Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cell-free biokjemiske Fluorometric enzymatisk analysen for høy gjennomstrømming-måling av Lipid Peroxidation in høy tetthet Lipoprotein

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

Her beskriver vi en fluorometric celle-fri biokjemiske analysen for fastsettelse av HDL-lipid peroxidation. Denne raske og reproduserbar analysen kan brukes til å bestemme HDL-funksjonen i stor skala studier og kan bidra til vår forståelse av HDL-funksjonen i menneskelig sykdom.

Abstract

Lav high-density lipoprotein (HDL-C) kolesterol nivåer er en av de mektigste uavhengig negative prediktorer for aterosklerotisk kardiovaskulær sykdom (CVD). Struktur og funksjon av HDL i stedet for HDL-C kan mer nøyaktig forutsi åreforkalkning. Flere HDL protein og lipid kompositoriske endringer som svekke HDL-funksjonen forekommer i inflammatoriske tilstander som atherosclerosis. HDL-funksjonen er vanligvis avhengig av cellen basert analyser som kolesterol middelklasseinnbyggere analysen men disse analyser har mange ulemper mangelen på standardisering. Cellen gratis analyser kan gi mer robust tiltak av HDL funksjonen sammenlignet cellebasert analyser. HDL oksidasjon svekker HDL-funksjonen. HDL har en viktig rolle i lipid peroxide transport og høy mengde lipid peroksider gjelder unormal HDL-funksjonen. Lipid-sonden interaksjoner bør vurderes når tolke resultatene av ikke-enzymatisk fluorescens søk for å måle lipid oksidativt staten. Dette motivert oss å utvikle en celle-fri biokjemiske enzymatisk metode for å vurdere HDL lipid peroxide innhold (HDLox) som bidrar til HDL dysfunksjon. Denne metoden er basert på enzymet pepperrotperoksidase (HRP) og fluorochrome Amplex rødt som kan kvantifisere (uten kolesterol oksidase) lipid peroxide innholdet per mg av HDL-C. Her er en describedfor fastsettelse av HDL-lipid peroxidation bruker fluorochrome reagensen. Analysen variasjon kan reduseres med strenge standardisering av eksperimentelle forhold. Høyere verdier for HDLox er forbundet med redusert HDL antioksidant funksjon. Presentasjon av denne analysen er forbundet med readouts av validerte cellen-basert analyser, surrogat tiltak av hjerte-og karsykdommer, systemisk betennelse, immun dysfunction og tilknyttete risikoen for hjerte- og metabolske fenotyper. Denne tekniske tilnærmingen er robust metode for å vurdere HDL-funksjonen i menneskelig sykdom der systemisk betennelse, oksidativt stress og oksidert lipider har en nøkkelrolle (som atherosclerosis).

Introduction

Aterosklerotisk kardiovaskulær sykdom (CVD) er den ledende årsaken til død verdensomspennende1,2. Epidemiologiske studier har vist at lave nivåer av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol er generelt omvendt assosiert med risiko for utvikling av aterosklerose1,2. Selv om flere studier støtter en atheroprotective rolle for HDL1,2, er mekanismen som HDL attenuates Debutalder og progresjon av aterosklerose komplekse 3,4. Derfor har det blitt antydet at kompleks struktur og funksjon av HDL i stedet for absolutte nivå kan mer nøyaktig forutsi aterosklerose 5,6,7,8. Flere HDL protein og lipid kompositoriske endringer som svekke HDL-funksjonen forekommer i inflammatoriske tilstander som atherosclerosis. Disse i) redusere sitt kolesterol middelklasseinnbyggere potensielle 9, ii) redusere anti-inflammatorisk og øke HDL-assosiert pro-inflammatoriske proteiner 6,7, iii) redusere antioksidant faktor nivåer og aktivitet og HDL muligheten til å hindre oksidasjon av lav tetthet Lipoprotein (LDLox)10 og iv) øke lipid hydroperoxide innhold og redoks aktivitet (HDLox)9,11. Robuste analyser som evalueres pleotropic funksjoner HDL (for eksempel kolesterol middelklasseinnbyggere, antioksidant funksjon) kan utfylle fastsettelse av HDL-HDL-C i klinikken.

HDL-funksjonen er vanligvis vurdert av cellebasert metoder som de kolesterol middelklasseinnbyggere analyse8,12,13,14. Disse metodene har store begrensninger inkludert betydelige heterogenitet med hensyn til typer celler brukes, type avlesning rapportert, mangelen på standardisering og forvirrende effekter triglyserider 7,15. Disse ulempene utgjør problemer for store kliniske studier16. Cellen gratis analyser kan gi mer robust tiltak av HDL funksjonen sammenlignet cellebasert analyser. Kolesterol middelklasseinnbyggere er en av de viktigste funksjonene av HDL, men det kan bare bestemmes av cellebasert analyser. Andre tilnærminger til å bestemme HDL-funksjon som Proteomikk17,18,19,20,21,22,23, 24 og cellebasert monocytt chemotaxis analyser HDL funksjonen 17,22,25 ikke er standardisert og kan ikke brukes i stor skala menneskelige studier.

HDL har betydelig antioksidant atheroprotective effekt5,6,7,8. Funksjonen antioksidant av HDL er fastslått i nærvær av LDL i forrige cellen gratis fluorometric analyser 26. Metodene for biokjemiske fluorometric HDL antioksidant funksjonen ble opprinnelig utviklet av Mohamad Navab og Alan Fogelman og deres kolleger26. Selv om mange menneskelige studier har brukt disse metodene til å bestemme HDL funksjonen 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) og lipid-fluorochrome vekselsvirkningene kan begrense reproduserbarhet av disse cellen gratis ikke-enzymatisk biokjemiske analyser av HDL funksjonen27,28.

Siste interesse har fokusert på funksjonell konsekvensene av HDL oksidasjon som er resultatet av oksidasjon av både lipider og proteiner i HDL 27,29,30. Tidligere studier har vist at oksidasjon av HDL svekker HDL funksjonen 27,29,30. HDL har en viktig rolle i lipid peroxide transport og høy mengde lipid peroksider gjelder unormal HDL-funksjonen. Dermed kan HDL lipid peroxide brukes til å bestemme HDL funksjon 9,17,20,31 og gitt de kjente begrensningene i tidligere analyser av HDL funksjon7, 15,27,32, vi utviklet en alternativ fluorometric metode som quantifies HDL lipid peroxide innhold (HDLox) 32. Denne metoden er basert på enzymet pepperrotperoksidase (HRP) og fluorochrome Amplex rødt som kan kvantifisere (uten kolesterol oksidase) lipid peroxide innholdet per mg av HDL-C 32. Biokjemiske prinsippet om analysen er vist i figur 1. Vi har vist at dette fluorescens tilnærming ikke har begrensninger av tidligere HDL funksjonen analyser27,28. Denne analysen har blitt ytterligere forbedret og standardisert i vårt laboratorium slik at den kan trygt brukes i stor skala menneskelige studier selv med cryopreserved plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. presentasjon av denne analysen er forbundet med readouts av validerte cellen-basert analyser, surrogat tiltak av hjerte-og karsykdommer, systemisk betennelse, immun dysfunction og tilknyttete risikoen for hjerte- og metabolske fenotyper 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. her beskriver vi denne enkle, men likevel robust metode for å måle HDL lipid peroxide innhold (HDLox). Denne analysen kan brukes som et verktøy til å besvare viktige forskningen spørsmål om rollen av HDL funksjon i menneskelig sykdom der systemisk betennelse, oksidativt stress og oksidert lipider har en nøkkelrolle (som atherosclerosis)32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle eksperimenter ved hjelp av menneskelig biologiske prøver ble utført med etikk godkjenning fra universitetet av California Los Angeles, Los Angeles og Alfred sykehus menneskelige etikk komiteen, Melbourne.

Merk: det finnes mange varianter av funksjonen fluorochrome HDL analysen (se diskusjon) 32. Nedenfor vil vi beskrive protokollen som gir de mest konsekvente og reproduserbar resultatene. En oversikt over analysen er vist i figur 2.

1. prøven behandling

  1. Bruk friske, ikke-hemolyzed serum (kan være samlet i serum skilletegn rør)- eller citrate innhentet etter 12-14 timer faste. Hvis bruker cryopreserved prøver, inkluderer aktuelle kontrollen som beskrevet i denne protokollen.

2. Dag 0-forberedelse til analysen

  1. forberede arbeider oppsettet av eksperimentet med riktige kontroller, eksempler og replikeres. Kjøre hver prøve minst i triplicates. En representant 96 godt layout er vist i Figur 3.
  2. Beregner alle volumer reagenser som skal brukes for analysen basert på antall prøver og gjentak.
    Merk: Inkluderer en ekstra 10% volum på hver arbeider lager det skal nok volum for hver reagens for det bestemte eksperimentet.
  3. Merke alle nødvendige rør for alle forskjellige trinnene til analysen f.eks for separasjon av HDL, måling av HDL-C (valgfritt) og fluorochromeassay.

3. Dag 1-utarbeidelse av kontroller

  1. utarbeidelse av studie-spesifikke gruppert kontroll
    1. opprette en kontroll prøven fra gruppert plasma- eller serumprøver av alle studere eksempler. Hvis kjører 20 prøver i hver plate i tre eksemplarer, kombinere 10 µL fra hver prøve i en 200 µL samlet kontroll. Gi en separat aliquot for denne gruppert kontrollen til kliniske laboratoriet for å bestemme HDL-C for denne kontrollen.
      Merk: Bruk denne gruppert kontrollen å standardisere analysen og konto for alle mulige kjent (f.eks type matrise serum versus plasma, fryse-Tin sykluser, kryonisk bevaring) og ukjent forstyrrende faktorer som kan påvirke experimental variasjoner 27 , 28.
  2. Utarbeidelse av laboratorium-spesifikke kvalitetskontroll (QCs)
    1. forberede et stort lager av HDL i hvert laboratorium (for eksempel HDL isolert fra 5 mL av plasma fra 10 sunn givere) og cryopreserve flere dele dette lager å minimere fryse-Tin sykluser.
    2. Bruk minst 10 ulike replikerer fra dette lager å bestemme gjennomsnittlig verdi av HDLox. Et akseptabelt utvalg av målt HDLox verdier for hvert QC utvalg i hver analysen er innenfor < 15% av koeffisient variant av denne gjennomsnittsverdien.
    3. Gi en separat aliquot for denne gruppert kontrollen til kliniske laboratoriet for å bestemme HDL-C for denne kontrollen (f.eks 40 mg/dL).
      Merk: En detaljert tilnærming bruke blod fra blodbanker til å opprette disse kontrollene har tidligere blitt beskrevet 27 , 28 , 32. Bruke flere QCs som trengs (f.eks en fra en frisk donor kjent for å ha normal HDL-funksjon og en fra en donor kjent for å ha hovedsakelig unormal HDL funksjonen.
  3. Optimalisering av bakgrunn signal og tomme verdier (valgfritt)
    1. for å minimere bakgrunn, legge til riktig mengde catalase (1-4 U/mL) i inkubasjon medium raskt fjerne den dannet H 2 O 2 på grunn av spontane luft oksidasjon av bufferne.
      Merk: Siden verdiene fra Tom brønnene (ingen HDL) trekkes fra verdiene av HDL prøvene og resultatene blir rapportert i forhold til en gruppert kontroll (som finnes i samme 96 godt plate), vi har funnet at dette trinnet er ikke praktisk talt affec t resultatene. Dermed optimalisering av bakgrunnen med catalase kan utelates hvis nødvendig.

4. Dag 1-separasjon av HDL kolesterol med HDL nedbør

Merk: Bruk en kommersielt tilgjengelig standardisert HDL kolesterol fremskynde reagens isolere apoB utarmet serum ifølge produsenten ' s instruksjoner. Skal disse reagensene er mye brukt i kolorimetrisk analyser for å bestemme HDL kolesterol nivåer.

  1. Bruke friske (eller tine) plasma- eller serumprøver eksempel.
  2. Blande like volum (f.eks 80 µL) plasma og HDL kolesterol fremskynde reagens (20% w/v polyetylenglykol glysin buffer ved pH 10.0 (25 ° C)).
  3. Blandingen godt av pipettering opp og ned.
  4. Sentrifuge på 1000-2000 x g for 10 min.
  5. Sug opp nedbryting (HDL brøkdel).
  6. Ideelt bruk straks den isolerte HDL for fluorochromeassay av HDL lipid peroxidation. Hvis flere prøver kjøres i samme dag og andre trinn som måling av HDL-kolesterol konsentrasjon er også gjort, deretter lagre den isolerte HDL på 4 ° C og bruke den dagen for funksjonen fluorochromeHDL analysen.

5. Dag 1-bestemmelse av HDL-C i isolerte HDL

Merk: Dette er valgfritt hvis verdien av HDL-C fra kliniske laboratoriet brukes til å normalisere HDLox av HDL-C.

  1. Kvantifisere HDL-kolesterol fra plasma, ved hjelp av standard kolorimetrisk søk 27. Legge til 50 µL av kolesterol reagensen i hver brønn og bestemme kolesterol konsentrasjon bruke en kolorimetrisk plate-leser og en kolesterol standard i hver pakke.

6. Dag 2-forberedelse av reagenser

  1. forberede HRP og kolesterol løsninger HRP 5 U/mL løsning (mellom 1 og 10 U/mL).
  2. Forberede 20 mM fluorochrome (f.eks Amplex rød) løsninger: tine ampuller med fluorochrome reagens og DMSO til romtemperatur. Før bruk må løses fluorochrome reagenser (1 mg) med 200 µL av DMSO. Lagre lagerløsning frosset ved ≤ 20 ° C, beskyttet fra lys.
  3. Forberede positive og negative kontroller: Bruk 1 X ' reaksjon buffer ' uten kolesterol og 20 mM H 2 O 2 arbeider løsning som en negative og positive, henholdsvis.

7. Dag 2-Fluorochrome analysen

  1. legge til 50 µL av 1 x reaksjon bufferen som tomme (negativ kontroll).
  2. Valgfritt: legge til 20 mM fungerende løsning av H 2 O 2 som positive kontroll i hver plate.
  3. å minimere eksperimentell variasjoner og sikre at tillegg av reagenser og prøver er gjort konsekvent og i tide, utføre alle tillegg av prøver i en separat 96 også runde bunn, klare, polystyren eller polypropylen plate (Plate 1). Bruk deretter en flerkanals pipette overføre spesifikke volumer til 3 96-brønns plater (plater 2-4: polypropylen, flat botTom, svart) (som har identiske oppsett) ( figur 2, Figur 3).
    1. For eksempel først legge 160 µL av isolerte HDL i hvert godt/utvalg av plate 1 og deretter med bruk av flerkanals pipette overføre 50 µL av HDL-kolesterol fra hver brønn/prøve i 96-brønnen svart platene. Endre tips mellom hver rad/kolonne og bruk ufiltrerte tips for alle overføringene.
  4. La prøver i brønnene. Ikke kast. Det er ingen vask trinn mellom tillegg reagenser.
  5. Legge til 50 µL av HRP løsning 5 U/mL (0,25 U) i hver brønn.
    Merk: Bruk HRP før en fluorochrome reagens.
  6. Ruge i 30 min på 37 ° C. Ikke kast prøver etter inkubasjon (ingen vask trinn mellom tillegg av reagenser).
  7. Legge til 50 µL av fluorochromereagent for en siste konsentrasjon av 300 µM. På dette punktet, totalt reaksjon er 150 µL. Bland godt og beskytte mot lyset.
  8. Vurdere den fluorescerende avlesning (i mørket) hvert minutt over 120 min på 37 ° C med en fluorescerende plate leseren (530/590 nm filterene).
    Merk: Bruk en kortere 60 minuttene med fersk prøver. Vi har funnet at 120-minutters analysen gir mer reproduserbar data med bruk av cryopreserved prøver.
  9. Registrerer data ved hjelp av riktig programvare.

8. Dag 3-Data analyse

  1. registrere fluorescens enheter (vilkårlig enheter) 120 minutter etter fluorochrome reagens for alle prøvene inkludert tomt brønner og alle kontroller.
  2. Beregner middelverdien av fluorescens enheter (basert på minst triplicates) (HDL ox_sample). Ikke ta outliers (> 2 SDs fra gjennomsnittsverdien) i betraktning.
  3. Trekke bakgrunn fluorescens ved hjelp av følgende ligning:
    Equation 1
  4. normalisering HDL kolesterol beløpet (HDL-C): normalisere HDLox lipid peroxidation verdien for hvert utvalg (inkludert kontrollen gruppert) av HDL-C) (mg/dl). Hele delen resultater vises HDL okse som n (HDL-C) HDLox mål gjenspeiler korrigering for HDL-C. Bruk denne formelen:
    Equation 2
  5. standardisere uttrykket HDLox lipid peroxidation verdien av hver prøve mot verdien av en gruppert kontroll. Normalisere n (HDL-C) HDLox lipid peroxidation verdi for hvert utvalg (justert for HDL-C) av n (HDL-C) HDLox lipid peroxidation verdien i kontrollen gruppert. Hele delen resultater presenteres HDL okse som nHDL okse gjenspeiler korrigering for eksperimentell variasjon og HDL-C. Bruk denne formelen:
    Equation 3
    Merk: denne metoden ligner andre etablerte eksperimentelle metoder å redusere eksperimentell variasjoner av målinger som internasjonalt normalisert ratio (INR) 44 , 45. Denne tilnærmingen har blitt validert i kliniske studier, 32 ,, 33 ,, 34 ,, 35 ,, 36 , 37 , 38 , 39.
  6. utføre kvalitetskontroll av eksperimentelle resultater standard kvalitetskontroll utvalg. Hvert laboratorium bør etablere egne kvalitetskontroll (QCs). Ideelt er det en QC for nHDLox fra et utvalg med kjente dysfunksjonelle HDL og en QC for nHDLox fra et utvalg av friske blodgivere [f.eks bruk gruppert utvalg av unge voksne som etablerte blod bank givere og har ingen kjente lidelser og risikofaktorer for hjerte-og karsykdommer som er inkludert røyking]. Sistnevnte kontrollen standardiserer resultatene blant annet laboratorier. De gjennomsnittlige verdiene av disse QCs er etablert basert på minst 5 replikat (vanligvis vi bruker 10 gjentak for dette viktige skrittet).
    1. Sjekk om målt QCs i hver analysen har verdier innenfor det forventede verdiområdet. Forutsatt en akseptabel maksimal eksperimentell variasjoner på 15%, bør alle eksperimentelle måleverdiene falle innenfor 15% av de kjente gjennomsnittlige verdiene av etablerte QC. Bruk følgende ligningene:
      Equation 4
      Equation 5
      Merk: Hvis en av inkludert kvalitetskontrollen prøver ( normal versus dysfunksjonelle HDL) gir HDLox verdier utenfor forventet (etablert i hvert laboratorium) så gjenta eksperimentet.
  7. Utføre kvalitetskontroll av eksperimentelle resultater bruker variasjonskoeffisienten (CV) for å kvantifisere eksperimentell variasjoner: gjenta alle prøver med CV % > 15%. Bruk denne formelen:
    Equation 6
    Merk: en typisk intra-analysen (innen den samme platen) og mellom analysen (blant annet plater) eksperimentelle variasjon < 15%. 2) en typisk intra-analysen CV er mellom 1-7% og en typisk interassay CV er mellom 3-10%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

50 µL av hver HDL prøve, legges til i hver brønn i skritt 7.3. 50 µL av HRP løsning 5 U/mL (0,25 U), deretter legges til i hver brønn i skritt 7.5. Eksempler er ruges i 30 min på 37 ° C som i trinn 7.6. 50 µL av fluorochrome-reagensen legges deretter inn hver brønn i skritt 7.7 (siste konsentrasjon på 300 µM). Den fluoriserende avlesning (i mørket) vurderes deretter hvert minutt over 120 minutter på 37 ° C med en fluorescerende plate leseren (530/590 nm filterene). Representant fluorescens data for tom, gruppert kontroll, prøve med kjente dysfunksjonelle HDL og prøve med normal HDL vises i Figur 4. Rådataene representativt og trinnvis analyse av resultater bruker ligningene som beskrevet i del 8 av protokollen vises i tabell 1. I dette eksemplet frisk HDL prøver ble brukt og høyere HDLox verdier generelt oppnås med fersk HDL. For eksempel hadde HDL kjent for å være dysfunksjonelle basert på uavhengige analyser av HDL-funksjonen og HIV-smittet person ca 2-fold relativt høyere mengde lipid peroxide sammenlignet med grupperte HDL fra friske forsøkspersoner. Figur 5 viser representant resultater fra en studie emner kjent dårlig HDL funksjonen28,32. HIV-infiserte personer hadde ca 60% høyere mener HDL-lipid peroxide innhold (per mg av HDL-C) i forhold til uninfected personer. I vår tidligere publiserte studier med cryopreserved HDL kunne denne metoden demonstrere minst 10% relativ forskjeller i HDLox sammenlignet med HDL kontroll (uten sykdom f.eks kronisk HIV-infeksjon)36,37, 38.

Figure 1
Figur 1: Bestemmelse av HDL lipid peroxide innhold per bestemt mengde HDL-C.
I systemisk betennelse og oksidativt stress økt HDL lipid peroksider (LOOH) (HDLox) som er forbundet med nedsatt HDL-funksjonen. HRP katalyserer oksidasjon av ikke-fluorescerende fluorochrome å fluorescerende resorufin rød. Denne oksidasjon kan være drevet av både endogene peroksider stede i reaksjon (OH-) og HDL-lipid peroksider (LOOH-). Uten kolesterol oksidase, kan resorufin (med HRP) kvantifisere iboende HDL lipid peroxide innholdet i en bestemt mengde HDL kolesterol. Bakgrunn produksjon av OH - som et resultat av luft oksidasjon av bufferen blir trukket fra er fluorescerende avlesning i hver brønn. Resorufin har minimal autofluorescence mest prøvene. Dette tallet har blitt modifisert 32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over arbeidsflyten for fluorochromeassay av HDL lipid peroxidation.
Dag 0: Forberedelse til analysen: A) design 96 godt plate oppsett, beregne mengden nødvendig prøver (plasma/serum) og reagenser (HRP enzym, fluorochrome reagens, buffere, PEG reagens), merke rør
Dag 1: Forberedelse til analysen og HDL isolasjon: A) utarbeidelse av kontroller (studie spesifikke-samlet kontroll, kvalitetskontroll, positive og negative kontroller) B) HDL nedbør bruker PEG reagens.
Dag 2: Forberedelse til analysen (hvis ikke gjort i dag 1) og fluorochrome analysen: A) forberedelse av kontroller (studie spesifikke-samlet kontroll, kvalitetskontroll, positive og negative kontroller)) tillegg av HDL eksempler: Å minimere eksperimentell variasjoner og Kontroller at tillegg av reagenser og prøver vil bli gjort konsekvent og i tide anbefales det at alle tillegg av prøver (f.eks 160 µL) utføres først i en separat 96 også runde-bunn, klart, polystyren eller polypropylen plate (Plate 1). Så en flerkanals pipette kan brukes til å overføre spesifikke volumer (f.eks 50 µL) til 3 96-brønns plater (plater 2-4: polypropylen, flat bunn, svart plater) (som har identiske oppsett). B) tillegg av HRP: legge til 50 µL av 5 U/mL (0,25 U) til hver godt med en flerkanals pipette C) Incubate på 37 ° C i 30 min D) legge til 50 µL av 300 µM/godt av fluorochrome reagens til hver godt med en flerkanals pipette E) vurdere er fluorescerende avlesning (i mørket) hvert minutt over 120 minutter på 37 ° C med en fluorescerende plate leseren (530/590 nm filterene).
Dag 3: Dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representant utformingen av 96 bra plater som vanligvis brukes i funksjonen fluorochrome HDL analysen.
Forskjeller i tidspunktet for tillegg av HDL prøver i brønner av en plate kan føre til forskjeller i spontan oksidasjon mellom forskjellige brønner. For å minimere eksperimentell variasjoner, unngå variabel spontan oksidasjon mellom forskjellige brønner og sikre at tillegg av reagenser og prøver vil bli gjort konsekvent og i tide, anbefales det at alle tillegg av prøver (f.eks 160 µL) er først gjort i en separat 96 også runde-bunn, klart, polystyren eller polypropylen plate (Plate 1). Så en flerkanals pipette kan brukes til å overføre spesifikke volumer (f.eks 50 µL) til 3 96-brønns plater (plater 2-4: polypropylen, flat bunn, svart plater) (som har identiske oppsett). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representant data HDL lipid peroxidation analysen.
Den fluoriserende avlesning (i mørket) vurderes deretter hvert minutt over 120 minutter på 37 ° C med en fluorescerende plate leseren (530/590 nm filterene). Representant data (vilkårlig enheter) vises for tom (ingen HDL, negative kontroller), positiv kontroll (H2O2), gruppert HDL kontroll og HDL fra pasient kjent for å ha dysfunksjonelle HDL (basert på to uavhengige HDL-funksjonen analyser-kolesterol middelklasseinnbyggere og monocytt chemotaxis analysen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Lipid peroxide analysen HDL-funksjonen finner høy lipid peroxide innhold per bestemt mengde HDL-C i vivo.
HDL ble isolert og HDLox identifiserte som beskrevet i protokollen 50 friske og 100 pasienter med HIV-infeksjon. HIV-infiserte personer hadde høyere HDLox (1.59±0.53) sammenlignet med kontrollene (1.01±0.31) (p < 0,001). Dette tallet har blitt modifisert 32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her tilbyr et kraftig verktøy for å besvare viktige forskningen spørsmål om rollen av HDL funksjon i åreforkalkning og menneskelig sykdom. Analysen kvantifiserer HDL lipid peroxide innholdet per mg av HDL-C benytter enzymatisk utvidelse (HRP). Unngår denne tilnærmingen kjente begrensninger av tidligere HDL funksjonen analyser (f.eks kolesterol middelklasseinnbyggere analysen) inkludert betydelige heterogenitet med hensyn til typer celler brukes, type avlesning rapportert, mangelen på standardisering og forvirrende virkningene av triglyserider7,15,32. Fastsettelse av biokjemiske biologiske egenskaper (f.eks kolesterol middelklasseinnbyggere) av HDL kan være mer reproduserbare. Inter analysen eksperimentelle variasjon av < 10% sammenligner gunstig med cellebasert analyser av HDL-funksjonen, der interassay eksperimentelle variasjon er ofte > 15% (eller ikke rapportert). I tillegg denne tilnærmingen kan begrense biokjemiske interaksjoner mellom lipider og fluorescerende sonder32. Fastsettelse av HDL oksidasjon er relevant i forbindelse med hjerte-og karsykdommer gitt oksidativt stress i arterieveggen nøkkelen rolle i patogenesen ved atherogenesis 46. Vi har brukt fluorochrome HDL funksjonen analysen for å oppdage svekket HDL-funksjonen i stater kronisk oksidativt stress som åreforkalkning og humant immunsviktvirus (HIV)-infeksjon32. Bruker biokjemiske analysen av HDL funksjon, har flere studier bekreftet association of HDLox med fedme og hjerte-og karsykdommer 19,21,27,34,35 ,36,47. Betydelig, i menneskelig pilotstudier vi viste sammenslutninger av HDLox med validert celle-baserte analyser, surrogat tiltak av hjerte-og karsykdommer, systemisk betennelse, immun dysfunction og tilhørende hjerte og metabolske risiko fenotyper32,36. Selv om denne analysen har blitt brukt i flere studier for å ta rollen HDL-funksjonen i ulike sykdommer som kronisk HIV infeksjon32,38, aterosklerose 32 og fedme36, det gjenstår å validert i stor skala studier med tilgjengelig klinisk endepunktene på CVD (f.eks hjerteinfarkt).

Reaksjonen av fluorochrome med peroksider i nærvær av HRP å produsere svært fluorescerende resorufin er godt etablert 48,49. HRP katalyserer oksidasjon av ikke-fluorescerende fluorochrome til fluorescerende resorufin rød50,51. Denne oksidasjon kan være drevet av både endogene peroksider stede i reaksjon (OH-) og HDL-lipid peroksider (LOOH-). Uten kolesterol oksidase, kan resorufin (med HRP) kvantifisere iboende HDL lipid peroxide innholdet i en bestemt mengde HDL kolesterol. Bakgrunn produksjon av OH - som et resultat av luft oksidasjon av bufferen blir trukket fra er fluorescerende avlesning i hver brønn. Resorufin har minimal autofluorescence mest prøvene. Tillegg av catalase (1-4 U/mL) i reaksjon bufferen kan raskt attenuere endogene peroksider slik at økningen er fluorescerende avlesning over tid er drevet av HDL lipid peroksider. Analysen er allsidig og kan vurdere lipid peroxide innhold i HDL cholesteryl estere versus gratis HDL kolesterol32,48,49 .

Det finnes mange varianter av funksjonen for fluorochrome HDL analysen32. Kort det er minst 3 store tilnærminger: en) legge til en bestemt mengde HDL (f.eks 50 µL) per brønn og senere normalisere HDL lipid peroxidation verdien nivået av HDL-C som bestemmes i kliniske laboratoriet; b) bestemme konsentrasjonen av HDL-C i hvert utvalg basert på standard kolorimetrisk kolesterol analyser og deretter legge til en bestemt mengde HDL-C (f.eks 1 µg) per bra; og c) normalisere HDL funksjonen avlesning av HDL eller apoA-jeg protein innhold32. Det er også minst 3 store innfallsvinkler på hvordan å isolere HDL for HDL lipid peroxidation analyser: a) HDL kolesterol nedbør med polyetylenglykol; b) Immunoaffinity innspilling. og c) andre standard ikke høy gjennomstrømming metoder for HDL isolasjon som µLtracentrifugation32. I tillegg analysen er allsidig og kan vurdere lipid peroxide innhold i HDL cholesteryl estere versus gratis HDL kolesterol 32. Det er flere måter å rapportere resultatene f.eks vilkårlig fluorescens enheter, standardiserte resorufin fluorescens enheter, normalisert ratio en gruppert kontroll32. Her presenterer vi de mest reproduserbar tilnærmingen.

Hvis plasma er det viktig å forberede plasma i rør som har natriumsitrat som antikoagulerende 27,28. EDTA40 og heparin sulfate kan forstyrre oksidasjon reaksjoner 41,42. Heparin sulfate kan forstyrre biokjemiske analyser av HDL funksjonen 27,28. Selv om cryopreserved plasmaprøver er suboptimal for fastsettelse av lipider, HDL funksjon og HDL lipid peroxidation, kan cryopreserved prøver kvantifisere relative forskjeller i HDL lipid peroxidation per mg av HDL. Det er viktig å behandle alle prøvene i en konkret studie på nøyaktig samme måte (f.eks samme fryse-Tin sykluser) og inkludere en gruppert kontroll i hver plate rede for mulige forstyrrende faktorer knyttet til forskjeller i eksempel behandling på forskjellige studier. Langsiktig kryonisk bevaring kan kompromittere resultatene av HDL funksjonen analyser43 men relative forskjeller i HDL lipid peroxidation blant prøver i en studie vurderes fremdeles hvis en passende gruppert kontroll er brukt 27, 28.

Viktigere, er tidligere HDL funksjonen analyser ikke standardiserte. Her beskriver vi tilnærming der bruk av egnede kontroller sikrer standardisering av avlesning. Mer spesifikt det er flere kjente parametere som kan påvirke avlesning av biokjemiske analyser av HDL funksjonen matrix effekter (serum vs metode for plasma forberedelse), albumin og andre proteiner, kryonisk bevaring, fryse-tining 32. the HDL funksjon fluorochrome analysen kan være standardisert med bruk av kommersielt tilgjengelig standarder og eksperimentelle reagenser32. Men er det ogsåflere ukjente (eller dårlig preget) forstyrrende-faktorer i hver studere og blant forskjellige personer som kan påvirke fastsettelse av HDL fungere resultater. Dermed i hver plate bruker vi en gruppert HDL kontroll forberedt fra lipopolysakkarid av interesse innenfor en gitt studie (som har blitt behandlet identisk) som minimerer gjenstander og forstyrrende faktorer32. Bruk av blod bank plasmaprøver og HDL-C verdier fra kliniske laboratoriet kan videre standardisere analysen32.

Vi har tidligere vist at ulike metoder HDL isolasjon kan påvirke avlesning av biokjemiske analyser av HDL funksjonen 27,28,32 men fluorochrome kan pålitelig måle HDLox uansett av HDL isolasjon 32. HDL er isolasjon en viktig begrensende faktor for høy gjennomstrømming studier av HDL-funksjonen. Ultracentrifugation regnes metoden referanse i dag, men fortsatt en tidkrevende metode52. Geleelektroforese er upresise og standardiserte ikke 53. HDL nedbør metoder omfatter bruk av polyanions som polyetylenglykol (PEG) til å fremkalle lav tetthet lipoproteiner forlater HDL i de supernatant 54. Selv om disse metodene vises visse ulemper som variable resultater med lipemic serum og forstyrrelser med enzymatisk kolesterol prosedyrer 55 tidligere endringer i standardisert den opprinnelige prosedyren bruker kommersielt tilgjengelig reagenser gir en enkel, pålitelig og nøyaktig56. Selv om PEG nedbør brukte metoden å isolere HDL21,57 fra pasienten serum, er et stort problem ikke-HDL proteiner som albumin58. Immunoaffinity isolasjon kan brukes til å redusere effekten av albumin på HDL funksjonen 32. Selv om relative forskjeller i HDLox for en bestemt fange kan vurderes, kan ikke spesifikke antistoffer mot HDL, fullt fange komplekse HDL strukturer. Bruke egnede kontroller som beskrevet i denne protokollen, kan relative forskjeller i HDLox HDL prøver (isolert av PEG nedbør) pålitelig bestemmes.

Denne analysen, som alle andre analyser av HDL-funksjonen, har viktige begrensninger. I vivo oksidasjon av HDL i arterieveggen er ganske komplisert og heterogene lipid peroxide innhold kan bare delvis gjenspeile HDLox46. HDL struktur og kontinuerlig endringer i vivo og måling av HDL funksjon på en timepoint gjenspeiler ikke effekten av HDL dysfunksjon i slutten organ sykdom over tid59. Det er ikke kjent om HDLox avlesning skal normaliseres HDL-C eller HDL protein 22. Fremtidige kliniske studier skal validere betydningen av avlesning av analysen (HDL lipid peroxide innhold per mg av HDL-C).

Avslutningsvis er fluorochrome HDL funksjonen analysen en pålitelig metode for fastsettelse av HDL lipid peroxide innholdet per bestemt mengde HDL (HDLox). Høyere verdier for HDLox er forbundet med redusert HDL antioksidant funksjon. Presentasjon av denne analysen er forbundet med validert celle-baserte analyser, surrogat tiltak av hjerte-og karsykdommer, systemisk betennelse, immun dysfunction og tilknyttete risikoen for hjerte- og metabolske fenotyper 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. denne metoden tilbyr et praktisk, men likevel robust verktøy for å undersøke rollen av HDL-funksjonen i menneskelig sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Denne protokollen og analysen er relevante for den patent PCT/US2015/018147.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner takknemlig arbeidet til Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman og Srinivasa rødlig for sin viktige rolle i utviklingen av tidligere gjentakelser av denne modellen. T.A.A. støttes av en RMIT University-Visekanslers postdoktorstipend. AJ og AH støttes av NHMRC prosjekt stipend 1108792. TK støttes av NIH gir NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

Immunologi problemet 128 HDL-funksjonen oksidert HDL lipid peroxidation celle-fri analysen fluorometric metoden Amplex rød
Cell-free biokjemiske Fluorometric enzymatisk analysen for høy gjennomstrømming-måling av Lipid Peroxidation in høy tetthet Lipoprotein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter