Summary
여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.
Abstract
낮은 고밀도 지 단백 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤) 수치는 동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD)의 가장 강력한 독립적인 부정적인 예측 중 하나입니다. 구조와 기능 보다는 HDL-콜레스테롤 HDL의 동맥 경화를 예측 더 정확 하 게 수 있습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. HDL 함수 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과 이러한 분석 등 분석은 표준화의 수많은 단점 부족 세포 기반으로 의해 결정 됩니다. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. HDL 산화 HDL 기능을 손상 한다. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 지질 조사 상호 작용은 지질 산화 상태를 측정 하기 위한 분석 실험 비 효소 형광의 결과 해석 할 때 고려 되어야 한다. 이 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) HDL 역 기능에 기여를 평가 하기 위해 셀 무료 생화학 효소 방법 개발 동기. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C의 밀리 그램 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소에 따라 여기는 프로토콜은 형광 색소 시 약을 사용 하 여 HDL-지질 과산화의 describedfor 결정. 분석 결과 변화 실험 조건의 엄격한 표준화에 의해 줄일 수 있습니다. HDLox 값이 높을수록 감소 된 HDL 항 산화 기능으로 연결 됩니다. 이 분석 결과의 판독은 유효한 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직의 염증, 면역 부전, 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 측정의 판독에 연관 된다. 이 기술적인 접근 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질 (동맥 경화) 등 중요 한 역할을가지고 인간의 질병에 HDL 기능을 평가 하는 강력한 방법입니다.
Introduction
동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD) 죽음 전세계1,2의 주요 원인입니다. 역학 연구 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤의 저급은 반대로 동맥 경화1,2의 개발에 대 한 위험과 연관 일반적으로 나타났습니다. 여러 연구는 HDL1,2atheroprotective 역할을 지원, 비록는 HDL 약하게 시작 및 동맥 경화의 진행 하는 메커니즘은 3,4입니다. 따라서, 그것은 복잡 한 구조와 기능 절대 수준 보다는 오히려 HDL의 아 테 롬 5,6,,78예측 더 정확 하 게 수 있습니다 제안 되었습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. 이러한 i) 감소는 콜레스테롤 경과 잠재적인 9, ii) 항 염증 및 증가 HDL 관련 된 프로-염증 성 단백질 6,7, iii) 감소 항 산화 요소 수준 및 활동 및 HDLs 감소 낮은 밀도 지 단 백 질 (LDLox)10 및 4의 산화를 억제 하는 기능) 지질 hydroperoxide 콘텐츠 및 산화 환 원 활동 (HDLox)9,11증가. 수 있습니다 (예: 콜레스테롤 경과, 항 산화 기능) HDL의 pleotropic 기능을 평가 하는 강력한 분석 HDL-HDL-콜레스테롤은 병원에서의 보완 하는 것입니다.
HDL 함수는 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과8,12,,1314같은 셀 기반 방법으로 평가 됩니다. 이러한 방법을 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족 및 트리 글리세라이드 7,15의 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 한 주요 제한이. 이러한 단점이 큰 임상 연구16어려움 포즈. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. 콜레스테롤 경과 HDL의 가장 중요 한 기능 중 하나 이지만 그것은 세포 기반 분석 실험에 의해 결정 수 있습니다. Proteomics17,18,19,20,,2122,23, 같은 HDL 함수를 확인 하는 다른 접근 24 및 HDL 함수 17,,2225 의 셀 기반 monocyte chemotaxis 분석 실험 표준화 되지 대규모 인간 연구에 사용할 수 없습니다.
HDL는 중요 한 항 산화 atheroprotective 효과5,6,,78. HDL의 항 산화 기능 이전 셀 무료 fluorometric 분석 실험 26에 LDL의 존재 결정 했다. 이러한 생화학 fluorometric 방식의 HDL 항 산화 기능 모하마드 Navab과 앨런 Fogelman26그들의 동료 의해 원래 개발 되었다. 비록 많은 인간 연구 HDL 함수 17,18,19,20,,2122,23 결정 하기 위해 이러한 방법을 사용 ,24, 지질 (HDL)-지질 (LDL) 및 지질-형광 색소 상호 작용의 이러한 셀 무료 비 효소 생 화 확 적인 분석 실험 HDL 기능27,28의 재현성을 제한할 수 있습니다.
최근 관심은 지질과 HDL 27,,2930단백질의 산화 결과 HDL 산화의 기능적 결과에 집중 했다. 사전 연구 HDL의 그 산화 손상 HDL 기능 27,,2930. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 따라서 HDL 지질 과산화 수소 수 수 HDL 함수 9,17,,2031 을 결정 하는 데 사용 내용과 주어진 HDL 기능7의 이전 분석 실험의 알려진된 제한 사항 15,,2732, 우리 개발 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) 32단정 대체 fluorometric 메서드입니다. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C 32의 mg 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소를 기반으로 합니다. 분석 결과의 생 화 확 적인 원리는 그림 1에 표시 됩니다. 우리는이 형광 기반 접근 이전 HDL 기능 분석 실험27,28의 한계는 없습니다 나타났습니다. 이 분석 결과 더 세련 되 고도 cryopreserved 플라즈마 32,,3334, 와 함께 대규모 인간 연구에서 안정적으로 사용할 수 있도록 우리의 실험실에서 표준화 되어 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.이 분석 결과의 판독은 판독 검증된 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직 염증, 면역 부전 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 조치의 연관 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. 여기, 우리이 간단 하면서도 강력한 방법을 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox)를 측정 하는 설명. 이 분석 결과 사용할 수 있습니다 도구 HDL 함수 인간의 질병에서의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질32(동맥 경화) 등 중요 한 역할가지고.
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Protocol
캘리포니아 로스 앤젤레스, 로스 앤젤레스와 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른의 대학에서 윤리 승인 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 수행.
참고: 형광 색소 HDL 기능 분석 결과 (참조 토론) 32의 많은 변이가 있다. 아래 우리는 가장 일관 되 고 재현 가능한 결과 제공 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다.
1. 표본 처리
- 사용 신선한, hemolyzed 비 혈 (혈 청 분리기 관에 수집 될 수 있습니다) 또는 시트르산 플라즈마 12-14 시간 금식 후 얻은. Cryopreserved 샘플을 사용 하는 경우이 프로토콜에서 설명 된 대로 적절 한 컨트롤 포함.
2. 하루 0-분석 결과 대 한 준비
적절 한 컨트롤과 실험의- 준비 작업 레이아웃 샘플 및 복제. 적어도 triplicates에 각 샘플을 실행 합니다. 대표 96 잘 레이아웃 그림 3에 표시 됩니다.
- 계산 샘플 및 복제의 수에 따라 분석 결과 대 한 사용 될 시 약의 모든 볼륨.
참고: 각 작업 재고 특정 실험에 대 한 각 시 약에 대 한 충분 한 볼륨 있는지 확인 하는 추가 10% 볼륨 포함. - 예: HDL, HDL-콜레스테롤 (선택 사항)의 측정은 fluorochromeassay의 분리에 대 한 분석 결과의 모든 다른 단계에 대 한 모든 필요한 튜브 라벨.
3. 컨트롤의 하루 1-준비
- 모든 연구의 연구 관련 풀링된 제어의 준비
- 만들기 풀링된 플라스마 또는 혈 청에서 컨트롤 샘플 샘플. 3 중에 각 접시에 20 샘플을 실행 하는 경우 200 µ L 풀링된 컨트롤에 각 샘플에서 10 µ L를 결합. 이 컨트롤의 HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 실험실에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수.
참고:이 풀링된 컨트롤을 사용 하 여 분석 결과 표준화 하 여 가능한 모든 알려진 계정 (예: 플라즈마, freeze-thaw 주기, cryopreservation 매트릭스 세럼의 유형) 및 실험적인 다양성에 영향을 미칠 수 있습니다 알 수 없는 confounders 27 , 28.
- 만들기 풀링된 플라스마 또는 혈 청에서 컨트롤 샘플 샘플. 3 중에 각 접시에 20 샘플을 실행 하는 경우 200 µ L 풀링된 컨트롤에 각 샘플에서 10 µ L를 결합. 이 컨트롤의 HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 실험실에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수.
- 실험실 관련 품질 관리 (QCs)의 준비
- 각 실험실 (예: 10 건강 한 기증자 로부터 플라즈마의 5 mL에서 고립 된 HDL)에 HDL의 큰 재고를 준비 하 고이의 여러 aliquots cryopreserve freeze-thaw 주기를 최소화 하기 위해 주식.
- 사용 적어도 10 다른 HDLox의 평균 값을 확인 하려면이 주식에서 복제 합니다. 측정 된 HDLox의 허용 범위 내에서 각 분석 결과에 포함 된 각 QC 샘플은 값 <이 평균 값의 변동 계수의 15%.
- 가이 컨트롤 (예: 40 mg/dL) HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 연구소에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수.
참고: 자세한 방법은 이러한 컨트롤을 만들 혈액 은행에서 혈액을 사용 하는 방법을 이전 되었습니다 설명된 27 , , 28 32. 필요에 따라 추가 QCs 사용 (예: 정상적인 HDL 기능과 크게 비정상적인 HDL 함수 알려진 기증자에서 하는 건강 한 기증자에 게 서 한.
- 최적화 배경 신호 및 빈 값 (옵션)
- 백그라운드를 최소화 하기 위해 형성된 된 H 2 O를 빠르게 제거 하 인큐베이션 매체에 catalase (1-4 U/mL)의 적절 한 금액을 추가 2 버퍼의 자발적인 공기 산화 때문.
참고: 이후 빈 우물 (HDL)에서 값 HDL 샘플의 값에서 뺀 되 고 결과 풀링된 컨트롤 (같은 96 잘 접시에 포함)를 기준으로 보고 우리가 찾은이 단계는 실제적으로 하지 affec t는 결과. 따라서, catalase로 배경 신호 최적화 생략할 수 있습니다, 필요한 경우.
- 백그라운드를 최소화 하기 위해 형성된 된 H 2 O를 빠르게 제거 하 인큐베이션 매체에 catalase (1-4 U/mL)의 적절 한 금액을 추가 2 버퍼의 자발적인 공기 산화 때문.
4. 하루 1-HDL 콜레스테롤 HDL 강 수를 사용 하 여 분리
참고: 상업적으로 사용 가능한 표준화 된 HDL 콜레스테롤 계기 시 제조 업체에 따라 고갈 apoB 혈 청을 사용 하 여 ' s 지침입니다. 이 시 약 HDL 콜레스테롤 수치를 결정 하기 위해 색도계 분석 실험에서 널리 이용 된다.
- 신선한 사용 (해 동) 플라스마 또는 혈 청 샘플.
- 같은 볼륨 (예: 80 µ L) 플라스마와 HDL 콜레스테롤 계기 시 약 (20 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 글리신 버퍼 pH 10.0 (25 ° C))의 혼합.
- 아래로 pipetting으로 잘 믹스.
- 원심에서 1000-2000 x 10 분에 대 한 g
- 상쾌한 (HDL 분수) 발음.
- 는 이상적으로 사용 하 여 즉시 격리 HDL HDL 지질 과산화의 fluorochromeassay에 대 한. 그러나, 여러 샘플은 같은 날에 실행 하는 경우 HDL-콜레스테롤 농도의 측정은 또한 완료와 같은 다른 단계 4 ° C에서 고립 된 HDL 저장 그리고 fluorochromeHDL 기능 분석 결과 대 한 다음 날 사용.
5. 격리 된 HDL에 HDL-콜레스테롤의 날 1-결정
참고: 이것은 임상 실험에서 HDL-콜레스테롤의 값은 HDLox을 정상화 하 HDL-콜레스테롤 양을 사용 하는 경우.
- , 27 분석 실험 표준 색도계를 사용 하 여. 각 잘에서 콜레스테롤 약의 50 µ L을 추가 하 고 콜레스테롤 농도 색도계 플레이트 리더와 콜레스테롤 표준 각 키트에 제공 된 사용 하 여 결정.
6. 하루 2-시 약의 준비
- HRP 5 U/mL 해결책 (범위 1-10 U/mL)의 준비 HRP와 콜레스테롤 솔루션.
- 준비 20 m m 형광 색소 (예: Amplex 레드) 솔루션: 실내 온도에 형광 색소 시 약 및 DMSO의 유리병을 녹여. 사용 전에 분해 DMSO의 200 µ L에 형광 색소 시 약 (1 mg). 재고 솔루션에 냉동 저장 ≤-20 ° C, 빛 으로부터 보호.
- 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 준비: 사용 1 X ' 반응 버퍼 ' 콜레스테롤 및 20 m m H 2 O 2 없이 작업 솔루션 부정적이 고 긍정적인 컨트롤로 각각.
7. 하루 2-형광 색소 분석 결과
- 빈 (부정적인 제어)으로 반응 버퍼 x 1의 추가 50 µ L.
- 옵션: 각 접시에 긍정적인 컨트롤로 20 m m H 2 O 2의 작업 솔루션 추가.
- 실험적인 변화를 최소화 하는 추가 시 약 및 샘플의 지속적으로 행해진다 고 적절 한 시기에는 별도 96 잘 라운드-하단, 분명, 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 플레이트 (접시 1) 샘플의 모든 추가 수행 합니다. 다음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 특정 볼륨 3 96 잘 접시에 전송 (2-4 격판덮개: 폴 리 프로필 렌, 봇톰, 블랙) (있는 동일한 레이아웃) ( 그림 2, 그림 3).
- 예를 들어 처음에 격판덮개 1의 각 잘/샘플으로 고립 된 HDL의 160 µ L를 추가 하 고 멀티 채널 피 펫의 사용과 HDL-콜레스테롤의 50 µ L에서에서 전송할 각 잘/샘플 검은 96 잘 접시. 팁 각 행/열 사이 변경 하 고 필터링 되지 않은 팁을 사용 하 여 모든 전송.
- 우물에서 샘플을 두고. 버리지 마십시오. 시 약의 추가 사이 아무 세척 단계에 있다.
- HRP 솔루션 5의 추가 50 µ L U/mL (0.25 U) 각 잘.
참고: 사용 하 여 형광 색소 시 약의 추가 하기 전에 HRP. - 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 인큐베이션 (시 약의 추가 사이 세척 단계) 후에 샘플을 버리지 마십시오.
- 추가 50 µ L 300의 최종 농도 대 한 fluorochromereagent의 µ M. 이 시점에서, 총 반응 볼륨은 150 µ L. 잘 섞어 그리고 빛에서 보호.
- 평가 (어둠)에 형광 판독 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 이상 모든 분.
참고: 짧은 60 분 간격을 사용 하 여 신선한 샘플. 우리는 120 분 분석 결과 cryopreserved 샘플의 사용으로 더 많은 재현할 수 데이터를 제공 것으로 나타났습니다. - 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 기록.
8. 하루 3-데이터 분석
- 빈 우물을 포함 하 여 모든 샘플에 대 한 형광 색소 시 약의 추가 후 120 분에 형광 단위 (임의의 단위)을 기록 하 고 모든 컨트롤.
- 형광 단위의 평균 값을 계산 (에 따라 적어도 triplicates) (HDL ox_sample). 이상 값에는 영향을 받지 않습니다 (> 2 평균 값에서 SDs) 고려.
- 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 배경 형광 빼기:
- 정규화 동안 HDL 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤): HDL-콜레스테롤에 의해 (를 포함 하 여 풀링된 제어) 각 샘플에 대 한 HDLox 지질 과산화 값 정상화) (mg/dl). 결과 섹션에 걸쳐 HDL 황소 n HDL-c.에 대 한 조정을 반영 (HDL-콜레스테롤) HDLox 측정으로 제시 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
- 풀링된 컨트롤의 값에 대 한 각 샘플의 HDLox 지질 과산화 값 표현의 표준화. N (HDL-콜레스테롤) HDLox 지질 과산화 풀링된 컨트롤의 값에 의해 n (HDL-콜레스테롤) HDLox 지질 과산화 (HDL-콜레스테롤에 대 한 조정) 각 샘플에 대 한 값을 정상화. 결과 섹션에 걸쳐 HDL 황소 실험적인 다양성와 HDL-C에 대 한 조정을 반영 하기 위해 nHDL 황소 측정으로 제시 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
참고:이 방법은 같은 측정의 실험적인 다양성을 줄이기 위해 다른 설립된 실험적인 접근 비슷합니다 국제 정상화 비율 (INR) 44 , 45. 이 방법은 임상 연구 32 , 33 , , 34 35 , 36에서 검증 되었습니다. , 37 , 38 , 39. - 표준 품질 관리 샘플을 사용 하 여 실험 결과의 품질 관리를 수행. 각 연구소는 그들의 자신의 품질 컨트롤 (QCs)를 설정 해야 합니다. 이상적으로 있다 알려진된 역 기능 HDL과 샘플에서 nHDLox에 대 한 품질 관리와 건강 한 기증자 [예: 사용 풀링된에서 샘플을 설립된 혈액 은행 기증자 알려진된 comorbidity 없고 위험 요소에 대 한 젊은 성인에서에서 샘플에서 nHDLox에 대 한 품질 관리 심장 혈관 질병 흡연 포함]입니다. 후자의 제어 다른 실험실 간의 결과 표준화합니다. 이러한 QCs의 평균 값 (일반적으로 우리가 사용 10 복제가 중요 한 단계에 대 한) 설립된에 따라 적어도 5 복제 됩니다.
- 확인 값의 예상된 범위 내 값 여부 측정된 QCs 각 분석 결과에 있다. 15%의 허용 최대 실험적인 변화를 가정, 모든 측정된 실험 값 한다 설립된 QC의 알려진된 평균 값의 15%가. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
참고: 포함 된 품질 관리 중 (샘플링 하는 경우 역 기능 HDL 대 정상) HDLox 값 예상된 범위 (각 연구실에 설립) 밖에 제공 다음 반복 실험.
- 확인 값의 예상된 범위 내 값 여부 측정된 QCs 각 분석 결과에 있다. 15%의 허용 최대 실험적인 변화를 가정, 모든 측정된 실험 값 한다 설립된 QC의 알려진된 평균 값의 15%가. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
- 실험적인 변화를 계량 편차 (CV)의 계수를 사용 하 여 실험 결과의 품질 관리를 수행: CV %와 함께 모든 샘플 반복 > 15%. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
참고: (이내 같은 접시) 일반적인 내부 분석 결과 (다른 접시) 가운데 간 분석 결과 실험 다양성은 < 15%. 2)는 일반적인 내부 분석 결과 이력서는 1-7% ~ 이력서 3-10% 사이 전형적인 interassay.
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Representative Results
각 HDL 샘플의 50 µ L 단계 7.3에서 각 음에 추가 됩니다. 50 µ L HRP 솔루션 5 U/mL (0.25 U) 그런 다음 단계 7.5에서 각 음에 추가 됩니다. 샘플 단계 7.6에서 37 ° C에서 30 분 동안 알을 품는. 형광 색소 시 약의 50 µ L 다음 단계 7.7 (300 µ M의 최종 농도)에서 각 음에 추가 됩니다. (에서 어두운) 형광 판독입니다 다음 매 순간 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 동안 평가 했다. 빈, 풀링된 컨트롤에 대 한 대표적인 형광 데이터, 알려진된 역 기능 HDL와 샘플 및 샘플 일반 HDL 그림 4에 표시 됩니다. 원시 대표적인 데이터와 프로토콜의 8에서에서 설명 하는 방정식을 사용 하 여 결과의 단계 분석 에서처럼 표 1. 이 예제에서는 신선한 HDL 샘플 사용 하 고 HDLox 값은 일반적으로 신선한 HDL 취득. 예를 들어 기능에 따라 독립적인 분석 HDL 기능 그리고 HIV 감염 된 사람에서 알려진 HDL 건강 한 참가자에서 풀링된 HDL에 비해 지질 과산화의 약 2-fold 상대적으로 높은 금액을 했다. 그림 5 는 HDL 기능28,32를 장애인에 게 알려진 주제와 연구에서 대표적인 결과 보여 줍니다. HIV에 감염 된 사람의 약 60% 더 높은 감염 되지 않은 사람에 비해 HDL-지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDL-콜레스테롤의 mg) 당을 의미 했다. Cryopreserved HDL과 우리의 사전 출판된 연구에서이 메서드는 적어도 10 %HDLox 상대적인 차이 제어 그룹 (예: 만성 HIV 감염 질병) 없는36,37, 에서 HDL에 비해 보여줄 수 38.
그림 1: 결정 콘텐츠의 HDL 지질 과산화 수소 당 특정 양의 HDL.
조직의 염증 및 산화 긴장의 상태에서 HDL 장애인된 HDL 기능 연관 된 지질 과산화물 (LOOH) (HDLox) 증가 했다. HRP catalyzes 형광 resorufin 빨간색을 형광 비 형광 색소의 산화. 이 산화 반응 (OH-)에 내 인 성 과산화물 및 HDL-지질 과산화물 (LOOH-)에 의해 구동 될 수 있습니다. 없이 콜레스테롤 산화 효소 (HRP)와 resorufin HDL 콜레스테롤의 특정 금액의 본질적인 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠를 계량 수 있습니다. 버퍼의 공기 산화의 결과로 오-배경 생산의 각 형광 판독에서 뺍니다. Resorufin는 최소 autofluorescence 대부분의 샘플에 있습니다. 이 그림은 수정된 32이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: HDL 지질 과산화의 fluorochromeassay에 대 한 워크플로 개요.
일 0: 분석 결과 대 한 준비: A) 96 잘 접시 레이아웃 디자인, 추정의 볼륨 필요한 샘플 (혈장/혈 청) 및 시 약 (HRP 효소, 형광 색소 시 약, 버퍼, 못 시 약), 라벨 튜브
주 1: 분석 결과 및 HDL 격리에 대 한 준비: A) 말뚝 시 약을 사용 하 여 컨트롤 (연구 특정 풀링 제어, 품질 제어, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤) B) HDL 강수량의 준비.
주 2: 분석 결과 (하지 경우 하루 1에서)와 형광 색소 분석 결과 대 한 준비: A) 컨트롤 (연구 특정 풀링 제어, 품질 제어, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤) A의 준비) HDL 샘플의 추가: 실험적인 변화를 최소화 하 고 시 약 및 샘플의 추가 일관 되 게 할 것입니다 적시는 것이 좋습니다 별도 96 잘 라운드-하단, 분명, 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 플레이트 (접시 1) 샘플 (예: 160 µ L)의 모든 추가 행해진다 먼저 확인 합니다. 다음 3 96 잘 접시로 특정 볼륨 (예: 50 µ L)를 전송 하는 멀티 채널 피 펫을 사용할 수 있습니다 (2-4 격판덮개: 폴 리 프로필 렌, 편평한 바닥, 검은 접시) (그 동일한 레이아웃을가지고). HRP의 B) 추가: 5 U/mL (0.25 U) 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫 C의 추가 50 µ L) 30 분 D 37 ° C에서 품 어) 300 µ M/잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫 전자를 형광 색소 시 약의 추가 50 µ L) 평가 (에서 어두운) 형광 판독 매 순간 형광 판 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 이상.
주 3: 데이터 분석입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 형광 색소 HDL 기능 분석 결과에서 일반적으로 사용 되는 96 잘 접시의 대표적인 레이아웃.
접시의 우물으로 HDL 샘플의 추가의 타이밍에 차이가 다른 우물 사이 자발적인 산화에 차이가 발생할 수 있습니다. 실험적인 변화를 최소화 하기 위해 다른 우물 사이의 가변 자발적인 산화를 방지 하 고 시 약 및 샘플의 추가 일관 되 게 할 것입니다 하 고 적절 한 시기에 것이 좋습니다 (예: 160 µ L)의 모든 추가 먼저 별도 96 잘 라운드-하단, 분명, 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 플레이트 (접시 1) 다. 다음 3 96 잘 접시로 특정 볼륨 (예: 50 µ L)를 전송 하는 멀티 채널 피 펫을 사용할 수 있습니다 (2-4 격판덮개: 폴 리 프로필 렌, 편평한 바닥, 검은 접시) (그 동일한 레이아웃을가지고). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: HDL 지질 과산화 분석 결과의 대표적인 데이터입니다.
(어둠)에 형광 판독입니다 다음 매 순간 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 동안 평가 했다. 대표적인 데이터 (임의의 단위) 기능 장애 HDL (두 개의 독립적인 HDL 기능을 기반으로 하는 환자에서 빈 (아무 HDL, 부정적인 컨트롤), 긍정적인 제어 (H2O2), 풀링된 HDL 제어 및 HDL에 대 한 표시 됩니다. 분석 실험-콜레스테롤 경과 고 monocyte chemotaxis 분석 결과). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: HDL 함수의 지질 과산화 수소 assay 높은 지질 과산화 HDL-콜레스테롤 비보의 특정 금액 당 콘텐츠를 검색할 수 있습니다.
HDL 고립 되었고 50 건강 한 과목 및 HIV 감염을 가진 100 환자 프로토콜에 설명 된 대로 HDLox 결정 했다. HIV에 감염 된 사람 했다 컨트롤 (1.01±0.31)에 비해 더 높은 HDLox (1.59±0.53) (p < 0.001). 이 그림은 수정된 32이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 동맥 경화 및 인간 질병에 HDL 함수의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 분석 결과 효소 증폭 (HRP)를 사용 하 여 HDL-콜레스테롤의 mg 당 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 단정. 이 접근 방지 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족과 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 하 여 이전 HDL 기능 분석 (예: 콜레스테롤 경과 분석 결과)의 알려진된 제한 사항 트리 글리세라이드7,,1532. HDL의 생물 학적 속성 (예: 콜레스테롤 경과) 보다 생화학의 결정 더 재현할 수 있습니다. 간 분석 결과 실험 다양성 < 10% 호의 비교 하 여 HDL 함수, interassay 실험적인 다양성은 종종의 세포 기반 분석으로 > 15% (또는 보고 되지 않은). 또한,이 방법은 지질 사이 생 화 학적 상호 작용을 제한할 수 있습니다 및 형광 프로브32. HDL 산화의 결정은 atherogenesis 46의 병 인에서 동맥 벽 내에서 산화 스트레스의 중요 한 역할을 부여 하는 심장 혈관 질병의 맥락에서 관련. 형광 색소 HDL 기능 분석 결과 인간 면역 결핍 바이러스 감염 (HIV)32동맥 경화 등 만성 산화 스트레스의 주에서 검출 장애인된 HDL 기능을 사용 했습니다. HDL 기능의 생 화 확 적인 분석 결과 사용 하 여, 여러 연구 결과 비만과 심혈 관 질환 19,,2127,34,35 HDLox의 협회를 확인 했습니다. ,,3647. 크게, 인간 파일럿 연구에서 우리가 보여주는 유효한 세포 기반 분석 실험, HDLox의 연결 조직의 염증, 면역 부전, 심혈 관 질환의 측정을 대리 고 심혈 관 및 대사 위험 관련 고기32,36. 이 분석 결과 만성 HIV 감염32,의38, 같은 다른 질병에 HDL 기능의 역할을 해결 하기 위해 여러 연구에서 사용 되었다 비록 동맥 경화 비만 32 36, 수에 남아 있다 CVD (예: 심장 발작)의 사용 가능한 임상 끝점과 대규모 연구에서 확인.
높은 형광 resorufin를 생산 하는 HRP의 과산화물과 형광 색소의 반응 잘 설립된 48,49이다. HRP catalyzes 형광 resorufin 레드50,51비 형광 형광 색소의 산화. 이 산화 반응 (OH-)에 내 인 성 과산화물 및 HDL-지질 과산화물 (LOOH-)에 의해 구동 될 수 있습니다. 없이 콜레스테롤 산화 효소 (HRP)와 resorufin HDL 콜레스테롤의 특정 금액의 본질적인 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠를 계량 수 있습니다. 버퍼의 공기 산화의 결과로 오-배경 생산의 각 형광 판독에서 뺍니다. Resorufin는 최소 autofluorescence 대부분의 샘플에 있습니다. 신속 하 게 반응 버퍼에 catalase (1-4 U/mL)의 추가 형광 판독 시간이 지남에 증가 HDL 지질 과산화물에 의해 구동 됩니다 있도록 생 과산화물을 약하게 수 있습니다. 분석 결과 다목적 이며 HDL cholesteryl 에스테 르 무료 HDL 콜레스테롤32,,4849 대에서 지질 과산화 수소 콘텐츠를 평가할 수 있습니다.
형광 색소 HDL 기능 분석 결과32의 많은 변이가 있다. 짧게 적어도 3 주요 접근이 있다:는) 잘 당 HDL (예: 50 µ L)의 특정 볼륨을 추가 하 고 나중에 임상 실험실;에 따라 HDL-콜레스테롤의 수준에 의해 HDL 지질 과산화 값 정상화 b) 표준 색도계 콜레스테롤 분석에 따라 각 샘플에서 HDL-콜레스테롤의 농도 결정 한 다음 잘; 당 HDL-콜레스테롤 (예: 1 µ g)의 특정 금액을 추가 그리고 c) HDL 또는 apoA HDL 함수 판독 정상화-난 단백질 콘텐츠32. 또한 HDL 지질 과산화 분석 실험에 대 한 HDL을 분리 하는 방법에 3 주요 접근이 있다: a) HDL 콜레스테롤 예: 폴 리 에틸렌 글리콜;와 강 수 b) Immunoaffinity 캡처; 그리고 c) µLtracentrifugation32같은 HDL 격리에 대 한 다른 표준 하지 높은 처리량 방법. 또한, 분석 결과 다목적 이며 HDL cholesteryl 에스테 르 무료 HDL 콜레스테롤 32대에서 지질 과산화 수소 콘텐츠를 평가할 수 있습니다. 결과 예: 임의의 형광 단위, 표준화 된 resorufin 형광 단위, 정규화 풀링된 컨트롤32로 비율을 보고 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 여기 선물이 가장 재현할 수 접근.
플라즈마를 사용 하는 경우에, 나트륨 구 연산 염 항 응 혈 약 27,28있는 튜브에 플라즈마를 준비 하는 것이 중요 하다. EDTA40 및 헤 파 린 황산 산화 반응 41,42방해할 수 있습니다. 헤 파 린 황산 HDL 기능 27,28의 생 화 확 적인 분석 실험을 방해할 수 있습니다. Cryopreserved 혈 청 및 혈장 지질, HDL 기능 및 HDL 지질 과산화에 대 한 차선은, cryopreserved 샘플 HDL의 밀리 그램 당 HDL 지질 과산화에 상대적 차이 계량 수 있습니다. 그것은 정확히 동일한 방식으로 (예: 동일한 freeze-thaw 주기) 특정 연구에서 모든 샘플을 처리 하 고 풀링된 컨트롤 차이 다른 연구 중 샘플 처리에 관련 된 잠재적인 confounders에 대 한 계정에 각 접시에 포함 해야 합니다. 장기적인 cryopreservation HDL 기능 분석 실험43 의 결과 손상 시킬 수 있지만 적절 한 풀링된 컨트롤은 사용된 27, 한 연구에서 샘플 중 HDL 지질 과산화에 상대적 차이 평가 여전히 수 있습니다. 28.
중요 한 것은, 사전 HDL 기능 분석 실험은 표준화 되지. 여기 어디 적절 한 컨트롤을 사용 하면 판독의 표준화 된 접근 방식을 설명 합니다. 더 구체적으로 HDL의 생 화 확 적인 분석 실험의 판독에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 알려진된 매개 변수 cryopreservation, 매트릭스 효과 (혈 청 vs 플라즈마 준비의 방법), 알 부 민 및 다른 단백질의 존재에와 같은 작동 동결-해 동 32.는 HDL 함수 형광 색소 분석 결과 상용 표준 및 실험 시 약32의 사용으로 표준화 될 수 있습니다. 그러나, 또한 있다각 여러 알 수 없는 (또는 저조한 특징이) confounders 공부 하 고 HDL의 결정에 영향을 미칠 수 있습니다 다른 사람 중 결과 기능. 따라서, 각 접시에서 우리는 주어진된 연구 (동일 하 게 처리 된) 고 confounders32최소화 하 내 관심의 특정 표본에서 준비 풀링된 HDL 컨트롤 사용. 플라즈마 혈액 은행 샘플 및 임상 실험실에서 HDL-콜레스테롤 값 사용 하 여 추가 분석 결과32를 표준화할 수 있습니다.
우리 이전 보여주었다 HDL 고립의 다른 방법을 크게 HDL 기능 27,,2832 의 생 화 확 적인 분석 실험의 판독에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나는 형광 색소 안정적으로 HDLox 없이 측정할 수 있습니다. HDL 절연 32의. HDL 격리 방법은 HDL 함수의 높은 처리량 연구에 대 한 주요 제한 요인이 다. Ultracentrifugation 참조 메서드를 사용 하면 오늘, 간주 됩니다 하지만 시간이 걸리는 방법52남아 있다. 전기 이동 법은 정확 하 고 53표준화 되지. HDL 강수량 방법 polyanions 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 저밀도 지 단백질 표면에 뜨는 54HDL을 떠나 침전 등의 사용을 포함 한다. 사용 하 여 원래 절차 표준화 상업적으로 사용할 수 있지만 이러한 방법에 lipemic serums와 변수 결과 효소 콜레스테롤 절차 55 이전 수정 방해 등 특정 단점을 표시 시 약56간단 하 고 신뢰할 수 있는 정확한 절차 얻을. 나무 못 강 수 HDL21,57 환자 혈 청에서 분리에 일반적으로 사용 되는 방법 이지만, 주요 문제 민58등 비 HDL 단백질의 존재 이다. Immunoaffinity 격리 HDL 기능 32에 알 부 민의 영향을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다. 특정 캡처 방법에 대 한 HDLox에 상대적인 차이 평가할 수 있습니다, 있지만 HDL에 대 한 특정 항 체 복잡 한 HDL 구조 캡처 완전히 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 적절 한 컨트롤을 사용 하 여, HDL 표본 (나무 못 강 수에 의해 격리) HDLox에 상대적인 차이 수 안정적으로 정한다.
이 분석 결과, HDL 함수의 모든 다른 분석 실험 처럼 키 제한이 있다. Vivo에서 산화의 HDL은 동맥 벽에 매우 복잡 하 고 이기종 이며 지질 과산화 수소 콘텐츠 HDLox46반영 부분적 으로만 될 수 있습니다. HDL 구조와 기능 vivo에서 지속적으로 변화 하 고 측정 한 timepoint에 HDL 함수의 시간59최종 기관 질병에서 HDL 부전의 영향 반영 하지 않을 수 있습니다. 그것은 알려져 있지 여부 HDLox 판독 HDL-콜레스테롤, 또는 HDL 단백질 22정규화 해야 합니다. 미래 임상 연구의 분석 결과 (HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 HDL-콜레스테롤의 mg 당) 판독의 중요성을 확인 해야 합니다.
결론적으로, 형광 색소 HDL 기능 분석 결과 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 당 특정 양의 HDL (HDLox)의 결정에 대 한 신뢰할 수 있는 방법입니다. HDLox 값이 높을수록 감소 된 HDL 항 산화 기능으로 연결 됩니다. 이 분석 결과의 판독은 유효한 세포 기반 분석, 대리 조치 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 19, , 면역 부전, 조직의 염증, 심혈 관 질환의 연관 21,27,32,34,35,36,,3738,39, 47. HDL 함수 인간의 질병에서의 역할을 조사 하기 위한 편리 하 고, 아직 강력한 도구를 제공 하는이 방법은.
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Disclosures
이 프로토콜 및 분석 결과 특허 PCT/US2015/018147와 관련이 있습니다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 박사 모하마드 Navab, 앨런 Fogelman와 스리 니 바사 레디의 작품을 인정합니다. T.A.A.는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. AJ와 아 NHMRC 프로젝트 그랜트 1108792에 의해 지원 됩니다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # µL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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