Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

MicroRNA आधारित तरल बायोप्सी: फेफड़ों के कैंसर स्क्रीनिंग के लिए प्लाज्मा miRNA हस्ताक्षर वर्गीकारक (एमएससी) का अनुभव

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56326
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम जल्दी फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए परिसंचारी microRNA हस्ताक्षर वर्गीकारक परीक्षण करने के लिए हल्के स्क्रीनिंग परीक्षण में अपनाया विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

इस तरह के तरल बायोप्सी के रूप में एक न्यूनतम इनवेसिव परीक्षण, के विकास, अपने नैदानिक चरण में जल्दी फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए इस घातक बीमारी के परिणाम में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है । MicroRNAs (miRNAs) ऊतक विशिष्ट, छोटे, गैर कोडिंग जीन अभिव्यक्ति है, जो जैविक RNAs ट्यूमर और उसके आसपास के microenvironment के बीच बात से व्युत्पंन के संकेतों के extracellular दूतों के रूप में कार्य कर सकते है विनियमन कर रहे हैं । वे इस प्रकार फेफड़ों के कैंसर का जल्दी पता लगाने के लिए आदर्श उंमीदवारों का प्रतिनिधित्व कर सकता है । इस काम में, एक परिचालित miRNA परीक्षण के भावी सत्यापन के लिए एक methodological कार्यप्रवाह कस्टम मेड microfluidic कार्ड और मात्रात्मक वास्तविक समय में एक फेफड़ों के कैंसर स्क्रीनिंग परीक्षण में दाखिला स्वयंसेवकों के प्लाज्मा नमूनों में पीसीआर का उपयोग प्रस्तावित है । इसके अलावा, hemolysis के रिलीज के बाद से संबंधित miRNAs और अधिक सामांय तकनीकी मुद्दों विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं, गुणवत्ता नियंत्रण कदम मानक संचालन प्रक्रियाओं में शामिल भी प्रस्तुत कर रहे हैं । प्रोटोकॉल प्रतिलिपि है और विश्वसनीय मात्रात्मक परिणाम देता है; हालांकि, जब बड़े नैदानिक श्रृंखला का उपयोग कर, दोनों पूर्व विश्लेषणात्मक और विश्लेषणात्मक सुविधाओं सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

Introduction

फेफड़ों के कैंसर दुनिया भर में सबसे अधिक निदान कैंसर है, सभी कैंसर के बारे में 25% के लिए लेखांकन निदान1। पिछले 2 दशकों में फेफड़ों के कैंसर मृत्यु दर में लगातार कमी के बावजूद, मुख्य रूप से कम तंबाकू के उपयोग की वजह से, फेफड़ों के कैंसर दोनों पुरुषों और महिलाओं में कैंसर की मौत का प्रमुख कारण बना हुआ है । २०१७ में, यह लगभग 25% और संयुक्त राज्य अमेरिका और यूरोप में कुल कैंसर मौतों का 20% के लिए खाते की भविष्यवाणी की है, क्रमशः1,2।

के बाद से लक्षण आमतौर पर प्रारंभिक रोग में नहीं होते हैं, फेफड़ों के कैंसर के बहुमत के देर से चरणों में निदान कर रहे हैं । यह उपचारात्मक हस्तक्षेप और उपचार के गरीब प्रभावकारिता के लिए एक सीमित संभावना की ओर जाता है3. इसलिए, कई वैज्ञानिक प्रयासों को जल्दी फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए एक प्रभावी परीक्षण की पहचान के उद्देश्य से कर रहे हैं ।

स्क्रीनिंग परीक्षणों की एक किस्म से पता चलता है कि छाती रेडियोग्राफी फेफड़ों के कैंसर स्क्रीनिंग में कोई मूल्य नहीं है, जबकि कम खुराक गणना टोमोग्राफी (LDCT) रेडियोग्राफी की तुलना में जल्दी चरण फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए एक बेहतर उपकरण है4। इसके अलावा, यह वर्तमान और पूर्व भारी धूंरपान करने वालों के बीच 20% तक LDCT कम फेफड़ों के कैंसर मृत्यु दर के उपयोग के साथ thatscreening दिखाया गया है5। इन आंकड़ों को एक उच्च जोखिम जनसंख्या में फेफड़ों के कैंसर स्क्रीनिंग के उपयोग के रूप में कई पेशेवर समाज4,6द्वारा दिशा निर्देशों में परिभाषित समर्थन करते हैं ।

नोट की, LDCT स्क्रीनिंग के बारे में प्रमुख चिंताओं के बीच, वहां झूठी सकारात्मक परिणाम और अधिक निदान के उच्च दर है । ऐसा होने के नाते वैज्ञानिक समुदाय इन मुद्दों पर काबू पाने और LDCT स्क्रीनिंग टेस्ट की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए रणनीति तलाश रहा है । गैर इनवेसिव पूरक के विकास के मार्क्स यहां उपयोगी हो सकता है । तिथि करने के लिए, जांच के तहत उंमीदवार के एक व्यापक सूची है, ऐसे miRNAs के रूप में, सेल मुक्त डीएनए, जीन मिथाइल, छोटे प्रोटीन, और अंय7।

रक्त आधारित, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया वाले मार्क्स और परिसंचारी miRNAs सहित, उन है कि और अधिक उंनत मांयता चरण8तक पहुंचने । प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया-मार्क्स ज्ञान पर आधारित है कि दोनों intracellular और सतह ट्यूमर प्रतिजनों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में निर्मित कर रहे है9। मसलन, Ajona एट अल. C4d, शास्त्रीय पूरक मार्ग के एक ह्रास उत्पाद की भूमिका का मूल्यांकन, निदान और फेफड़ों के कैंसर का पूर्वानुमान10में । अंयथा, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी सीरम परीक्षण की जांच सात ट्यूमर से संबंधित एंटीजन गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में मांय किया गया है और संवेदनशीलता का ३६% और विशिष्टता के ९१% दिखाया11। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया-मार्क्स दिलचस्प हैं, लेकिन आगे मांयता अध्ययन एक संभावित नैदानिक आवेदन के लिए आवश्यक हैं ।

miRNAs अंतर्जात छोटे गैर एक संरक्षित तंत्र के साथ RNAs कोडिंग कर रहे है और सभी पशु और संयंत्र राज्यों में बड़े कार्यात्मक महत्व । miRNAs की भूमिका के लिए प्रोटीन अनुवाद को विनियमित है: वे लक्ष्य जीन12का एक बड़ा सेट की अभिव्यक्ति का दमन । यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि परिवर्तन ' ofmiRNAs अभिव्यक्ति सबसे मानव कैंसर12,13,14के रोगजनन में योगदान । इसके अलावा, दोनों ट्यूमर और stromal कोशिकाओं miRNAs जारी, microvesicles में अपने निगमन द्वारा या आरएनए-बंधन प्रोटीन के लिए संघ के माध्यम से स्थिर, प्लाज्मा और सीरम के रूप में शरीर के तरल पदार्थ में15,16, मूत्र17 , और लार18. परिसंचारी miRNAs इस प्रकार मेजबान प्रतिक्रिया और ट्यूमर और उसके microenvironment19के बीच गतिशील बातचीत को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । एक साथ लिया इन टिप्पणियों मानव कैंसर का पता लगाने के लिए miRNAs के एक होनहार वर्ग के परिसंचारी बना दिया है ।

परिसंचारी miRNAs विभिन्न तरीकों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है: microarray प्लेटफार्मों20, मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (RT-qPCR)21, और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS)14,22. aforementioned प्रौद्योगिकियों के आधार पर विभिंन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल अध्ययन पिछले वर्षों में विकसित किया गया है । Microarray एक उच्च प्रवाह प्रौद्योगिकी, miRNAs के एक एकल परख में हजारों तक का विश्लेषण करने में सक्षम है । हालांकि, यह कम गतिशील रेंज और RT-qPCR या NGS की तुलना में विशिष्टता है । इसके अलावा, microarray एक गैर मात्रात्मक विधि है, इसलिए आगे प्रयोगात्मक सत्यापन की आवश्यकता है । अनुक्रम-आधारित विधियों अज्ञात miRNAs की पहचान की अनुमति दें सकते हैं और विशेष रूप से एक खोज चरण में उपयुक्त हैं । दूसरी ओर, NGS तरीके अभी भी महंगे है और जरूरत विशेष उपकरण और विशेषज्ञ bioinformaticians, इस प्रकार बड़े सत्यापन साथियों में और नैदानिक सेटिंग्स23में उनके उपयोग को सीमित । फिलहाल, RT-qPCR एक नैदानिक/नैदानिक संदर्भ24में miRNA डिटेक्शन को प्रसारित करने के लिए सबसे अधिक अपनाया गया प्लेटफ़ॉर्म है । miRNAs विश्लेषण के लिए विभिन्न RT-qPCR तकनीकें उपलब्ध हैं, लेकिन TaqMan पीसीआर के बाद स्टेम-लूप आरटी का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला25है । यह तकनीक अत्यंत संवेदनशील और सटीक है (एकल न्यूक्लियोटाइड भेदभाव) और एक उच्च गतिशील रेंज है; हालांकि, यह केवल ज्ञात miRNAs का पता लगाने की अनुमति देता है ।

Mestdagh एट अल द्वारा microRNA गुणवत्ता नियंत्रण अध्ययन (miRQC अध्ययन) बड़े पैमाने पर तीन पूर्वोक्त प्रौद्योगिकियों के आधार पर miRNAs रूपरेखा के लिए कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटफार्मों की विशेषताओं की जांच की26। १९६ miRNAs के ऊतकों और सीरम नमूनों में विश्लेषण करके, विभिन्न प्लेटफार्मों के प्रदर्शन reproducibility के संदर्भ में मूल्यांकन किया गया था, संवेदनशीलता, सटीकता, विशिष्टता, और अंतर अभिव्यक्ति की सामंजस्य. परिणामों से पता चला है कि NGS और microarray प्रौद्योगिकियों पर आधारित प्लेटफार्मों एक उच्च reproducibility और विशिष्टता था, लेकिन RT-qPCR प्लेटफार्मों अधिक सटीक थे, संवेदनशील, और एक उच्च पता लगाने की दर थी, विशेष रूप से कम इनपुट आरएनए नमूनों के लिए, जैसे शरीर तरल. इस प्रकार RT-qPCR दिनचर्या नैदानिक निदान में एक संभावित आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त विधि होने लगता है ।

२०११ में, Sozzi एट अल. एक पहली LDCT screeningtrial (INT-िीईओ परीक्षण) में नामांकित स्वयंसेवकों से एकत्र प्लाज्मा नमूनों की miRNA प्रोफ़ाइल का विश्लेषण किया गया27 और चार miRNA 24 परिसंचारी के बीच पारस्परिक अनुपात द्वारा रचित हस्ताक्षर miRNAs उत्पन्न हो गई । ये हस्ताक्षर समय पर या LDCT रोग का पता लगाने से पहले 2 साल तक किसी भी या घातक फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों से भेदभाव रोग मुक्त व्यक्तियों के लिए कर रहे थे28. एक और कागज में, एक ही समूह के लिए पहली बार वर्णित miRNA हस्ताक्षर वर्गीकारक (एमएससी), चार miRNA हस्ताक्षर के संयोजन के क्रम में जोखिम के तीन स्तरों में रोगियों stratify: उच्च, मध्यवर्ती, और कम द्वारा प्राप्त की । अपनी नैदानिक उपयोगिता से अधिक १,००० व्यक्तियों के हल्के स्क्रीनिंग परीक्षण, एक यादृच्छिक एक अवलोकन के हाथ के साथ वार्षिक या द्विवार्षिक LDCT हथियारों की तुलना में अध्ययन में दाखिला के एक बड़े पूर्वव्यापी सेट में मांय किया गया29। दरअसल, एमएससी और LDCT के संयोजन LDCT झूठी पॉजिटिव दर लगभग 5 गुना और तीन एमएससी जोखिम समूहों द्वारा कम किया गयासमग्र अस्तित्व के साथ जुड़े ।

बाद में, २०१३ में "Fondazione IRCCS Istituto Nazionale देई Tumori पर" (मिलान, यह) एक भावी स्क्रीनिंग परीक्षण (हल्के) प्लाज्मा आधारित एमएससी के साथ LDCT को लागू करने का शुभारंभ किया गया था । स्वयंसेवकों LDCT और रक्त निकासी कि तुरंत miRNA कस्टम मेड microfluidic कार्ड का उपयोग करने के लिए प्लाज्मा अलग करने के लिए संसाधित है से गुजरना । LDCT और एमएससी परिणाम का संयोजन विशिष्ट स्क्रीनिंग एल्गोरिथ्म24निर्धारित करता है ।

वर्तमान काम में, पूरे methodological प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है में हल्के परीक्षण, रक्त नमूना संग्रह से शुरू, प्लाज्मा अलगाव, आरएनए निष्कर्षण, और के लिए 24 miRNAs अभिव्यक्ति की रूपरेखा का उपयोग कर कस्टम RT-qPCR microfluidic कार्ड । उच्च संगति और reproducibility को देखते हुए इन प्रक्रियाओं का उपयोग अन्य रोगों में miRNA-आधारित तरल बायोप्सी के विकास के लिए भी किया जा सकता है ।

Protocol

< p class = "jove_content" > हमारी संस्था की रिसर्च एथिक्स कमेटी द्वारा प्रोटोकॉल को मंजूरी दी गई ।

< p class = "jove_title" > 1. प्लाज्मा नमूना संग्रह

  1. Vacutainer ट्यूबों में पूरे रक्त के नमूने के 10 मिलीलीटर स्प्रे-लेपित K 2 EDTA और कमरे के तापमान पर स्टोर के साथ इकट्ठा ।
    नोट: hemolysis को कम करने के लिए, 2 एच के भीतर अलग प्लाज्मा । कम तापमान पर पूरे खून को स्टोर न करें ( यानी , 4 & #176; C) थर्मल शॉक और कोशिका lysis से बचने के लिए जो एक विशिष्ट miRNA रिलीज के लिए सीसा ।
    2. 1 घंटे के भीतर
  2. , एक पहले केंद्रापसारक कदम द्वारा प्लाज्मा अलग १,२५८ x g पर और 4 & #176; C 10 min.
    3. के लिए
  3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्लाज्मा supernatant हस्तांतरण, ध्यान से लिम्फोसाईटिक अंगूठी के साथ संपर्क से परहेज ।
  4. १,२५८ x g पर एक दूसरी बार प्लाज्मा केंद्रापसारक और 4 & #176; C 10 min.
    5. के लिए
  5. Aliquot १.५ मिलीलीटर cryovials में प्लाज्मा की 1 मिलीलीटर, ट्यूब के आधार पर प्लाज्मा अंश इकट्ठा करने से परहेज ।
  6. Store सभी द aliquots at & #8722; ८० & #176; C, hemolysis के मूल्यांकन के लिए एक को छोड़कर । आणविक विश्लेषण 5 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 2. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप द्वारा Hemolysis का मूल्यांकन

  1. तुरंत प्लाज्मा जुदाई कदम के बाद, cuvette के लिए एक spectrophotometry में, ( उदा , १०० & #181 में प्लाज्मा नमूने के 1:10 कमजोर पड़ने, ९०० & #181; l of 1x पंजाब) और मिश्रण करने के लिए यह homogenize.
    नोट: प्लाज्मा नमूना स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप से पहले जमे हुए नहीं होना चाहिए, के रूप में (और विशेष रूप से lipemic नमूनों में) नमूना की फ्रीज गल, flocculates कि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप फार्म सकता है.
  2. ३७५ एनएम, ४१४ एनएम, ५४१ एनएम, और ५७६ एनएम का उपयोग कर एक यूवी की तुलना spectrophotometer, एक आधारभूत सुधार ७५० एनएम और 10 मिमी की एक पथ की लंबाई पर बसे के साथ में अवशोषक पढ़ें । 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर एक खाली माप निष्पादित करें.
  3. ४१४ एनएम और ३७५ एनएम पर अवशोषक के बीच अनुपात की गणना; १.४ से अधिक है, तो नमूना hemolyzed पर विचार करें और ( तालिका 1 में QC1) रक्त आहरण को दोहराएँ ।
< p class = "jove_title" > 3. प्लाज्मा कुल आरएनए निष्कर्षण

  1. तैयार एक 1-Thioglycerol/Homogenization (OMG) हल के साथ 20 & #181; L के 1-Thioglycerol प्रति मिलीलीटर की Homogenization समाधान. चूंकि 1-Thioglycerol चिपचिपा है, ध्यान से सटीक माप के लिए पिपेट । बर्फ पर या 2-10 & #176 पर OMG समाधान ठंडा यह प्रयोग करने से पहले ।
    नोट: कार्य समाधान 1 माह के लिए 2-10 & #176; C पर स्थिर है.
  2. को सस्पेंड कर lyophilized DNase मैं जोड़कर २७५ & #181; nuclease के एल-शीशी में मुक्त पानी और धीरे से मिश्रण (भंवर नहीं है) । एक दृश्य सहायता के रूप में, 5 & #181 जोड़ने के लिए, का पुनर्गठन DNase मैं और एकल उपयोग aliquots में nuclease मुक्त ट्यूबों में समाधान वितरण के लिए नीले रंग के एल । टोर पुनर्गठन DNase I पर-30 & #176; ग से-10 & #176; ग.
  3. से शुरू २०० & #181; प्लाज्मा के एल, जोड़ें २०० & #181; l ठंडा OMG समाधान के.
  4. भंवर 15-30 एस एक पूर्ण homogenization सुनिश्चित करने के लिए । यदि झाग होता है, तो नमूना बर्फ पर बसा दो.
  5. Add २०० & #181; Lysis बफर और 25 & #181 के l ल; Proteinase K के homogenized नमूना और भंवर के लिए 20 s.
    6. के लिए l
  6. एक thermomixer में 15 मिनट के लिए नमूनों की मशीन ३७ & #176; C.
  7. साधन की डेक ट्रे पर प्रत्येक नमूने के लिए एक कारतूस लोड और उचित स्थिति में plugging जगह है ।
  8. उपकरण कारतूस में उपयुक्त स्थिति के लिए lysate हस्तांतरण ।
  9. Add 5 & #181; L के DNase मैं कारतूस में उचित स्थिति का समाधान ।
  10. Add ६० & #181; nuclease के L येक रेफरेंस ट्यूब के आधार पर नि: शुल्क जल.
  11. Select & #34; RSC miRNA टिशू & #34; विधि और स्वचालित शुद्धिकरण भागो शुरू । कुल आरएनए नमूनों को & #8722 पर संग्रहित किया जा सकता है; ८० & #176; C.
< p class = "jove_title" > 4. Taq-rt

  1. miRNAs सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट के साथ Taq करने के लिए आरएनए परिवर्तित करने के लिए ब्याज की MicroRNA के साथ Taq आरटी प्राइमर पूल का उपयोग करें ।
  2. तैयार 12 & #181; भ रिएक्शन मिक्स ऑफ आरटी एक १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब में बर्फ पर किट निर्देश के अनुसार, कस्टम Taq आरटी प्राइमरी पूल के 6 & #181; एल का उपयोग करना ।
  3. Add 3 & #181; कुल आरएनए के 15 & #181 की अंतिम मात्रा के लिए l l और 5 min.
    4. के लिए बर्फ में मशीन
  4. के रूप में कॉन्फ़िगर किया गया एक थर्मामीटर-साइकिल चालक पर भ प्रतिक्रिया लोड: 16 & #176; ग 30 मिनट के लिए ४२ & #176; ग के लिए 30 मिनट, ८५ & #176; ग के लिए 5 मिनट, और 4 & #176 पर पकड़; c.
    नोट: सीडीएनए पर स्टोर किया जा सकता है-15 से-20 & #176; C से कम एक सप्ताह के लिए ।
< p class = "jove_title" > 5. पूर्व वर्धन

  1. mix २.५ & #181; l के साथ प्रत्येक आरटी उत्पाद के १२.५ & #181; l के Taq मास्टर मिक्स 2x, ३.७५ & #181; l कस्टम Taq पूल, और ६.२५ & #181; l nuclease-फ्री पानी, कुल मात्रा के लिए 25 & #181; l.
  2. निंनलिखित थर्मल प्रोफ़ाइल के अनुसार एक थर्मामीटरों-साइकिल चालक का उपयोग कर पूर्व प्रवर्धन प्रतिक्रिया प्रदर्शन: ९५ & #176; ग के लिए 10 मिन, ५५ & #176; ग के लिए 2 मिनट, ७२ & #176; ग के लिए 2 मिनट, ९५ & #176 के 12 चक्र के लिए सी, 15 एस के लिए सी, और ६० & #176; ग के लिए 4 मिनट , तो ९९.९ पर पकड़ & #176; ग के लिए 10 मिनट और पर 4 & #176; ग.
  3. को जोड़कर उत्पाद को पतला १७५ & #181; L के 0.1 x ते, pH ८.०.
    नोट: पतला उत्पाद पर स्टोर किया जा सकता है-15 से-20 & #176; C के लिए कम से एक सप्ताह.
< p class = "jove_title" > 6. RT-कस्टम Taq सरणी MicroRNA कार्ड पर qPCR प्रतिक्रिया

  1. 24 विशिष्ट microfluidicCustom के प्लाज्मा स्तर को मापने के लिए ३८४-अच्छी तरह से Taq MicroRNA सरणी miRNAs कार्ड का उपयोग करें (डुप्लिकेट में देखा) एक साथ 8 नमूनों पर. 24 miRNAs के लिए MiRBase ID (v21) हैं: त्यही-मीर-१०१-3p, त्यही-मीर-106a-5p, त्यही-मीर-१२६-3p, त्यही-मीर-133a-3p, त्यही-मीर-१४०-3p, अजूनही-मीर-१४०-5p, अजूनही-मीर-१४२-3p, अजूनही-मीर-१४५-5p, अजूनही-मीर-148b-3p, अजूनही-मीर-15b-5p, अजूनही-मीर-१६-5p, अजूनही-मीर-१७-5p, अजूनही-मीर-१९७-3p, अजूनही-मीर-19b-3p, अजूनही-मीर-२१-5p, अजूनही-मीर-२२१-3p, अजूनही-मीर-२८-3p, अजूनही-मीर-30b-5p, अजूनही-मीर-30c-5p, अजूनही-मीर-320a, अजूनही-मीर-451a, अजूनही-मीर-486-5p, अजूनही-मीर-660-5p, आणि अजूनही-मीर-92a-3p.
  2. mix १.१३ & #181; l के साथ पतला PreAmp के नमूने के ५६.२५ & #181; l के 2x Taq यूनिवर्सल मास्टर मिक्स और ५५.६९ & #181; l के nuclease-नि: शुल्क पानी में एक ०.५ मिलीलीटर ट्यूब.
  3. कस्टम Taq सरणी MicroRNA कार्ड पर 8 पीसीआर रिएक्शन मिक्स करने के लिए लोड.
  4. केंद्रापसारक पर ३११ x जी के लिए 2 min.
  5. सरणी कार्ड मुहर के साथ कस्टम कार्ड सील ।
  6. एक रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम का उपयोग करके रीयल-टाइम रिएक्शन चलाते हैं, जिसके बाद साइकलिंग पैरामीटर संशोधित किया जाता है: ९४.५ & #176; c 10 मिनट के लिए, ९७ & #176 के ४० चक्र के लिए c 30 s के लिए, और ५९.७ & #176; c के लिए ६० s.
< p class = "jove_title" > 7. डेटा एक्सट्रपलेशन और अनुपात जनरेशन

  1. कच्चे सीटी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, एक स्वचालित आधार रेखा की स्थापना के लिए पृष्ठभूमि संकेतों को हटाने और सभी परख और नमूनों के लिए ०.१५ की एक निश्चित दहलीज । गरीब प्रवर्धन घटता है और/या गरीब निष्क्रिय संदर्भ संकेतों के साथ धब्बे निकालें ।
  2. निर्यात कच्चे सीटी मूल्यों में & #34;. xls & #34; स्वरूप और आगे विश्लेषण के लिए दो डुप्लिकेट का सीटी माध्य मान का उपयोग करें ।
  3. सहसंबंधी miRNAs & #39; अभिव्यक्ति स्तर नैदानिक अध्ययन नमूनों पर ऐतिहासिक मापन के लिए ( टेबल २ ). यदि प्रत् येक कस् टम पर नमूनों की कम से ५०% microfluidic कार्ड का परिणाम एक पियरसन & #39; s सहसंबंध & #60; ९७.५, दोहराएं कार्ड ( Table 1 में QC2) ।
  4. गणना & #8722; & #916; miRNA अनुपात के log2 मूल्यों के समतुल्य सभी miRNAs के बीच सीटीएस ।
< p class = "jove_title" > 8. संबंधित miRNA हस्ताक्षर द्वारा Hemolysis का मूल्यांकन

  1. कम भंडारण प्लाज्मा नमूनों के लिए संबंधित कट-नापसंद (Hemolysis मूल्यों) के साथ निम्नलिखित miRNA अनुपात का उपयोग miRNA-संबंधित log2 हस्ताक्षर उत्पन्न (1-5 सप्ताह में & #8722; ८० & #176; ग): मीर-126/451 & #60; & #8722; ०.०७, 15b/451 & #60; & #8722; ३.६७, 221/451 & #60; & #8722; ३.१८, 30b/451 & #60; & #8722; १.१, 126/486-5p & #60; & #8722; ०.३३, 15b/486-5p & #60; & #8722; ३.८६, 221/486-5 p & #60; & #8722; ३.१७, 30b/486-5p & #60; & #8722; १.४२, 126/92a & #60; १.८, 15b/92a & #60; & #8722; १.८, 221/92a & #60; & #8722; १.०४, 30b/92a & #60; ०.८७, 126/16 & #60; & #8722; २.८५, 15b/16 & #60; & #8722; ६.३३, 221/16 & #60; & #8722; ५.९, 30b/16 & #60; & #8722; ३.६८.
  2. hemolyzed नमूनों के रूप में वर्गीकृत जहां अनुपात के कम से ५०% (16 से बाहर 8) से अधिक संबंधित कट-ऑफ (QC3 में तालिका 1 ) ।
< p class = "jove_title" > 9. जोखिम के स्तर की परिभाषा: उच्च, मध्यवर्ती, और कम

  1. में एमएससी की रचना miRNA अनुपात के चार हस्ताक्षर परिभाषित करें < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 3 : रोग का जोखिम (आरडी), आक्रामक रोग का खतरा (रेड), की उपस्थिति रोग (पीडी), और आक्रामक रोग (पैड) की उपस्थिति.
    2. प्रत्येक हस्ताक्षर के लिए
  2. , कम भंडारण प्लाज्मा नमूनों के लिए संबंधित कट ऑफ मूल्य से अधिक अनुपात को परिभाषित (1-5 सप्ताह में & #8722; ८० & #176; ग). सकारात्मक माने जाने की जरूरत से अधिक अनुपात की संख्या आरडी और पीडी के लिए 27 में से 9 है, और राड और पैड के लिए 28 में से 14 (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 एक ).
  3. प्रत्येक नमूने के लिए संबंधित एमएससी जोखिम स्तर निम्नानुसार विशेषता: कम जोखिम अगर rd नेग & #8745; पीडी नेग & #8745; रड नेग & #8745; PAD नेग ; मध्यवर्ती रिस्क अगर rd pos & #8746;PD pos & #8745; रड नेग & #8745; PAD नेग ; या हाई रिस्क अगर रड एसेसरीज & #8746; PAD pos (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > फिगर ३ बी ).

Representative Results

हल्के परीक्षण एक संयुक्त LDCT की दक्षता परीक्षण के प्रयोजन के साथ फेफड़ों के कैंसर के जल्दी पता लगाने के लिए एक संभावित अध्ययन है-पहली लाइन स्क्रीनिंग परीक्षण के रूप में भारी धूंरपान करने वाले व्यक्तियों के एक बड़े पलटन में एमएससी दृष्टिकोण । जोखिम के एक वर्ग miRNA परीक्षण के आधार पर प्रत्येक स्वयंसेवक के लिए जिंमेदार ठहराया है, जो 24 miRNAs घूम प्लाज्मा के बीच अनुपात का मूल्यांकन करता है । के रूप में काफी हद तक30रिपोर्ट,31,३२, hemolysis परिसंचारी miRNA के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, के बाद से गलत परिणाम रक्त कोशिकाओं द्वारा miRNAs की एक गैर विशिष्ट जारी करने के लिए कारण प्राप्त किया जा सकता है । प्रस्तावित methodological कार्यप्रवाह में, एक पूर्व-विश्लेषणात्मक गुणवत्ता नियंत्रण चरण ( तालिका 1में QC1) hemolyzed की पहचान करने के लिए, और इस प्रकार गैर-विश्लेषण योग्य, प्लाज्मा नमूनों का वर्णन किया गया था । चित्रा 1 रिपोर्ट hemolyzed के एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण (चित्रा 1ए) और गैर hemolyzed (चित्रा 1बी) संबंधित A414 के साथ प्लाज्मा नमूने/A375 मूल्यों । एक नैदानिक संदर्भ में एक आणविक परीक्षण का परिणाम थे स्वयंसेवक प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण है, इस QC1 रक्त नमूना दोहरा और, ज्यादातर मामलों में, नमूना बहाल करने की अनुमति देता है ।

आण्विक संसाधन के बाद, RT-qPCR प्रदर्शन सही रूप से किसी भी तकनीकी समस्याओं की पहचान करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए । चित्र 2 किसी खराब पेसिव संदर्भ संकेत के कारण कम प्रदर्शन के साथ a RT-qPCR दिखाता है । इस मामले में एक नया microfluidic कार्ड के लिए पूर्व प्रवर्धन उत्पाद पुनः लोड करने की सिफारिश की है । जब RT-qPCR, आरेख 2Bके रूप में अच्छा प्रदर्शन करता है, तो कार्ड पहली पोस्ट विश्लेषणात्मक गुणवत्ता नियंत्रण चरण के लिए आगे बढ़ता है, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि miRNA व्यंजक मान ऐतिहासिक मापन के साथ तुलनीय हैं ( तालिका 1में QC2). यदि QC2 कदम विफल रहता है, एक तकनीकी समस्या रिवर्स प्रतिलेखन के दौरान या पूर्व प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं में हुई है हो सकता है, और यह पूरी आणविक रिवर्स प्रतिलेखन से शुरू प्रसंस्करण दोहराने के लिए सुविधाजनक है ।

अंतिम गुणवत्ता नियंत्रण चरण ( तालिका 1में QC3) hemolysis को भी आणविक स्तर पर मूल्यांकित करता है. 4 एरिथ्रोसाइट के अभिव्यक्ति स्तर-विशिष्ट miRNAs (मीर-16, मीर-४५१, मीर-486-5p, और मीर-92a) 4 गैर hemolysis संबंधित miRNAs के उन लोगों की तुलना में थे (मीर-१२६, मीर-15b, मीर-२२१, और मीर-30b), hemolysis-संबंधित miRNA द्वारा रचित हस्ताक्षर पैदा 16 (4 x 4) miRNA अनुपात । सकारात्मक नमूनों hemolyzed के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं, जबकि नकारात्मक नमूने अंतिम एमएससी जोखिम स्तर वर्गीकरण के लिए आगे बढ़ना प्रोटोकॉल धारा 9 और चित्रा 3में वर्णित के रूप में ।

Figure 1
चित्र 1: ताजा प्लाज्मा नमूनों का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण । (A) 2 hemolyzed और (B) 2 गैर-hemolyzed प्लाज्मा नमूनों की स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्रोफाइल, तरंग दैर्ध्य A414 और A375 के बीच अवशोषण अनुपात को मापने. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : microfluidic कार्ड विश्लेषण में RT-qPCR प्रदर्शन. प्रवर्धन और multicomponent भूखंडों की तुलना (एक) गरीब और (ख) अच्छी गुणवत्ता microfluidic कार्ड । प्रत्येक पैनल में सभी 24 miRNAs और एक सिंगल उदाहरण miRNA की रिपोर्ट दी गई है । multicomponent प्लॉट्स इन RT-qPCR प्रतिक्रियाओं में होने वाले पेसिव संदर्भ संकेतों को दर्शाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: MSC एल्गोरिथ्म for जोखिम स्तरीकरण. प्रतिनिधि स्वयंसेवकों से 6 प्लाज्मा नमूने पर विचार करने के लिए हल्के स्क्रीनिंग परीक्षण में दाखिल हुए परिणाम । (क) रोग के जोखिम के miRNA-अनुपात ' हस्ताक्षर (आरडी), आक्रामक रोग (रेड), रोग (पीडी) की उपस्थिति, आक्रामक रोग (पैड) की उपस्थिति, और प्लाज्मा नमूनों के लिए इसी कट-ऑफ मूल्यों (log2) पर संग्रहित-८० डिग्री सेल्सियस पर के लिए जोखिम सबसे कम 1 सप्ताह और 5 सप्ताह तक । (B) उच्च (H), मध्यवर्ती (I), और निंन (L) एमएससी जोखिम स्तर में विश्लेषणीय नमूनों को stratify करने के लिए चार हस्ताक्षरों का संयोजन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

नुकसान और Methodological कार्यप्रवाह की चुनौतियां
के रूप में हल्के पहले संभावित अध्ययन एक नैदानिक उपकरण के रूप में परिसंचारी miRNAs विश्लेषण है, थ्रेसहोल्ड और कटौती डेटा के लिए उपयोग नापसंद-विश्लेषण पूर्वव्यापी श्रृंखला से उत्पंन किया गया । आदेश में प्लाज्मा नमूनों की अलग भंडारण अंतराल के मुद्दे को दूर करने के लिए, मानकों संभवतः एमएससी प्रदर्शन की वृद्धि प्राप्त करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है । फिर भी, miRNAs विश्लेषण शुरू करने से पहले, समग्र प्रक्रिया के कई पहलुओं को सावधानीपूर्वक मूल्यांकित करने की आवश्यकता होती है, जैसे समावेशन मानदंड, नमूना संग्रह और प्रसंस्करण, और डेटा विश्लेषण के लिए bioinformatics एल्गोरिथ्म को अपनाया जाता है. निम्नलिखित अनुभाग वर्तमान समाचार पत्र में वर्णित कार्यप्रवाह के सबसे महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान केंद्रित करेंगे, प्रत्येक एकल चरण के प्रमुख मुद्दों को संबोधित करते हुए और फिर उन्हें दूर करने के लिए रणनीतियों का प्रस्ताव कर रहे हैं ।

अध्ययन जनसंख्या
इस-हल्के स्क्रीनिंग परीक्षण के लिए नामांकन मानदंड हैं: 50-75 साल की उंर, भारी वर्तमान या पूर्व (10 वर्ष से कम) धूंरपान करने वालों के साथ कम से 30 पैक-साल और कैंसर के कोई पूर्व इतिहास के भीतर 5 साल । इस जनसंख्या में, अनुमानित फेफड़ों के कैंसर के प्रसार और प्रति वर्ष घटना के बारे में 1% और ०.७%, क्रमशः थे । प्रस्तावित प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एमएससी की परीक्षा को लागू करने के लिए, जनसंख्या विश्लेषण इसी तरह की विशेषताओं को बनाए रखना चाहिए । विशेष रूप से, QC2 कदम ऊपर वर्णित ऐतिहासिक एक समान जनसंख्या से प्राप्त आंकड़ों के साथ तुलना शामिल है । जबकि ९७.५ नीचे एक सहसंबंध तकनीकी समस्याओं का संकेत हो सकता है, दूसरी ओर, बदल परिचालित miRNA फेफड़ों के कैंसर होने के जोखिम को दर्शाती स्तर के साथ ज्यादातर व्यक्तियों कि दहलीज के नीचे वास्तव में कर रहे हैं । दूसरे शब्दों में, यदि मापदंडों के साथ QC2 कदम यहां की रिपोर्ट फेफड़ों के कैंसर के विकास के उच्च जोखिम पर एक आबादी के लिए लागू किया जाता है, यह स्वीकार्य नमूनों को बाहर कर सकते हैं । नई, उचित संदर्भ पैरामीटर तो परिभाषित किया जाना चाहिए कि प्रत्येक के लिए विशिष्ट है अपेक्षित परिणाम के अनुसार विश्लेषण जनसंख्या ।

रक्त संग्रह और Hemolysis
जैविक नमूनों का संग्रह एक महत्वपूर्ण पूर्व विश्लेषणात्मक कदम है, क्योंकि यह नमूना गुणवत्ता और विशेषताओं ख़राब कर सकते हैं, और इस तरह विश्लेषण के अंतिम परिणाम को संशोधित । रक्त के नमूनों के बारे में, यह ताजा रक्त इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है और जितनी जल्दी हो सके नमूना प्रक्रिया । नमूने न तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और न ही रक्त निकासी के बाद जमे हुए, ठंड और गल मार्ग कोशिका lysis (hemolysis) और आरएनए क्षरण पैदा कर सकता है के बाद से । hemolysis प्रक्रिया को कम करने के लिए, यह रक्त संग्रह31 से 2 एच के भीतर प्लाज्मा अलग करने के लिए सुझाव दिया है ।

Hemolysis काफी हद तक लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) और आसपास के वातावरण में अपनी सामग्री के फलस्वरूप रिलीज के टूटने के कारण है । यह miRNAs परीक्षण परिसंचारी के लिए एक समस्या हो सकती है क्योंकि कोशिकाओं intracellular सामग्री की रिहाई नाटकीय रूप से रक्त में microRNA प्रोफ़ाइल बदल, संभावित प्लाज्मा आधारित विश्लेषण की सटीकता को प्रभावित30.

प्लाज्मा नमूनों में hemolysis की भी न्यूनतम स्तर की पहचान करने में सक्षम होने के नाते miRNAs के रूप में परिसंचारी के रूप में चिह्नित पर आधारित अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । Hemolysis शुरू में दृश्य निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, के बाद से दो केंद्रापसारक कदम प्लाज्मा का रंग पीला से उच्च hemolyzed नमूनों के लिए लाल करने के लिए रेंज कर सकते हैं । तथापि, मात्र दृश्य निरीक्षण पर्याप्त आणविक के संदर्भ में संवेदनशील नहीं हो सकता है, अनुसंधान ।

hemolyzed प्लाज्मा नमूनों की पहचान करने के लिए एक सरल, पूर्व विश्लेषणात्मक विधि तरंग दैर्ध्य (λ) = ४१४ एनएम मुख्य oxyhemoglobin चोटी अवशोषक के, किसी भी अंय स्रोत के लिए उपयुक्त समायोजन के बाद में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप है हस्तक्षेप के । कि कारण के लिए, हम ३७५ एनएम पर अवशोषक मूल्य को ४१४ एनएम चोटी सामान्यीकृत, लिपिड सामग्री का संकेत३३। वैकल्पिक रूप से, या बेहतर, संयोजन में, एक lipemia-independenthemolysis स्कोर (HS)३४का उपयोग किया जा सकता है । यह spectrophotometrically-आधारित प्रक्रिया की पहचान कर सकते है कम से ६.१ मिलीग्राम/डीएल मुक्त हीमोग्लोबिन की । अंयथा, hemolyzed नमूनों एरिथ्रोसाइट-विशिष्ट miRNAs का पता लगाने के माध्यम से पहचाना जा सकता है । के बाद भी hemolysis का एक बहुत कम प्रतिशत एरिथ्रोसाइट में काफी वृद्धि-विशिष्ट miRNA स्तर३२में भाग लेना कर सकते हैं, Fortunato एट अल । 16 hemolysis के आधार पर एक विशिष्ट miRNAs-संबंधित हस्ताक्षर की पहचान की है कि कुशलता से कर सकते है अनुपात ३३प्लाज्मा नमूनों में hemolysis वर्गीकृत । सभी उल्लेख किया परख संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से अवशोषण अनुपात 414/375 और/या एच एस एक पूर्व विश्लेषणात्मक आगे की लागत की बचत चरण में अपनाया जाता है, जबकि hemolysis-संबंधित miRNAs को मापने के बाद एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में विश्लेषणात्मक चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कदम.

परिचालित miRNAs अलगाव और आरएनए शुद्धता
निष्कर्षण आरएनए प्रक्रिया बाद के विश्लेषण की सफलता के लिए एक बहुत ही प्रभावशाली कदम है । ऐसे प्लाज्मा के रूप में एक कम इनपुट नमूना से शुरू, निष्कर्षण miRNAs का एक सटीक ठहराव सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप में कुशल होने की जरूरत है. प्लाज्मा nucleases सहित कई प्रोटीन की उच्च सांद्रता, और अन्य घटकों जो आरटी-qPCR के बहाव एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और परिचालित-miRNAs का पता लगाने को प्रभावित कर सकता है की विशेषता है । कई निष्कर्षण विधियों के अध्ययन के इन प्रकार में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन सामान्य रूप से, जैविक निष्कर्षण सिलिका आधारित आरएनए संवर्धन द्वारा पीछा प्लाज्मा अवरोधकों को हटाने के लिए बेहतर है तो अकेले TRIzol३५की अनुमति देता है. फिर भी, पिछले कुछ वर्षों में, मैनुअल निष्कर्षण स्वचालित निष्कर्षण के द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है । संदूषण के मामूली जोखिम, उच्च reproducibility, और आर्थिक समय का उपयोग स्वचालित प्रणाली के मैनुअल अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में मुख्य लाभ कर रहे हैं । इसके अलावा, स्वचालित निष्कर्षण विधियों रक्त के नमूनों से सबसे अधिक miRNA मात्रा और मैनुअल प्रोटोकॉल की तुलना में उच्चतम दक्षता३६उपज ।

सामान्यीकरण समस्या
प्लाज्मा miRNA के स्तर का सामान्यीकरण अभी भी एक विवादास्पद मुद्दा है. दरअसल, नमूना गुणवत्ता या मात्रा में अंतर miRNAs अभिव्यक्ति उपस्थिति या रोगों के जोखिम की वजह से स्तर में सही परिवर्तन की पहचान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और इस तरह अस्पष्ट डेटा व्याख्याओं और भ्रामक निष्कर्ष के लिए अग्रणी । अब तक आम सहमति के अभाव में विभिन्न सामान्यीकरण रणनीतियाँ३७में हुई है ।

कुल आरएनए प्लाज्मा नमूनों से निकाला आमतौर पर यूवी spectrophotometry या प्रतिदीप्ति आधारित spectrophotometry के रूप में मानक ठहराव तरीकों की दहलीज से नीचे है, इस प्रकार precluding आरएनए जन मानकीकरण३८. नतीजतन, eluted आरएनए की एक निश्चित मात्रा के बजाय एक निश्चित मात्रा आरटी प्रतिक्रिया३९के लिए इनपुट के रूप में चुना जाना चाहिए ।

गृह व्यवस्था टेप ऊतक नमूनों में miRNA विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, RNU48 और RNU6 की तरह, extracellular miRNA माप सामांय के लिए उपयुक्त नहीं हैं, के रूप में वे दोनों हमेशा संचलन में पता लगाने योग्य नहीं हैं, RNase के कारण-मध्यस्थता क्षरण४० और भी एक रोग विशेष तरीके से३७में विनियमित रहे हैं । यह स्पष्ट नहीं है अगर किसी भी परिसंचारी miRNAs प्रभावी रूप से संदर्भ नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मीर-16 अक्सर गृह व्यवस्था के लिए प्रस्तावित है, लेकिन डीप्रथ अध्ययनों से पता चला है कि यह कैंसर रोगियों के प्लाज्मा नमूनों में विनियमित है28,३७। इसके अलावा, मीर-16 का स्तर अत्यधिक hemolysis से प्रभावित है30।

जबकि उच्च प्रवाह के लिए कई miRNAs मापने परख और अर्थ अभिव्यक्ति मूल्य पर सामांय आम तौर पर स्वीकार किए जाते है४१, जब miRNAs की एक सीमित संख्या में विश्लेषण किया जाना चाहिए, इस सामांय दृष्टिकोण लागू नहीं किया जा सकता है । सामान्यता समस्या को बायपास करने के लिए, Boeri एट अल. पहले 24 miRNAs28के बीच पारस्परिक अनुपात के आधार पर एक एल्गोरिथ्म की स्थापना की । इस तरह के एक दृष्टिकोण, नैदानिक उपकरण के विकास के लिए बहुत उपयोगी होने के बावजूद, आसानी से प्रभावी ढंग से बदल miRNAs है कि संभवतः ट्यूमर के विकास में एक भूमिका होने की अनुमति नहीं है, और इस तरह के कार्य औजार के रूप में miRNAs की पहचान । एक और प्रभावी रणनीति, बियांची एट अल के समूह द्वारा अपनाया है कि एक सीरम मीर परीक्षण फेफड़ों के कैंसर के लिए जल्दी पता लगाने के लिए विकसित, 6 "गृह व्यवस्था सीरम-miRNAs" नमूनों के बीच कम बदलती के एक समूह के ज्यामितीय मतलब पर सामान्य पर आधारित था और मरीजों की कक्षाएं४२।

miRNA आधारित तरल बायोप्सी और संभावित आवेदन की विशेषताएं
प्लाज्मा आधारित एमएससी एक आणविक गैर इनवेसिव परीक्षण भारी धूंरपान करने वालों में फेफड़ों के कैंसर के जल्दी निदान के लिए अध्ययन किया है । एमएससी परीक्षण LDCT द्वारा फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने से पहले मध्यवर्ती या उच्च जोखिम वाले विषयों की पहचान कर सकते हैं, उच्च संवेदनशीलता के साथ (एसई, ८७%) और नकारात्मक पूर्वानुमान मूल्य (NPV, ९९%). विशेष रूप से, एमएससी ३.७% करने के लिए झूठी सकारात्मक परिणाम को कम करने से LDCT स्क्रीनिंग को लागू कर सकता है, LDCT अकेले के लिए १९.७% से29। एमएससी परीक्षण भी एक अच्छा शकुन प्रदर्शन किया है दिखाया गया है जब केवल फेफड़ों के कैंसर के रोगियों पर विचार, और एक निगरानी उपकरण के रूप में अकेले या संयोजन में अंय नैदानिक रोग मानकों के साथ प्रयोग किया जा सकता है४३,४४। संभावित, एमएससी परीक्षण फेफड़ों के कैंसर नैदानिक एल्गोरिदम के अधिक से अधिक स्थिरता सक्षम कर सकता है, इस प्रकार स्क्रीनिंग लागत प्रभावशीलता को कम.

एमएससी के अलावा, जल्दी फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए अंय गैर इनवेसिव परीक्षण सूचित किया गया है । बियांची एट अल. एक परिचालित मीर-परीक्षण एक ३४-miRNA हस्ताक्षर४५के आधार पर प्रस्तावित है, तो यह एक 13 miRNA हस्ताक्षर४२के लिए कम है । सीरम नमूने fordiscovery और सत्यापन धूंरपान विषयों (ब्रह्मांड) LDCT स्क्रीनिंग परीक्षण, ऑन्कोलॉजी की यूरोपीय संस्था (िीईओ, मिलान, इटली) में प्रदर्शन के सतत अवलोकन से प्राप्त किया गया । मीर परीक्षण उच्च जोखिम स्वयंसेवकों में फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए ७८% सटीकता दिखाया । 13 सीरम-miRNAs और एमएससी रचना 24 के बीच, केवल 5 miRNAs अतिव्यापी थे (मीर-92a, मीर-30b, मीर-30c, मीर-148a, और मीर-140-5p). यह नमूनों (सीरम बनाम प्लाज्मा) और डेटा विस्तार के लिए शुरू करने के विभिन्न प्रकार के कारण हो सकता है । वास्तव में, मीर-परीक्षण के लिए, लेखकों 6 सीरम में गृह व्यवस्था के रूप में व्यवहार miRNAs का चयन किया, जिनमें से 3 भी एमएससी miRNA अनुपात (मीर-15b, मीर-19b, और मीर-१९७) के बीच शामिल थे । फिर भी, प्लाज्मा में एमएससी और मीर-परीक्षण सीरम के नमूनों में और अधिक गहराई से फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने के लिए miRNA आधारित तरल बायोप्सी के उपयोग को मान्य.

फेफड़ों के कैंसर की पहचान के लिए MiRNAs profiling४६थूक नमूने पर भी प्रदर्शन किया गया है । थूक आसानी से एकत्र किया जा सकता है और miRNA अभिव्यक्ति के स्तर में यह अत्यंत स्थिर होने के लिए दिखाई देते हैं । हालांकि, फेफड़ों के कैंसर जांच स्वयंसेवकों 50-55 साल से अधिक पुराने है और सह के साथ भारी धूंरपान करने वालों ऐसे सीओपीडी के रूप में रुग्णता, इस प्रकार थूक प्राप्त करने के लिए मुश्किल बना रहे हैं । दरअसल, शरीर के विभिंन तरल पदार्थ के बीच, प्लाज्मा miRNAs की संभावित भूमिका की जांच करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प में से एक है के रूप में (लेकिन सीमित नहीं) फेफड़ों के कैंसर के लिए ।

कुल मिलाकर, वर्तमान कागज में वर्णित प्रक्रिया विभिन्न रोगों के संदर्भ में प्रासंगिक हो सकता है, जांच की विकृति के प्रकार में कोई प्रतिबंध के साथ (कैंसर से, तंत्रिका तंत्र और हृदय विकारों, या मधुमेह के लिए) और के प्रयोजन में नैदानिक उपयोग (निदान, रोग का निदान, या उपचार के लिए भी प्रतिक्रिया के लिए एक अगोचर) ।

Disclosures

गैब्रिएला Sozzi, Mattia Boeri, और ूगो Pastorino तीन पेटेंट Gensignia जीवन विज्ञान के लिए लाइसेंस आवेदन के सह अंवेषकों हैं, miRNA हस्ताक्षर के बारे में इस लेख में बताया । शेष सभी लेखकों ने प्रस्तुत किए गए कार्य के संबंध में हितों का कोई टकराव नहीं घोषित किया.

Acknowledgments

लेखकों Paola Suatoni, ऐलेना Bertocchi, कैरोलिना नीनी, Annamaria Calanca, और चियारा Banfi में स्वयंसेवकों हैंडलिंग के लिए परीक्षण और प्रशासनिक सहायता के लिए धंयवाद; और डेटा प्रबंधन के लिए क्लाउडियो Jacomelli और क्लाउडियो Citterio । काम इतालवी कैंसर अनुसंधान के लिए एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था [जांचकर्ता १५९२८ अप करने के लिए, १४३१८ जी एस के लिए अनुदान, और १२१६२ (विशेष कार्यक्रम "कैंसर जोखिम मूल्यांकन और जल्दी निदान के लिए अभिनव उपकरण", 5x1000)]; स्वास्थ्य मंत्रालय के इतालवी [अनुदान सं. RF-२०१०]; नेशनल कैंसर इंस्टिट्यूट (यूएसए) से ग्रांट UO1 CA166905 । एमबी एक Fondazione Pezcoller फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक १२८ फेफड़ों के कैंसर जल्दी पता लगाने घूम microRNAs मार्कर्स तरल बायोप्सी वास्तविक समय पीसीआर ।
MicroRNA आधारित तरल बायोप्सी: फेफड़ों के कैंसर स्क्रीनिंग के लिए प्लाज्मा miRNA हस्ताक्षर वर्गीकारक (एमएससी) का अनुभव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C.,… More

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter