Summary
我们在这里描述了一种荧光无细胞生化测定高密度脂蛋白脂质过氧化的方法。这种快速和重现性的分析可以用来确定高密度脂蛋白功能的大规模研究, 并能有助于我们的理解 hdl 功能的人类疾病。
Abstract
低高密度脂蛋白胆固醇 (HDL C) 水平是动脉粥样硬化性心血管疾病 (CVD) 最强大的独立阴性预测因子之一。hdl 的结构和功能, 而不是高密度脂蛋白 C 可以更准确地预测动脉粥样硬化。一些高密度脂蛋白蛋白和脂质成分的改变会损害 hdl 的功能, 如动脉粥样硬化等炎症状态。HDL 的功能通常是由细胞基础的化验, 如胆固醇外流化验, 但这些化验有许多缺点缺乏标准化。与细胞检测相比, 无单元检测可能给 HDL 功能提供更有力的措施。高密度脂蛋白氧化损害 hdl 功能。高密度脂蛋白在脂质过氧化物转运中有重要作用, 高脂质过氧化物与 hdl 功能异常有关。在解释酶荧光法测定脂质氧化状态的结果时, 应考虑脂探针的相互作用。这促使我们开发一种无细胞生物化学酶方法来评估 hdl 脂质过氧化物含量 (HDLox), 从而导致高密度脂蛋白功能障碍。这种方法是基于酶辣根酶 (HRP) 和荧光 Amplex 红, 可以量化 (不含胆固醇氧化酶) 的脂质过氧化物含量每毫克的高密度脂蛋白 C。这里的一个协议是 describedfor 测定 HDL 脂质过氧化荧光试剂。实验条件的严格标准化可以降低测定的变异性。较高的 HDLox 值与降低的 HDL 抗氧化功能相关。该方法的读数与经验证的细胞检测的读数, 心血管疾病的替代措施, 全身炎症, 免疫功能障碍, 以及相关的心血管和代谢风险表型有关。这种技术方法是一种强有力的方法来评估 HDL 功能在人类疾病中, 全身炎症, 氧化应激和氧化脂有一个关键的作用 (如动脉粥样硬化)。
Introduction
动脉粥样硬化性心血管疾病 (CVD) 是导致全球死亡的主要原因1,2。流行病学研究表明, 低浓度高密度脂蛋白 (HDL) 胆固醇通常与动脉粥样硬化发展的风险成反比1,2。虽然几项研究支持高密度脂蛋白1,2的 atheroprotective 作用, hdl 减轻动脉粥样硬化的起始和进展的机制是复杂的3,4。因此, 有人建议, HDL 的复杂结构和功能, 而不是绝对水平可以更准确地预测动脉粥样硬化5,6,7,8。一些高密度脂蛋白蛋白和脂质成分的改变会损害 hdl 的功能, 如动脉粥样硬化等炎症状态。这些 i) 降低其胆固醇流出电位9, ii) 减少消炎和增加 HDL 相关的炎蛋白6,7, iii) 降低抗氧化因子水平和活性和 HDLs抑制低密度脂蛋白氧化的能力 (LDLox)10和 iv) 增加脂质过氧化氢含量和氧化还原活性 (HDLox)9,11。对 hdl (如胆固醇外流、抗氧化功能) 的 pleotropic 功能进行评估的健壮性分析可以补充临床上 hdl-高密度脂蛋白 C 的测定。
HDL 功能通常由细胞方法评估, 如胆固醇流出试验8,12,13,14。这些方法有很大的局限性, 包括对所使用的细胞类型、报告的读数类型、缺乏标准化和甘油三酯的混杂效应7,15。这些缺点给大型临床研究带来困难16。与细胞检测相比, 无单元检测可能给 HDL 功能提供更有力的措施。胆固醇外流是 HDL 最重要的功能之一, 但它只能通过细胞检测来确定。其他方法来确定 HDL 功能, 如蛋白质组学17,18,19,20,21,22,23, 24和细胞单核蛋白的趋化性分析 HDL 功能17,22,25尚未标准化, 不能用于大规模的人类研究。
HDL 具有显著的抗氧化剂 atheroprotective 效果5,6,7,8。HDL 的抗氧化功能已确定在 LDL 的存在前细胞游离荧光分析26。这些生化荧光方法的高密度脂蛋白抗氧化功能最初开发的穆罕默德 Navab 和艾伦 Fogelman 及其同事26。虽然许多人类研究使用这些方法来确定 HDL 功能 17,18,19,20,21,22,23 ,24, 脂质 (高密度脂蛋白) 脂质 (LDL) 和脂质荧光相互作用可能会限制这些细胞游离酶生化检测 HDL 功能的重复性27,28。
最近的兴趣集中在高密度脂蛋白氧化的功能后果, 这是脂质和蛋白在 hdl 27,29,30中的氧化作用的结果。先前的研究表明, hdl 的氧化作用会损害 hdl 的功能27,29,30。高密度脂蛋白在脂质过氧化物转运中有重要作用, 高脂质过氧化物与 hdl 功能异常有关。因此高密度脂蛋白脂质过氧化物含量可用于确定 hdl 功能9,17,20,31 , 并给出已知的 hdl 函数前分析的局限性7, 15、27、32, 我们开发了一种可量化 HDL 脂质过氧化物含量 (HDLox) 32的替代荧光方法。这种方法是基于酶辣根酶 (HRP) 和荧光 Amplex 红, 可以量化 (不含胆固醇氧化酶) 的脂质过氧化物含量每毫克的 HDL-C 32。该检测的生物化学原理显示在图 1中。我们已经表明, 这种荧光方法没有先前的 HDL 函数分析的限制27,28。本试验在实验室中得到了进一步的完善和规范, 使其能够可靠地用于大规模人类研究, 即使是低温保存的等离子体32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. 该方法的读数与经验证的细胞检测的读数、心血管疾病的替代措施、全身炎症、免疫功能障碍以及相关心血管和代谢风险表型有关。32,33,34,35,36,37,38,39. 在这里, 我们描述这个简单, 但稳健的方法来测量 HDL 脂质过氧化物含量 (HDLox)。这种方法可以作为一个工具, 回答重要的研究问题的作用, HDL 功能在人类疾病中的系统性炎症, 氧化应激和氧化脂有一个关键的作用 (如动脉粥样硬化)32。
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Protocol
所有使用人体生物样本的实验都是在加州大学洛杉矶分校和墨尔本阿尔弗雷德医院人类伦理委员会的道德认可下进行的.
注意: 荧光 HDL 函数检测有许多变体 (请参见讨论) 32 。下面我们将描述给出最一致和可重现的结果的协议。检测的概述见 图 2 .
1. 标本处理
- 使用新鲜、non-hemolyzed 的血清 (可在血清分离管中收集) 或在禁食12-14 小时后获得的枸橼酸血浆。如果使用冷冻保存的样品, 请包括本协议中所述的适当控制.
2。0天-化验准备
- 使用适当的控件、示例和复制准备实验的工作布局。运行每个样本至少在 triplicates。有代表性的96井布局显示在 图 3 中.
- 根据样本数和复制量计算将用于化验的所有试剂体积.
注: 在每个工作库存中增加10% 的体积, 以确保每个试剂有足够的体积用于特定的实验. - 将所有所需的管子贴在化验的所有不同步骤上, 例如 hdl 的分离, 高密度脂蛋白 C 的测量 (可选) 和 fluorochromeassay.
3。1天-准备控件
- 准备研究特定的汇集控件
- 从所有研究样本的汇集血浆或血清中创建一个控制样本。如果在每一个板块运行20样品三份, 结合10和 #181; l 从每个样本到一个200和 #181; 我汇集控制。给临床实验室单独的分, 以确定这种控制的高密度脂蛋白 C 值.
注: 使用此汇集控制来标准化化验, 并说明所有可能已知的 (如基质血清与血浆的类型、冻融循环、超低温保存) 和未知的混杂可能影响实验的变异性 27 , 28 .
- 从所有研究样本的汇集血浆或血清中创建一个控制样本。如果在每一个板块运行20样品三份, 结合10和 #181; l 从每个样本到一个200和 #181; 我汇集控制。给临床实验室单独的分, 以确定这种控制的高密度脂蛋白 C 值.
- 准备实验室特定的质量控制 (卡塔尔)
- 在每个实验室中准备大量的高密度脂蛋白 (例如, 从10健康捐赠者的5毫升血浆中分离的高密度脂蛋白) 和冷冻的几个等分库存以最小化冻融循环.
- 使用至少10不同于此股票的复制来确定 HDLox 的平均值。每个测试中包括的每个 QC 样品的 HDLox 值的可接受范围是在和 #60 内; 15% 此平均值的变化系数.
- 将此集中控制的单独分到临床实验室, 以确定此控制的高密度脂蛋白 C 值 (如40毫克/dL).
注: 关于如何使用血库血液创建这些控件的详细方法以前已被描述为 27 、 28 、 32 。根据需要使用额外的卡塔尔 (例如一个健康的捐赠者已知有正常的 hdl 功能, 一个来自已知有很大异常的 hdl 功能的捐献者.
- 优化背景信号和空白值 (可选)
- 以最小化背景, 在孵化介质中添加适量的过氧化氢酶 (1-4 U/毫升), 以快速去除形成的 H 2 O 2 由于缓冲的自发空气氧化作用.
注: 由于从高密度脂蛋白样本的值中减去了从空白井 (没有高密度脂蛋白) 的值, 并且报告的结果相对于一个汇集控制 (包括在同一个96井板中), 我们发现这一步并没有实际 affec结果。因此, 如果需要, 可以省略用过氧化氢酶优化背景信号.
- 以最小化背景, 在孵化介质中添加适量的过氧化氢酶 (1-4 U/毫升), 以快速去除形成的 H 2 O 2 由于缓冲的自发空气氧化作用.
4。1天-使用高密度脂蛋白沉淀分离高密度脂蛋白胆固醇
注意: 根据制造商和 #39, 使用商业上可用的标准化高密度脂蛋白胆固醇沉淀试剂分离 apoB 衰竭血清;说明.这些试剂广泛用于色度测定, 以确定高密度脂蛋白胆固醇水平.
- 使用新鲜 (或解冻) 等离子或血清样本.
- 将等量的容积 (如80和 #181; L) 与血浆和高密度脂蛋白胆固醇沉淀试剂 (20% 的聚乙二醇在甘氨酸缓冲液中 pH 10.0 (25 和 #176; C)).
- 上下移混合.
- 1000-2000 x g 离心10分钟.
- 吸气上清液 (HDL 分数).
- 理想情况下, 立即使用隔离的高密度脂蛋白 fluorochromeassay 脂质过氧化。然而, 如果在同一天运行的几个样本和其他步骤, 如测量高密度脂蛋白胆固醇浓度也做了, 然后存储在4和 #176 的隔离高密度脂蛋白, 并在第二天使用它的 fluorochromeHDL 功能测定.
5。1天-在分离的高密度脂蛋白中测定高密度脂蛋白-c
注意: 如果从临床实验室中使用高密度脂蛋白 c 的值, 用 hdl-c 的量来规范化 HDLox, 这是可选的.
- 使用标准色度检测 27 从等离子体中量化高密度脂蛋白胆固醇。在每个井中添加50和 #181 的胆固醇试剂, 并使用比色板读卡器和每个试剂盒中提供的胆固醇标准确定胆固醇浓度.
6。2天-试剂的制备
- 制定 hrp 5 u/ml 解决方案的 hrp 和胆固醇溶液 (范围 1-10 u/毫升)
- 准备20毫米荧光 (如 Amplex 红色) 解决方案: 将一小瓶荧光试剂和亚甲基亚砜解冻到室温。在使用前, 在200和 #181 中溶解荧光试剂 (1 毫克); 亚砜 L。存储库存解决方案冻结在和 #8804;-20 和 #176; C, 保护免受光.
- 准备正负控制: 使用1X 和 #39; 反应缓冲器和 #39; 无胆固醇和20毫米 H 2 O 2 工作解决方案分别为负和正控制.
7。2天-荧光检测
- 添加50和 #181; L 1x 反应缓冲器为空白 (负控制).
- 可选: 添加 20 mM 工作解决方案 H 2 O 2 作为每个板块的正向控制.
- 为了尽量减少实验的变异性, 并确保添加试剂和样品, 并及时地进行, 在一个单独的96井圆底, 透明, 聚苯乙烯或聚丙烯板 (板 1) 的所有添加样品。然后使用多通道吸管将特定的体积转移到 3 96 井板 (板 2-4: 聚丙烯, 扁平机器人汤姆, 黑色) (具有相同的布局) ( 图 2 , 图 3 )。
- 例如, 首先添加160和 #181; 独立的高密度脂蛋白 l 的每个井/样本 1, 然后与多通道吸管转移50和 #181; l 的高密度脂蛋白胆固醇从每个井/样本进入96井黑板。更改各行/列之间的提示, 并使用筛选提示进行所有转移.
- 将样本留在井中。不要丢弃。在添加试剂之间没有洗涤步骤.
- 添加50和 #181; HRP 解决方案的 L 5 u/毫升 (0.25 u) 每井.
注: 在添加荧光试剂前使用 HRP. - 在37和 #176 孵育30分钟;在孵化后不要丢弃样品 (在添加试剂之间没有洗涤步骤).
- 添加50和 #181; fluorochromereagent 为300和 #181 的最终浓度; m。在这一点上, 总反应量是150和 #181; l 混合良好和保护从光.
- 评估荧光读数 (在黑暗中) 每分钟超过120分钟, 在37和 #176; C 与荧光板阅读器 (530/590 nm 过滤器).
注: 使用较短的60分钟间隔与新鲜样品。我们发现, 120 分钟的化验提供更多的可重现性的数据与使用冷冻保存的样品. - 使用适当的软件记录数据.
8。3天-数据分析
- 记录荧光单位 (任意单位), 在120分钟后添加荧光试剂, 包括空白井和所有控制.
- 计算荧光单位的平均值 (基于至少 triplicates) (HDL ox_sample )。不要把离群值 (和 #62, 2 SDs 从平均值) 考虑进去.
- 使用下列公式减去背景荧光:
- hdl 胆固醇量的规范化 (高密度脂蛋白 c): 对每个样本 (包括汇集的控制) 的 HDLox 脂质过氧化值正常化 (毫克/dl)。在整个结果部分, hdl 牛 被显示为 n (hdl-c) HDLox 测量, 以反映 hdl-c 的调整。使用以下公式:
- 将每个样本的 HDLox 脂质过氧化值的表达式标准化, 使其与池控件的值对。正常化的 n (hdl-c) HDLox 脂质过氧化值为每个样本 (调整为高密度脂蛋白 c) 的 n (hdl-c) HDLox 脂质过氧化值的汇集控制。在整个结果部分, hdl 牛 被提出作为 nHDL 的 牛 措施, 以反映实验变异性和高密度脂蛋白 C 的调整。使用以下公式:
注意: 此方法类似于其他已建立的实验方法, 以减少测量的实验可变性, 如国际正常化比率 (INR) 44 , 45 。此方法已在临床研究中得到验证 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . - 使用标准质量控制示例对实验结果进行质量控制。每个实验室都应该建立自己的质量控制 (卡塔尔)。理想情况下, 有一个 qc 为 nHDLox 从一个已知功能失调的高密度脂蛋白样本和 qc nHDLox 从一个样本从健康的捐助者 [例如使用汇集样本从年轻的成人谁是建立血库捐助者, 并没有已知的共病和危险因素包括吸烟在内的心血管疾病)。后者控制标准化结果在不同的实验室之中。这些卡塔尔的平均值是基于至少5复制而建立的 (通常我们对这个重要步骤使用10复制)。
- 检查每个测试中测量的卡塔尔是否在预期的值范围内有值。假设一个可接受的最大实验变异率为 15%, 所有测量的实验值应该在已知的标准质量值的15% 以内。使用下列公式:
注释: 如果其中一个包含的质量控制示例 (正常与机能失调的高密度脂蛋白) 给出的 HDLox 值超出预期范围 (在每个实验室建立) 然后重复实验.
- 检查每个测试中测量的卡塔尔是否在预期的值范围内有值。假设一个可接受的最大实验变异率为 15%, 所有测量的实验值应该在已知的标准质量值的15% 以内。使用下列公式:
- 使用变体系数 (CV) 对实验结果进行质量控制, 以量化实验可变性: 用 CV% 和 #62 重复所有样品; 15%。使用以下公式:
注意: 一个典型的 intra-assay (在同一个板块内) 和中间 (在不同的板块之间) 实验变异是和 #60; 15%. 2) 一个典型的intra-assay cv 介于1-7% 和一个典型的 interassay cv 之间 3-10%.
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Representative Results
50µL 每个高密度脂蛋白样本添加到每个井和步骤7.3。50µL 的 HRP 溶液 5 u/毫升 (0.25 u), 然后添加到每个井, 在步骤7.5。样品在37° c 时孵育30分钟, 如步骤7.6 所示。50µL 的荧光试剂, 然后添加到每个井, 在步骤 7.7 (最终浓度300µM)。荧光读数 (在黑暗中), 然后评估每分钟超过120分钟, 在37° c 的荧光板阅读器 (530/590 nm 过滤器)。有代表性的荧光数据的空白, 汇集控制, 样品与已知的功能失调 hdl 和样本与正常高密度脂蛋白显示在图 4。在表 1中显示了使用该协议8节所描述的等式的原始代表数据和逐步分析结果。在这个例子中, 使用新鲜的高密度脂蛋白样本和较高的 HDLox 值通常获得新的高密度脂蛋白。例如, 已知的 hdl 功能失调是基于独立的 hdl 函数分析和 HIV 感染者, 与健康参与者的高密度脂蛋白相比, 脂质过氧化物的含量大约是2倍。图 5显示了一个研究的代表性结果, 已知有受损 HDL 函数的对象28,32。与未感染者相比, 感染艾滋病毒的人的平均高密度脂质过氧化物含量 (每毫克高密度脂蛋白胆固醇) 大约有60%。在我们先前发表的研究与低温保存高密度脂蛋白, 这种方法是能够证明至少10% 相对的差异, 在 HDLox 相比, hdl 从控制组 (没有疾病, 如慢性 HIV 感染)36,37,38。
图 1: 按特定量的高密度脂蛋白胆固醇测定 hdl 脂质过氧化物含量。
在全身炎症和氧化应激状态下, hdl 增加了脂质过氧化物 (LOOH) (HDLox), 与 hdl 功能受损有关。HRP 催化氧化荧光荧光到荧光卤红。这种氧化作用是由反应 (OH) 和 HDL 脂质过氧化物 (LOOH) 中的内源性过氧化物所驱动的。没有胆固醇氧化酶, 卤 (HRP) 可以量化的内在高密度脂蛋白脂质过氧化物含量的特定数量的高密度脂蛋白胆固醇。从每个井的荧光读数中减去缓冲器的空气氧化后产生的 OH 的背景产量。卤在大多数样品中具有最小的自发荧光。此图已被修改32。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: fluorochromeassay 高密度脂蛋白脂质过氧化的工作流程概述。
0天: 准备化验: A) 设计96井板布局, 估计所需样品量 (血浆/血清) 和试剂 (HRP 酶, 荧光试剂, 缓冲剂, PEG 试剂), 标签管
1天: 准备化验和高密度脂蛋白隔离: A) 制备控制 (研究特定-汇集控制, 质量控制, 阳性和阴性对照) B) 高密度脂蛋白沉淀使用 PEG 试剂。
2天: 准备化验 (如果不是在1天完成) 和荧光化验: a) 准备控制 (研究特定-汇集控制, 质量控制, 积极和消极控制) a) 添加高密度脂蛋白样品: 以尽量减少实验的变异性和确保添加试剂和样品, 并及时进行, 建议所有添加样品 (如160µL) 首先在一个单独的96井圆底, 清楚, 聚苯乙烯或聚丙烯板块 (板块 1)。然后一个多通道吸管可以用来转移特定的体积 (如50µL) 到 3 96-井板 (板块 2-4: 聚丙烯, 平坦的底部, 黑色板) (有相同的布局)。B) 加入 HRP: 添加50µL 5 u/毫升 (0.25 u) 每井使用多通道吸管 C) 孵育在37° c 为 30 min D) 添加50µL 300 µM/井的荧光试剂, 每井使用多通道吸管 E) 评估荧光读数 (在黑暗中) 每分钟超过120分钟在37° c 与萤光板读者 (530/590 毫微米过滤器)。
3天: 数据分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 典型的96井板的布局, 通常用于荧光 HDL 功能测定。
在将高密度脂蛋白样品加入油井的时间上的差异会导致不同井间自发氧化的差异。为了尽量减少实验的变异性, 避免不同的井之间的自发氧化, 并确保试剂和样品的添加能持续和及时地进行, 建议所有添加的样品 (如160µL)首先在一个单独的96井圆底, 明确, 聚苯乙烯或聚丙烯板 (板 1)。然后一个多通道吸管可以用来转移特定的体积 (如50µL) 到 3 96-井板 (板块 2-4: 聚丙烯, 平坦的底部, 黑色板) (有相同的布局)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 高密度脂蛋白脂质过氧化试验的代表性数据。
荧光读数 (在黑暗中), 然后评估每分钟超过120分钟, 在37° c 的荧光板阅读器 (530/590 nm 过滤器)。代表性数据 (任意单位) 显示为空白 (没有 hdl; 阴性控制), 正面控制 (H2O2), 汇集 hdl 控制和高密度脂蛋白从已知有功能失调的 hdl (基于两个独立的 hdl 功能化验-胆固醇外流和单核细胞趋化试验)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 脂质过氧化物检测 hdl 功能可以检测高脂质过氧化物含量的每特定数量的高密度脂蛋白-C体内。
HDL 是孤立的, HDLox 是确定的协议中所描述的50健康主题和100例 HIV 感染。与对照组相比, 感染艾滋病毒的人有更高的 HDLox (1.59±0.53) (p 和 #60; 0.001)。此图已被修改32。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的协议提供了一个强有力的工具来回答关于高密度脂蛋白功能在动脉粥样硬化和人类疾病中的作用的重要研究问题。用酶促扩法 (HRP) 对 hdl-C 的每毫克高密度脂蛋白脂质过氧化物含量进行定量分析。这种方法可以避免已知的 HDL 功能检测的局限性 (如胆固醇外流测定), 包括对所用细胞类型的显著异质性, 报告的读数类型, 缺乏标准化和混杂效应甘油三酯7,15,32。HDL 的生化特性 (如胆固醇外流) 的测定可能更具重现性。中间和 #60 的实验变异性; 10% 与 HDL 函数的细胞分析比较, interassay 实验的变异性通常和 #62; 15% (或未报告)。此外, 这种方法可能会限制脂质和荧光探针之间的生物化学相互作用32。在动脉粥样硬化46的发病机制中, 由于动脉壁内氧化应激的关键作用, HDL 氧化的测定与心血管疾病有关。我们使用荧光高密度脂蛋白功能测定法检测慢性氧化应激状态下的 hdl 功能受损, 如动脉粥样硬化和人体免疫缺陷病毒感染 (HIV)32。利用 HDL 功能的生化测定, 多项研究证实了 HDLox 与肥胖和心血管疾病的关系19,21,27,34,35 ,36,47。值得注意的是, 在人体试验研究中, 我们展示了 HDLox 与经验证的细胞检测、心血管疾病的替代措施、全身炎症、免疫功能障碍以及相关的心血管和代谢风险的关联。表型32,36。虽然这种方法已被用于一些研究, 以解决 HDL 功能的作用, 在不同的疾病, 如慢性 HIV 感染32,38, 动脉粥样硬化32和肥胖36, 它仍然是在大规模的研究中验证了 CVD 的临床终点 (如心脏病发作)。
荧光与过氧化物的反应在 HRP 的存在下产生高荧光卤是建立了良好的48,49。HRP 催化氧化荧光荧光至荧光卤红50,51。这种氧化作用是由反应 (OH) 和 HDL 脂质过氧化物 (LOOH) 中的内源性过氧化物所驱动的。没有胆固醇氧化酶, 卤 (HRP) 可以量化的内在高密度脂蛋白脂质过氧化物含量的特定数量的高密度脂蛋白胆固醇。从每个井的荧光读数中减去缓冲器的空气氧化后产生的 OH 的背景产量。卤在大多数样品中具有最小的自发荧光。在反应缓冲液中加入过氧化氢酶 (1-4 U/毫升) 可以迅速抑制内源性过氧化物, 从而使荧光读出时间的增加是由高密度脂质过氧化物驱动的。该方法具有通用性, 能评估高密度脂蛋白胆固醇酯与游离高密度脂蛋白脂质过氧化物含量的比值32,48,49 。
有许多变化的荧光 HDL 功能检测32。简要地有至少3主要方法: a) 增加每井的特定容量 hdl (例如50µL) 和以后规范化 hdl 脂质过氧化值由水平的 hdl C 如确定在临床实验室;b) 根据标准比色胆固醇测定法确定每个样品中高密度脂蛋白 c 的浓度, 然后在每井中添加一特定量的高密度脂蛋白 c (如1µg);和 c) 通过 hdl 或》 I 蛋白含量32使 hdl 功能读数正常化。还有至少3主要的方法, 如何隔离 hdl 的高密度脂蛋白脂质过氧化测定: a) 高密度脂蛋白胆固醇沉淀, 如与聚乙二醇;b) 亲和捕获;和 c) 用于高密度脂蛋白隔离的其他标准非高通量方法, 如µLtracentrifugation32。此外, 该化验是多才多艺的, 可以评估脂质过氧化物含量的高密度脂蛋白胆固醇酯与游离高密度脂蛋白32。有几种方法可以报告结果, 例如, 任意荧光单位、标准化的卤荧光单元、归一化比率到汇集控件32。在此, 我们提出了最具重现性的方法。
如果使用等离子, 那么在含有柠檬酸钠的试管中制备血浆是很重要的, 如抗凝血27,28。EDTA40和肝素硫酸根可干扰氧化反应41,42。肝素硫酸盐可干扰 HDL 功能的生化测定27,28。虽然冷冻保存的血清和血浆对血脂、hdl 功能和 hdl 脂质过氧化的测定是次优, 但冷冻保存的标本可以量化 hdl 脂质过氧化的相对差异。重要的是要处理在一个特定的研究中的所有样本完全相同的方式 (如相同的冻融循环), 并包括在每个板块的汇集控制, 以解释潜在的混杂与不同的研究之间的样品处理差异。长期冷冻可能会损害 hdl 功能测定结果43但是, 如果使用了一个适当的池控制27, 则在一项研究中的样本间 hdl 脂质过氧化的相对差异仍可评估, 28。
重要的是, 先前的 HDL 功能检测没有标准化。在这里, 我们描述一种方法, 使用适当的控制确保读数的标准化。更具体地说, 有几个已知的参数, 可能会影响的读出 HDL 功能的生化检测, 如基质效应 (血清 vs 方法的等离子体制备, 存在的白蛋白和其他蛋白质), 冷冻保存, 冻融32. 高密度脂蛋白功能荧光测定可以使用商用标准和实验试剂32进行标准化。然而, 也有在每项研究中, 在不同的人中, 可能影响 HDL 功能结果测定的几个未知 (或特征) 混杂。因此, 在每一个板块中, 我们使用一个从特定的样本感兴趣的具体的研究 (已处理相同的) 的混合高密度脂蛋白控制, 最大限度地减少工件和混杂32。使用血浆血库样本和高密度脂蛋白 C 值从临床实验室可以进一步标准化化验32。
我们以前已经表明, 不同的高密度脂蛋白隔离方法可以显着影响的读数生化检测 hdl 功能27,28,32但荧光可以可靠地测量 HDLox 无论的高密度脂蛋白隔离32。高密度脂蛋白分离方法是高密度脂蛋白功能研究的主要限制因素。离心今天被认为是引用方法, 但仍然是一个耗时的方法52。电泳不精确, 不规范53。高密度脂蛋白沉淀方法涉及使用 polyanions, 如聚乙二醇 (PEG) 沉淀低密度脂蛋白离开高密度脂蛋白在上清54。虽然这些方法显示某些缺点例如可变的结果与 lipemic 血清和干涉与酵素胆固醇规程55对原始的做法的早先修改使用规范化的商业可利用试剂产生一个简单、可靠和准确的过程56。虽然 PEG 沉淀是常用的方法分离 hdl21,57从患者血清, 一个主要问题是存在的非高密度脂蛋白蛋白, 如白蛋白58。亲和隔离可用于减少白蛋白对 HDL 功能的影响32。虽然可以评估特定捕获方法的 HDLox 的相对差异, 但针对 hdl 的特定抗体可能无法完全捕获复杂的高密度脂蛋白结构。采用本协议所述的适当控制, 可以可靠地确定高密度脂蛋白标本 (通过 PEG 沉淀分离) HDLox 之间的相对差异。
这种方法与其他所有 HDL 功能的测定一样, 都有其关键的局限性。在体内动脉壁上 HDL 的氧化是相当复杂的, 异质性和脂质过氧化物含量可能只部分反映 HDLox46。高密度脂蛋白结构和功能不断改变在体内和测量的 hdl 功能在一个 timepoint 可能无法反映的影响, hdl 功能障碍的最终器官疾病的时间59。不知道 HDLox 读数是否应该由高密度脂蛋白 C 或高密度脂蛋白蛋白22来正常化。未来的临床研究应该验证的重要性, 检测读数 (hdl 脂质过氧化物含量每毫克的高密度脂蛋白 C)。
总之, 荧光 hdl 功能测定是一种可靠的方法, 以确定高密度脂蛋白脂质过氧化物含量每特定数量的高密度脂蛋白 (HDLox)。较高的 HDLox 值与降低的 HDL 抗氧化功能相关。该方法的读数与经验证的细胞检测, 心血管疾病的替代措施, 全身炎症, 免疫功能障碍和相关的心血管和代谢风险表型19, 21 ,27,32,343536373847. 此方法为检测高密度脂蛋白功能在人类疾病中的作用提供了一个方便而有力的工具。
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Disclosures
本协议和化验与专利 PCT/US2015/018147 有关。
Acknowledgments
作者感谢穆罕默德 Navab, 艾伦 Fogelman 和 Srinivasa 的工作, 他们在开发这个模型的早期迭代的关键作用。T.A.A. 得到 RMIT 大学校长博士后奖学金的支持。AJ 和 AH 得到了澳洲项目赠款1108792的支持。传统知识得到 nih 资助 nih K08AI08272、nih/NCATS 补助金µL1TR000124。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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