروتشرومي: A) إعداد الضوابط (الدراسة المجمعة الخاصة بعنصر التحكم، وضوابط الجودة، عناصر إيجابية وسلبية) A) إضافة عينات الحميد: للحد من تقلب التجريبية و التأكد من أنه سوف يتم إضافة الكواشف وعينات دائماً وفي الوقت مناسب فإنه يوصي بأن جميع الإضافات من عينات (مثلاً 160 ميليلتر) تتم أولاً في منفصلة 96 البوليستيرين جيدا لأسفل المائدة المستديرة، واضحة، أو لوحة البوليبروبيلين (لوحة 1). ثم يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل كميات محددة (مثلاً 50 ميليلتر) إلى 3 96-جيدا لوحات (لوحات 2-4: بولي بروبلين، مسطحة القاع، ولوحات سوداء) (أن يكون تخطيط متطابقة). ب) إضافة لبرنامج الصحة الإنجابية: إضافة 50 ميليلتر من 5 يو/مليلتر (0.25 يو) لكل جيدا باستخدام ماصة الأقنية ج) إينكوباتي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة د) إضافة 50 ميليلتر من 300 ميكرون/جيدا من فلوروتشرومي الكاشف لكل أيضا استخدام الأقنية ماصة ه) تقييم قراءات الفلورسنت (في الظلام) كل دقيقة أكثر من 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع قارئ لوحة نيون (530/590 nm مرشحات).
يوم 3: تحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تخطيط الممثل من لوحات جيدا 96 التي تستخدم عادة في الدالة فلوروتشرومي الحميد المقايسة.
الاختلافات في توقيت إضافة عينات الحميد في الآبار للوحة يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في أكسدة تلقائية بين آبار مختلفة. وللحد من تقلب التجريبية، تجنب الأكسدة التلقائية متغير بين آبار مختلفة والتأكد من أنه سوف يتم إضافة الكواشف وعينات دائماً وفي الوقت المناسب، من المستحسن أن يتم جميع الإضافات من عينات (مثلاً 160 ميليلتر) أولاً القيام بذلك في منفصلة 96 البوليستيرين جيدا لأسفل المائدة المستديرة، واضحة، أو لوحة البوليبروبيلين (لوحة 1). ثم يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل كميات محددة (مثلاً 50 ميليلتر) إلى 3 96-جيدا لوحات (لوحات 2-4: بولي بروبلين، مسطحة القاع، ولوحات سوداء) (أن يكون تخطيط متطابقة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: بيانات تمثيلية للمقايسة وبيروكسيد دهني الحميد.
ويتم تقييم قراءات الفلورسنت (في الظلام) ثم كل دقيقة أكثر من 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع قارئ لوحة نيون (530/590 nm مرشحات). وترد بيانات الممثل (وحدات التعسفي) فارغة (لا الحميد؛ عناصر سلبية) ومراقبة إيجابية (ح2س2)، المجمعة الحميد التحكم والحميد من المريض من المعروف أنها مختلة الحميد (استناداً إلى دالة الحميد المستقلة اثنين افلوكس فحوصات الكوليسترول ومقايسة إنزيمية الوحيدات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: يمكن الكشف عن الإنزيم بيروكسايد الدهن الحميد دالة بيروكسيد الدهون عالية محتوى كل كمية محددة من HDL-C في فيفو.
الحميد كانت معزولة وأنها مصممة هدلوكس كما هو موضح في البروتوكول في مواضيع صحية 50 و 100 من المرضى الذين يعانون من الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. وكان الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية أعلى هدلوكس (1.59±0.53) عناصر التحكم (1.01±0.31) بالمقارنة مع (ف < 0.001). وكان هذا الرقم معدلة 32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويوفر البروتوكول الموصوفة هنا أداة قوية للإجابة على الأسئلة البحثية الهامة فيما يتعلق بالدور وظيفة الحميد في تصلب الشرايين، والأمراض التي تصيب البشر. يوضحها المقايسة محتوى الدهن الحميد بيروكسايد كل مغ من HDL-C باستخدام التضخيم الانزيمية (HRP). ويتجنب هذا النهج القيود المعروفة لفحوصات وظيفة الحميد السابقة (مثل فحص الكولسترول efflux) بما في ذلك تغايرية مهمة فيما يتعلق بأنواع الخلايا المستخدمة ونوع من قراءات وأفادت، والافتقار إلى التوحيد وآثار الخلط الثلاثية7،،من1532. قد يكون تحديد البيوكيميائية بدلاً من الخصائص البيولوجية (مثل efflux الكوليسترول) من الحميد استنساخه أكثر. تباين التجريبية المقايسة بين < 10% يقارن إيجابيا مع فحوصات يستند إلى الخلية وظيفة الحميد، حيث يتم إينتيراساي تجريبية تقلب كثيرا ما > 15 في المائة (أو لم يبلغ عنها). وبالإضافة إلى ذلك، هذا النهج قد يحد من التفاعلات الكيميائية الحيوية بين الدهون ويَسْبِر الفلورسنت32. تحديد أكسدة الكوليسترول الجيد ذات الصلة في سياق أمراض القلب والأوعية الدموية نظراً للدور الرئيسي للأكسدة داخل الجدار الشرياني في إمراضية atherogenesis 46. وقد استخدمنا تحليل وظيفة الكوليسترول الجيد فلوروتشرومي للكشف عن تلف في وظيفة الحميد في الولايات للأكسدة المزمنة مثل تصلب الشرايين، وفيروس نقص المناعة البشرية العدوى (فيروس الإيدز)32. باستخدام مقايسة البيوكيميائية للدالة الحميد، العديد من الدراسات قد أكدت رابطة هدلوكس بالسمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية 19،،من2127،34،35 ،،من3647. إلى حد كبير، في الدراسات التجريبية البشرية أثبتنا بديلة تدابير لأمراض القلب والأوعية الدموية، والتهاب النظامية، والخلل في منأى عن رابطات هدلوكس مع فحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، وما يرتبط بها مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض تعمل32،36. على الرغم من أن هذا التحليل قد استخدمت في العديد من الدراسات لمعالجة دور وظيفة الكوليسترول الجيد في مختلف الأمراض المزمنة فيروس العدوى32،38، مثل تصلب الشرايين 32 والسمنة36، فإنه لا يزال يتعين التحقق من صحتها في دراسات واسعة النطاق مع نقاط النهاية السريرية المتوفرة من الرسوم التعويضية (مثل النوبات القلبية).

هو رد فعل فلوروتشرومي مع الأكاسيد الفوقية حضور برنامج الصحة الإنجابية لإنتاج ريسوروفين الفلورية العالية راسخة 48،49. برنامج الصحة الإنجابية يحفز أكسدة fluorochrome غير الفلورية إلى ريسوروفين نيون أحمر50،51. هذه الأكسدة يمكن أن تكون مدفوعة بالأكاسيد الفوقية الذاتية موجودة في رد فعل (OH-) والدهن الحميد الأكاسيد الفوقية (لووه-). دون الكوليسترول أوكسيديز، ريسوروفين (مع برنامج الصحة الإنجابية) يمكن قياس الدهن الحميد مضمن محتوى بيروكسايد كمية محددة من الكوليسترول. يتم طرح إنتاج الخلفية أوه-نتيجة لأكسدة الهواء المخزن المؤقت من قراءات الفلورسنت لكل بئر. وقد ريسوروفين أوتوفلوريسسينسي الحد الأدنى في معظم العينات. يمكن أن تخفف إضافة كاتالاز (1-4 U/mL) في المخزن المؤقت لرد الفعل بسرعة الأكاسيد الفوقية الذاتية حيث أن الزيادة في قراءات الفلورسنت على مر الزمن بدافع البيروكسيدات الدهنية الكوليسترول الجيد. المقايسة تنوعاً ويمكن تقييم المحتوى الدهني بيروكسايد في استرات cholesteryl الحميد مقابل32،الكولسترول الحميد مجاناً48،49 .

هناك العديد من الاختلافات الدالة الحميد fluorochrome المقايسة32. باختصار هناك النهج الرئيسية على الأقل 3:) إضافة حجم معين من الكوليسترول الجيد (مثلاً 50 ميليلتر) كل بئر وبعد تطبيع قيمة وبيروكسيد دهني الحميد بمستوى HDL-C كما هو محدد في المختبرات السريرية؛ ب) وتحديد تركيز HDL-C في كل عينة استناداً إلى فحوصات الكوليسترول قياس الألوان القياسية ثم قم بإضافة مبلغ محدد من HDL-C (مثل 1 ميكروغرام) كل جيدا؛ وج) تطبيع قراءات الدالة الحميد الحميد أو برنامج عمل ألماتي-أنا محتوى البروتين32. وهناك أيضا على الأقل 3 النهج الرئيسية حول كيفية عزل الحميد لفحوصات وبيروكسيد دهني الحميد: أ) الكوليسترول هطول الأمطار على سبيل المثال مع البولي إيثيلين غليكول؛ ب) التقاط إيمونوافينيتي؛ وج) أساليب أخرى لا الفائق القياسية لعزل الحميد مثل µLtracentrifugation32. وبالإضافة إلى ذلك، الفحص تنوعاً ويمكن تقييم المحتوى الدهني بيروكسايد في استرات cholesteryl HDL مقابل الكولسترول الحميد الحرة 32. هناك عدة طرق لتقرير نتائج مثل الأسفار التعسفي وحدات، موحدة ريسوروفين الأسفار، تطبيع نسبة إلى عنصر تحكم مجمعة32. وهنا نقدم هذا النهج الأكثر استنساخه.

إذا تم استخدام البلازما من المهم إعداد البلازما في الأنابيب التي تحتوي على سترات الصوديوم ك التخثر 27،28. يمكن أن تتداخل كبريتات يدتا40 والهيبارين مع تفاعلات أكسدة 41،42. يمكن أن تتداخل كبريتات الهيبارين مع فحوصات الكيمياء الحيوية من الحميد الدالة 27،28. على الرغم من دون المستوى الأمثل للتصميم من الدهون والدالة الحميد الحميد وبيروكسيد cryopreserved المصل والبلازما، يمكن قياس العينات cryopreserved الاختلافات النسبية في وبيروكسيد الحميد كل ملغ من الكوليسترول الجيد. من المهم معالجة جميع العينات في دراسة محددة بالضبط نفس الطريقة (دورات تجميد أذاب نفسه مثلاً)، وتضمين عنصر تحكم مجمعة في كل لوحة لحساب الإرباك المحتملة المتعلقة بالاختلافات في تجهيز العينة بين الدراسات المختلفة. تجميد طويلة الأجل يمكن أن تمس نتائج فحوصات وظيفة الحميد43 ولكن لا يزال يمكن تقدير الفروق النسبية في الحميد وبيروكسيد دهني بين العينات داخل إحدى الدراسات إذا كان عنصر تحكم مجمعة مناسب مستعملة 27، 28.

الأهم من ذلك، عدم توحيد فحوصات وظيفة الحميد السابقة. هنا يصف لنا نهج فيها استخدام عناصر التحكم المناسبة يضمن توحيد قراءات. أكثر تحديداً وهناك العديد من المعلمات المعروفة التي قد تؤثر على قراءات لفحوصات الكيمياء الحيوية من الحميد تعمل مثل الآثار مصفوفة (المصل مقابل أسلوب إعداد البلازما)، ووجود الزلال وغيرها من البروتينات، نعد، تجميد ذوبان 32. "الحميد" وظيفة الإنزيم fluorochrome يمكن أن تكون موحدة مع استخدام المعايير المتاحة تجارياً والكاشفات تجريبية32. ومع ذلك، هناك أيضاالإرباك غير معروف (أو ضعيف تتسم) عدة في كل دراسة، وبين الأشخاص المختلفة التي قد تؤثر على تصميم الحميد تعمل نتائج. وهكذا، في كل لوحة ونحن استخدام عنصر تحكم الحميد مجمعة أعدت من عينات محددة من الاهتمام في دراسة معينة (التي تم معالجتها بطريقة مماثلة) يقلل من التحف والارباك32. ويمكن توحيد استخدام العينات في بنك الدم البلازما وقيم HDL-C من المختبرات السريرية كذلك المقايسة32.

وقد أظهرنا سابقا أن الأساليب المختلفة لعزل الحميد يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على قراءات لفحوصات الكيمياء الحيوية من الحميد الدالة 27،،من2832 ولكن فلوروتشرومي يمكن قياس موثوق بها هدلوكس بصرف النظر عن ل عزل الحميد 32. أساليب عزل الحميد عاملاً معوقا للدراسات الفائق للدالة الحميد. تنبيذ فائق يعتبر أسلوب المرجع اليوم، لكن لا يزال طريقة تستغرق وقتاً طويلاً52. التفريد غير دقيقة وغير موحدة 53. الحميد هطول الأمطار أساليب تنطوي على استخدام بوليانيونس مثل البولي إثيلين غليكول (شماعة) يعجل بالبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة ترك الحميد في طافية 54. على الرغم من أن هذه الأساليب عرض بعض العوائق مثل نتائج متغير مع الأمصال ليبيميك وتداخلات مع الكوليسترول الانزيمية 55 إجراءات التعديلات السابقة على استخدام الإجراء الأصلي الموحدة متاحة تجارياً الكواشف العائد إجراءات بسيطة وموثوق بها ودقيقة56. على الرغم من هطول الأمطار شماعة الطريقة المستخدمة عادة لعزل الحميد21،57 من مصل المريض، قضية رئيسية هي وجود بروتينات غير الحميد مثل الزلال58. العزلة إيمونوافينيتي يمكن استخدامها لتقليل تأثير الزلال على الحميد الدالة 32. على الرغم من أن يمكن تقييم الفروق النسبية في هدلوكس لأسلوب التقاط محددة، أجسام مضادة محددة ضد الكوليسترول الجيد قد لا تماما التقاط هياكل الحميد معقدة. استخدام عناصر التحكم المناسبة كما هو موضح في هذا البروتوكول، الاختلافات النسبية في هدلوكس بين العينات الحميد (معزول بواسطة شماعة هطول الأمطار) يمكن موثوق بها تحديد.

هذا التحليل، مثل جميع فحوصات أخرى وظيفة الكوليسترول الجيد، وعلى القيود الرئيسية. في فيفو أكسدة الكوليسترول الجيد في الجدار الشرياني معقد جداً وغير متجانسة والمحتوى الدهني بيروكسايد قد تعكس جزئيا فقط هدلوكس46. الحميد هيكل ووظيفة التغييرات باستمرار في فيفو وقياس الدالة الحميد في تيميبوينت واحد قد لا تعكس الأثر الحميد خلل في الجهاز نهاية المرض على مدى الساعة59. ومن غير المعروف ما إذا كان ينبغي تطبيع قراءات هدلوكس HDL-C، أو الحميد البروتين 22. ينبغي التحقق من الدراسات السريرية في المستقبل أهمية قراءات للمقايسة (الحميد دهن بيروكسايد محتوى كل مغ من HDL-C).

وفي الختام، تحليل وظيفة الكوليسترول الجيد fluorochrome طريقة موثوقة لتحديد محتوى الدهن الحميد بيروكسايد كل كمية محددة من HDL (هدلوكس). أعلى هدلوكس القيم المرتبطة بانخفاض وظيفة المضادة للأكسدة الكوليسترول الجيد. قراءات من هذا الإنزيم يرتبط بفحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، تدابير بديلة لأمراض القلب والأوعية الدموية والتهاب النظامية والخلل المناعي ويرتبط بها من مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض تعمل 19، 21،،من2732،34،35،36،37،،من3839، 47. هذا الأسلوب يوفر أداة مريحة، لكنها قوية لدراسة دور وظيفة الكوليسترول الجيد في الأمراض البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

هذا البروتوكول والمقايسة ذات الصلة بالبراءات PCT/US2015/018147.

Acknowledgments

الكتاب امتنان الاعتراف بالعمل للدكتور محمد نافاب والن فوغلمان ريدي سرينفاسا لدورها الرئيسي في تنمية تكرارات السابقة من هذا الطراز. T.A.A. معتمد من قبل معهد ملبورن الملكي الجامعة نائب مدير الجامعة "زمالات ما بعد الدكتوراه". جعفر و AH معتمدة بتمويل المشروع منحة 1108792. معتمد المعارف التقليدية التي تمنح K08AI08272 المعاهد الوطنية للصحة، "منح" المعاهد الوطنية للصحة/نكتس # µL1TR000124 من المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

علم المناعة، المسألة 128، الدالة الحميد، تتأكسد الحميد، وبيروكسيد، مقايسة خالية من الخلية، والأسلوب فلوروميتريك، Amplex الأحمر
الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter