Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

MicroRNA basert flytende biopsi: Opplevelsen av Plasma miRNA signatur klassifiserer (MSC) for Lung Cancer Screening

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56326
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi detaljerte protokollen i BioMILD screening prøve å utføre sirkulerende microRNA signatur klassifiserer test for tidlig lunge kreft deteksjon.

Abstract

Utviklingen av en minimal invasiv test, som flytende biopsi, for tidlig lunge kreft deteksjon i preklinisk fase er avgjørende å forbedre resultatet av denne dødelige sykdommen. MicroRNAs (miRNAs) er vev spesifikke, liten, ikke-koding RNAs regulerer genuttrykk, som kan fungere som ekstracellulære budbringere av biologiske signaler avledet fra kryss-snakk mellom svulsten og dens omkringliggende microenvironment. De kan derfor representere velegnet for tidlig deteksjon av lungekreft. I dette arbeidet foreslås en metodisk arbeidsflyt for potensielle valideringen av en sirkulerende miRNA test med egendefinerte laget microfluidic kort og kvantitative Real-Time PCR i plasmaprøver frivillige i en lungekreft screening rettssaken. I tillegg, siden utgivelsen av hemolyse-relaterte miRNAs og mer generelle tekniske problemer kan påvirke analyse, er kvalitetskontroll trinnene i standard operasjonsprosedyrer også presentert. Protokollen er reproduserbare og gir pålitelig kvantitative resultater; men når du bruker stor klinisk serie, bør både pre analytisk og analytiske funksjoner forsiktig vurderes.

Introduction

Lungekreft er de opptrer både kreft over hele verden, sto for omtrent 25% av alle kreft diagnoser1. Til tross for jevn reduksjon i lungekreft dødelighet de siste 2 tiårene, hovedsakelig på grunn av redusert tobakksbruk, fortsatt lungekreft den ledende årsaken til kreftdødsfall i både menn og kvinner. I 2017, er det spådd å utgjøre ca 25% og 20% av de totale dødsfallene i USA og Europa, henholdsvis1,2.

Siden symptomene ikke forekommer vanligvis i tidlig sykdom, er fleste av lunge kreft diagnostisert på slutten stadier. Dette fører til en begrenset mulighet for terapeutisk intervensjon og dårlig effekt av behandlinger3. Derfor er mange vitenskapelig innsats rettet mot å identifisere en effektiv test for tidlig lunge kreft deteksjon.

En rekke screening studier viser at brystet røntgen har ingen verdi i lung cancer screening, mens lavdose beregnet tomografi (LDCT) er en bedre verktøyet sammenlignet røntgen for å oppdage tidlig stadium lunge kreft4. Videre har det vært vist thatscreening med bruk av LDCT redusert lunge kreft dødelighet opptil 20% blant nåværende og tidligere tunge røykere5. Disse dataene støtter bruk av lunge kreft screening i en høy risiko befolkning som definert i retningslinjene av flere profesjonelle foreninger4,6.

Av notatet, blant de store bekymringene om LDCT screening, er det høyt antall falske positive resultater og over-diagnosen. Som blir så, det vitenskapelige samfunnet er ute etter en strategi for å overvinne disse problemene og øke spesifisiteten av LDCT screening test. Utviklingen av ikke-invasiv komplementære biomarkers kan være nyttig her. Dato det er en omfattende liste over kandidat biomarkers under etterforskning, som miRNAs, celle-gratis DNA, gene metylering, små proteiner og andre7.

Blod-baserte biomarkers, inkludert immunrespons biomarkers og sirkulerer miRNAs, er de som når mer avansert validering fase8. Immunrespons biomarkers er basert på kunnskap som immunreaksjoner mot både intracellulær og overflate svulst antigener er bygget i lunge kreft pasienter9. For eksempel Ajona et al. evaluert rollen C4d, et fornedrelse produkt av den klassiske komplementbanen, i diagnostisering og prognosen for lunge kreft10. Ellers en kommersielt tilgjengelig autoantistoffer serum tester undersøke syv svulst-relaterte antigener er godkjent i ikke-småcellet lungekreft kreftpasienter og viste 36% av følsomhet og 91% av spesifisitet11. Immunrespons biomarkers er interessant, men ytterligere validering studier er nødvendig for en potensiell klinisk anvendelse.

miRNAs er endogene små ikke-koding RNAs med bevarte mekanisme og store funksjonell betydning over dyre- og plantelivet kongedømmene. MiRNAs rolle er å regulere protein oversettelsen: de undertrykke uttrykk for et stort antall mål gener12. Det er godt dokumentert at endringer ofmiRNAs' uttrykk bidra til patogenesen av de fleste mennesker kreft12,13,14. I tillegg løslate både svulst og stromal celler miRNAs, stabiliseres ved deres innlemmelse i microvesicles eller gjennom foreningen RNA-bindende proteiner, i kroppsvæsker som plasma og serum15,16, urin17 , og spytt18. Sirkulerer miRNAs kan derfor gjenspeile vert svaret og dynamisk samspill mellom svulsten og dens microenvironment19. Sammen gjort disse observasjonene sirkulerende miRNAs en lovende klasse av biomarkers for påvisning av menneskets kreftcelle.

Sirkulerer miRNAs kan oppdages ved hjelp av ulike metoder: microarray plattformer20, kvantitativ reversere transkripsjon PCR (RT-qPCR)21og neste generasjons sekvensering (NGS)14,22. Ulike uttrykk profil studier basert på de nevnte teknologiene har utviklet de siste årene. Microarray er en høy gjennomstrømming teknologi, stand til å analysere til tusenvis av miRNAs i én enkelt analysen. Men har det lavere dynamisk område og spesifisitet sammenlignet RT-qPCR eller NGS. I tillegg microarray er en ikke-kvantitativ metode, derfor videre eksperimentelle godkjenningen er krevde. Sekvens-baserte metoder kan tillate identifikasjon av ukjent miRNAs og egner seg spesielt i discovery fase. På den annen side, NGS metoder er fortsatt dyrt og nødvendiggjøre spesialutstyr og ekspert bioinformaticians, dermed begrense bruken i store godkjenningen kohorter og klinisk innstillinger23. For øyeblikket er RT-qPCR den mest vedtatt plattformen for sirkulerende miRNA gjenkjenning i en diagnose/klinisk sammenheng24. Det finnes ulike RT-qPCR teknologier for miRNAs analyse, men stilk-loop RT etterfulgt av TaqMan PCR er de mest brukte25. Denne teknikken er ekstremt følsomme og nøyaktige (enkelt nukleotid diskriminering) og har en høy dynamisk område; Men, gjør påvisning av kjente miRNAs bare.

MicroRNA kvalitetskontroll studien (miRQC studie) Mestdagh et al. grundig undersøkt egenskapene til noen kommersielt tilgjengelige plattformer for miRNAs profilering basert på de nevnte teknologier26. Ved å analysere 196 miRNAs i vev og serumprøver, var ytelsen til de forskjellige plattformene vurdert med hensyn til reproduserbarhet, følsomhet, nøyaktighet, spesifisitet og overensstemmelse med differensial uttrykk. Resultatene har vist at plattformer basert på NGS og microarray teknologier hadde en høyere reproduserbarhet og spesifisitet, men RT-qPCR plattformer var mer nøyaktig, følsom, og hadde en høyere oppdagelsen rate, særlig for lav input RNA prøver, som kroppen væsker. Dermed synes RT-qPCR å være den mest passende metoden for en potensiell program i rutinemessige klinisk diagnostics.

I 2011 analysert Sozzi et al. miRNA profilen plasmaprøver fra frivillige i en første LDCT screeningtrial (INT-IEO prøve)27 og fire miRNA signaturer av gjensidige prosenter blant 24 sirkulerer miRNAs ble generert. Disse signaturer var kunne diskriminere sykdom frie individer fra pasienter med noen eller dødelige lungekreft på tid eller opptil 2 år før LDCT sykdom oppdagelsen28. I en videre papir, samme gruppe beskrevet for første gang miRNA signatur klassifisereren (MSC), ved å kombinere de fire miRNA signaturene for å stratify pasienter i tre nivåer av risiko: høy, middels og lav. Sin kliniske verktøyet ble validert i en stor retrospektiv sett mer enn 1000 personer i MILD screening rettssaken, en randomisert studie som sammenligner årlig eller annethvert år LDCT arms med en observasjon arm29. Faktisk kombinasjonen av MSC og LDCT redusert LDCT falske positive hastighet av ca 5 ganger og tre MSC risikogruppene varknyttet til total overlevelse.

Senere i 2013 på den "Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori" (Milano, det) en potensiell screening prøve (BioMILD) gjennomfører LDCT med plasma basert MSC test ble lansert. Frivillige i BioMILD rettssaken gjennomgå LDCT og blod tilbaketrekning som behandles umiddelbart for å skille plasma for miRNA profilering bruker egendefinerte laget microfluidic kort. Kombinasjonen av LDCT og MSC resultatene definerer spesifikt screening algoritmen24.

I den nåværende arbeidet, hele metodologiske protokollen som brukes i BioMILD rettssaken er beskrevet, fra blod prøvetaking, til plasma isolasjon, RNA utvinning, og 24 miRNAs expression profilering ved hjelp av egendefinerte laget RT-qPCR microfluidic kort. Gitt høy konsistens og reproduserbarhet, kan disse prosedyrene også brukes for utvikling av miRNA-baserte flytende biopsier i andre sykdommer.

Protocol

protokollen ble godkjent av forskning etikk i institusjon våre.

1. plasma prøvetaking

  1. samle 10 mL fullblod utvalg i Vacutainer rør med spray-belagt K 2 EDTA og lager ved romtemperatur.
    Merk: For å minimere hemolyse, skille plasma innen 2 t. Ikke lagre hele blodet ved lav temperatur (dvs., 4 ° C) å unngå termisk sjokk og celle lysis som fører til en uspesifikke miRNA utgivelse.
  2. Innen 1 h, skille plasma av et første for sentrifugering på 1,258 x g og 4 ° C i 10 minutter
  3. Overføre plasma supernatant til en 15 mL tube, nøye unngå kontakt med lymfatisk ringen.
  4. Sentrifuger plasma en gang 1,258 x g og 4 ° C i 10 minutter
  5. Aliquot 1 mL av plasma i 1,5 mL cryovials, unngå samle plasma brøken på bunnen av røret.
  6. Lagre alle dele på − 80 ° C, unntatt for evalueringen av hemolyse. Molekylær analysen skal utføres innen 5 uker.

2. Evaluering av hemolyse ved Spektrofotometri måling

  1. straks det plasma separasjon trinnet i søppel for spectrophotometry, gjør en 1:10 fortynning av plasmaprøve i 1 X PBS (f.eks, 100 µL av plasma i 900 µL 1 X PBS) og bland til homogenize den.
    Merk: Bør plasmaprøve ikke være frosset før Spektrofotometri målingene, som den fryse-tining av prøven (og spesielt i lipemic prøver) kunne danne flocculates som forstyrrer Spektrofotometri analysen.
  2. Lese absorbansen på 375 nm, 414 nm, 541 nm og 576 nm et UV-Vis spektrofotometer, med en planlagt korreksjon avgjort på 750 nm og en banelengde av 10 mm. utføre en tom måling med 1 mL 1 x PBS.
  3. Beregne forholdet mellom absorbansen på 414 nm og 375 nm; hvis høyere enn 1.4, vurdere utvalget hemolyzed og gjenta blod uttak (DC1 i tabell 1).

3. Plasma totale RNA utvinning

  1. forberede en 1-Thioglycerol/homogenisering (OMG) løsning med 20 µL av 1-Thioglycerol per mL homogenisering løsning. Siden 1-Thioglycerol er tyktflytende, nøye Pipetter for nøyaktig måling. Koble det OMG ice eller ved 2-10 ° C før du benytter IT.i
    Merk: Arbeider løsningen er stabil på 2-10 ° C for 1 måned.
  2. Suspendere lyofilisert DNase jeg ved å legge til 275 µL av nuclease-gratis vann i ampullen og bland forsiktig (gjør ikke vortex). Som et visuelt hjelpemiddel, legge 5 µL av blå farge til den rekonstituerte DNase jeg og dispensere løsningen til engangs dele i nuclease-fri rør. Lagre rekonstituert DNase jeg på 30 ° C til -10 ° C.
  3. Fra 200 µL av plasma, legge til 200 µL av kjølt OMG løsningen.
  4. Vortex 15-30 s å sikre en komplett homogenisering. Hvis skummende oppstår, La prøven bosette seg på ice.
  5. Legge til 200 µL lyseringsbuffer og 25 µL proteinasen k homogenisert utvalg og vortex for 20 s.
  6. Incubate prøvene i 15 min i en thermomixer forvarmet til 37 ° C.
  7. Laste en patron for hver prøve dekk skuffen på instrumentet, og plasser tippen i riktig posisjon.
  8. Overføre den lysate til riktig posisjon i instrumentet kassetten.
  9. Legge til 5 µL av DNase jeg løsningen til riktig posisjon i kassetten.
  10. Legg til 60 µL av nuclease-fritt vann til bunnen av hver elueringsrør.
  11. Velg den " RSC miRNA vev " metoden og begynne automatisk rensing kjøre. Totalt RNA prøvene kan lagres på − 80 ° C.

4. Taq-baserte RT

  1. Bruk Taq RT Primer bassenget med miRNAs rundt for å konvertere RNA til cDNA med Taq MicroRNA omvendt transkripsjon Kit.
  2. Forberede 12 µL av RT reaksjon på is i en 1,5 mL microcentrifuge tube instruerte kit, med 6 µL av egendefinerte Taq RT Primer bassenget.
  3. Legge 3 µL av totalt RNA for et siste volum på 15 µL og ruge i is 5 min.
  4. Laste RT reaksjonen på en thermo-cycler konfigurert som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 minutter, og hold på 4 ° C.
    Merk: CDNA kan være store på 15 til 20 ° C i minst en uke.

5. Pre forsterkning

  1. Mix 2.5 µL av hvert RT produkt med 12.5 µL Taq Master Mix 2 x, 3.75 µL egendefinert Taq basseng og 6,25 µL nuclease-fritt vann, for et totalt volum på 25 µL.
  2. Utfører pre forsterkning reaksjonen ved hjelp av en thermo-cycler etter følgende termisk profil: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 minutter, 72 ° C i 2 minutter, 12 sykluser av 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 4 min , hold på 99,9 ° C i 10 min og 4 ° C.
  3. Fortynne produktet ved å legge til 175 µL av 0,1 X TE, pH 8.0.
    Merk: Utvannet produktet kan være store på 15 til 20 ° C i minst en uke.

6. RT-qPCR reaksjon på egendefinert Taq Array MicroRNA

  1. Bruk 384-vel microfluidicCustom Taq Array MicroRNA kort å måle Plasmanivåer av de 24 bestemte miRNAs (oppdaget i duplikat) på 8 prøver samtidig. MiRBase-ID (v21) for de 24 miRNAs er: har-miR-101-3 p, har-miR-106a - 5p, har-miR-126-3 p, har-miR-133a - 3p, har-miR-140-3 p, har-miR-140-5 p, har-miR-142-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-148b - 3p, har-miR-15b - 5p, har-miR-16-5 p, har-miR-17-5 p, har-miR-197-3 p, har-miR-19b - 3p, har-miR-21-5 p, har-miR-221-3 p, har-miR-28-3 p, har-miR-30b - 5p, har-miR - 30c - 5p, har-miR-320a, har-miR-451a, har-miR-486-5 p, har-miR-660-5 p og har-miR-92a - 3p.
  2. Blanding 1.13 µL av utvannet PreAmp utvalget med 56.25 µL av 2 X Taq Universal Master Mix og 55.69 µL nuclease uten vann i en 0,5 mL tube.
  3. Laste opp til 8 PCR reaksjonen blanding på tilpassede Taq Array MicroRNA kortene.
  4. Sentrifuger 311 x g i 2 min.
  5. Forsegle egendefinerte kortet matrise kort sealer.
  6. Kjøre i sanntid reaksjon med en Real-Time PCR System endre parameterne sykling som følger: 94.5 ° C i 10 min, 40 sykluser av 97 ° C for 30 s og 59,7 ° C 60 s.

7. Data ekstrapolering og prosenter generasjon

  1. Bruk programvaren å få rå Ct verdier, angi en automatisk planlagt å fjerne bakgrunnen signaler og en fast terskelverdi for 0,15 for alle analyser og eksempler. Fjerne flekker med dårlig forsterkning kurver og/eller dårlig passiv referanse signaler.
  2. Eksportere rå Ct verdier i " XLS " format og bruke Ct mener verdien av to like for videre analyse.
  3. Relatere miRNAs ' uttrykk nivåer historiske mål på klinisk studie prøver (Tabell 2). Hvis minst 50% av prøver på hvert egendefinerte laget microfluidic føre en Pearson ' s sammenheng < 97,5, gjenta kortet (QC2 i tabell 1).
  4. Beregn det − ΔCts mellom alle miRNAs, tilsvarer verdiene som log2 av miRNA forholdstallene.

8. Evaluering av hemolyse av den relaterte miRNA signatur

  1. Generer hemolyse-relaterte miRNA signaturen bruker følgende miRNA forholdstallene med respektive avskjær (log2 verdier) for kort lagring plasmaprøver (1-5 uker − 80 ° C): miR-126/451 < − 0,07, 15b/451 < − 3,67, 221/451 < − 3,18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15b/486-5 p < − 3.86, 221/486-5 p < − 3,17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1,8, 15B/92a < − 1.8, 221/92a < − 1.04, 30b/92a < 0.87, 126/16 < − 2,85, 15b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5,9, 30b/16 < − 3.68.
  2. Klassifisere som hemolyzed prøver der minst 50% av prosenter (8 av 16) overskrider respektive cut-off (QC3 i tabell 1).

9. Definisjon av nivået av risiko: høy, middels og lav

  1. Definer fire signaturer miRNA forholdstallene komponere MSC som rapportert i Figur 3: risikoen for sykdom (RD), risiko for aggressiv sykdom (RAD), tilstedeværelse av sykdom, og tilstedeværelsen av aggressiv sykdom (PAD).
  2. For hver signatur, definere prosenter som overstiger den respektive cut-off verdien for kort lagring plasmaprøver (1-5 uker − 80 ° C). Overstiger prosenter måtte bli vurdert positivt er 9 av 27 for RD og PD og 14 av 28 for RAD og PAD ( Figur 3 A).
  3. Attributt til hver prøve respektive MSC risikonivået som følger: lav risiko hvis RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg., middels risiko hvis RD pos ∪ PD pos ∩ RAD neg. ∩ PAD neg; eller høy risiko hvis RAD pos ∪ PAD pos ( Figur 3 B).

Representative Results

BioMILD rettssaken er en prospektiv studie for tidlig deteksjon av lungekreft å teste effektiviteten av en kombinert LDCT-MSC tilnærming som første linje screening tester i en stor kohort storrøyker individer. En klasse av risikoen er tilskrevet hver frivillig basert på miRNA testen, som evaluerer forhold mellom 24 plasma sirkulerende miRNAs. Som i stor grad rapporterte30,31,32er hemolyse viktig for analyse av sirkulerende miRNA, siden falske resultater kan hentes på grunn av en uspesifisert versjon av miRNAs av blod celler. Foreslåtte metodologiske arbeidsflyten en pre analytisk kvalitetskontroll trinn (DC1 i tabell 1) for å identifisere hemolyzed og dermed ikke-analyzable, plasmaprøver ble beskrevet. Figur 1 rapporterer en Spektrofotometri analyse av hemolyzed (figur 1A) og ikke-hemolyzed (figur 1B) plasmaprøver med respektive A414/A375 verdier. I en klinisk sammenheng var resultatet av en molekylær test er avgjørende for frivillige ledelse, denne DC1 tillater gjentatte blod prøvetaking og, i de fleste tilfeller gjenoppretter prøven.

Etter molekylær behandling, bør RT-qPCR ytelsen nøyaktig vurderes for å identifisere eventuelle tekniske problemer. Figur 2 En viser en RT-qPCR med lav ytelse på grunn av en dårlig passiv referanse signal. I dette tilfellet omlasting pre forsterkning produktet til en ny microfluidic anbefales. Når RT-qPCR også, som i figur 2B, kortet går til første innlegget analytisk kvalitetskontroll skritt for å sikre at miRNA uttrykk verdiene er sammenlignbare med historiske målingen (QC2 i tabell 1). Hvis QC2 steg svikter, et teknisk problem har oppstått under omvendt transkripsjon eller i pre forsterkning reaksjonene og det er praktisk å gjenta hele molekylær behandling fra omvendt transkripsjon.

Det siste trinnet for kvalitetskontroll (QC3 i tabell 1) evaluerer hemolyse også på molekylært nivå. Uttrykket nivåer av 4 røde blodlegemer-spesifikke miRNAs (mir-16, mir-451, mir-486-5 p og mir-92a) var forhold til de av 4 ikke-hemolyse relaterte miRNAs (mir-126, mir 15b, mir-221 og mir-30b), genererer hemolyse-relaterte miRNA signaturen komponert av den 16 (4 x 4) miRNA prosenter. Positive eksempler er klassifisert som hemolyzed, mens negativ prøver videre til den siste MSC risiko klassifiseringen som beskrevet i protokollen avsnitt 9 og Figur 3.

Figure 1
Figur 1: Spektrofotometri analyse av fersk plasmaprøver. Spektrofotometri profiler av (A) 2 hemolyzed og (B) 2 ikke-hemolyzed plasmaprøver, måle absorbansen forholdet mellom bølgelengder A414 og A375. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : RT-qPCR ytelse i microfluidic kort analyse. Forsterkning og multicomponent tomter sammenligne (A) fattige og (B) god kvalitet microfluidic kort. Alle 24 miRNAs og en enkelt exemplifying miRNA rapporteres i hvert panel. Multicomponent tomter illustrerer passiv referanse signalene skjer i disse RT-qPCR reaksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: MSC algoritme for risiko lagdeling. Representant resultat vurderer 6 plasmaprøver fra frivillige registrert i BioMILD screening rettssaken. (A) miRNA-prosenter signaturer av risiko for sykdom (RD), risiko for aggressiv sykdom (RAD), tilstedeværelse av sykdom, aggressiv sykdom (PAD), og tilsvarende cut-off verdier (log2) for plasmaprøver lagret på-80 ° C i minst 1 uke og opptil 5 uker. (B) kombinasjonen av de fire signaturene til stratify analyzable prøver i høy (H), middels (I) og lav (L) MSC miljørisiko. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Fallgruver og utfordringer av metodologiske arbeidsflyten
BioMILD er den første prospektiv studien analysere sirkulerende miRNAs som et diagnostisk verktøy, ble terskler og avskjær benyttes for data-analyse generert fra retrospektiv serien. For å overvinne problemet av ulike lagring hendelsesintervallet plasmaprøver, kan parameterne være raffinert å muligens få en økning av MSC ytelse. Likevel, før du starter miRNAs analyse, flere aspekter av hele prosessen må vurderes nøye, som inklusjonskriterier, prøvetaking og behandling, og bioinformatikk algoritmen vedtatt for dataanalyse. Avsnittene nedenfor vil fokusere på de fleste kritiske punkter i arbeidsflyten beskrevet i dagens papir, håndterer store problemene av hvert enkelt trinn og deretter foreslår strategier for å overvinne dem.

Studien befolkningen
Påmelding kriterier for BioMILD screening rettssaken er: 50-75 år gamle, tunge nåværende eller tidligere (mindre enn 10 år) røykere med minst 30 pack-årene og ingen tidligere historie av kreft innen 5 år. I denne populasjonen var estimert lunge kreft utbredelse og forekomst per år om lag 1% og 0,7%, henholdsvis. Vil bruke MSC testen som beskrevet i den foreslåtte protokollen, bør befolkningen analysert opprettholde lignende egenskaper. Særlig innebærer det QC2 trinnet beskrevet ovenfor sammenligning med gitt historiske data innhentet fra et lignende befolkningen. Mens en sammenheng under 97,5 kunne tekniske problemer, derimot, er de fleste individer med endrede sirkulerende miRNA nivåer reflekterer risikoen for lungekreft faktisk under den terskelen. Med andre ord, hvis det QC2 trinnet med parametere rapporterte her brukes en populasjon på høyere risiko for å utvikle lungekreft, kan det ekskludere akseptabel prøver. Ny, riktig referanse parametere bør må defineres som er spesifikke for hver befolkningen analysert i henhold til forventet resultat.

Blod samling og hemolyse
Samlingen av biologiske prøver er et viktig pre analytisk skritt, siden det kan svekke eksempel kvalitet og egenskaper, og dermed endre de endelige resultatene av analyser. Om blodprøver er det viktig å samle friskt blod og behandle prøven så raskt som mulig. Prøver skal verken bli lagret på 4 ° C eller frosset etter blod tilbaketrekking, siden fryses passasjer kan indusere celle lysis (hemolyse) og RNA fornedrelse. For å minimere hemolyse prosessen, er det foreslått for å skille plasma innen 2 timer fra blod samling31 .

Hemolyse skyldes nedbryting av røde blodlegemer (RBCs) og påfølgende utgivelsen av innholdet i omgivelsene. Dette kan være et problem for sirkulerende miRNAs testing fordi utgivelsen av RBCs intracellulær innhold dramatisk endrer microRNA profilen i blod, potensielt påvirke nøyaktigheten av plasma-basert analyse30.

Å kunne identifisere også minimale nivåer av hemolyse i plasmaprøver er avgjørende for studier basert på sirkulerer miRNAs som biomarkers. Hemolyse kan i utgangspunktet bli vurdert av visuell inspeksjon, siden etter to sentrifugering trinnene fargen plasma kan variere fra gul til rødt for svært hemolyzed prøver. Bare visuell inspeksjon kan imidlertid ikke være sensitive nok i sammenheng med molekylær biomarkør forskning.

En enkel, pre analytiske metode for å identifisere hemolyzed plasmaprøver er Spektrofotometri måling på bølgelengde (λ) = 414 nm i viktigste oxyhemoglobin peak absorbansen, etter riktig justering for noen annen kilde for interferens. Derfor normalisert 414 nm toppen absorbansen verdien på 375 nm, om de lipidic innhold33. Alternativt, eller bedre, i kombinasjon, en lipemia-independenthemolysis score (HS) kan være brukt34. Denne spektrofotometrisk-baserte prosedyren kan identifisere minst 6.1 mg/dL av gratis hemoglobin. Ellers kan hemolyzed prøver bli identifisert gjennom påvisning av røde blodlegemer-spesifikke miRNAs. Siden selv en svært lav prosentandel av hemolyse kan lokke fram en betydelig økning i røde blodlegemer-spesifikke miRNA nivåer32, identifisert Fortunato et al. en bestemt hemolyse-relaterte signatur basert på 16 miRNAs-prosenter som effektivt klassifisere hemolyse plasma prøver33. Alle de nevnte analyser kan brukes i kombinasjon siden absorbansen forholdet 414/375 og/eller HS er vedtatt i pre analytisk fase lagrer ytterligere kostnader, mens måle hemolyse-relaterte miRNAs kan brukes i en post analytisk fase som en kvalitetskontroll trinn.

Sirkulerer miRNAs isolasjon og RNA renhet
Utvinning RNA fremgangsmåten er svært innflytelsesrike for suksessen til de påfølgende analysene. Fra en lav input prøve, som plasma, må utvinning være så effektiv som mulig for å sikre en nøyaktig kvantifisering av miRNAs. Plasma er preget av høye konsentrasjoner av mange proteiner, inkludert nucleases og andre komponenter som kan forstyrre nedstrøms enzymatiske reaksjoner av RT-qPCR og kan påvirke sirkulerer miRNAs deteksjon. Flere utvinning metoder har blitt brukt i slike studier, men generelt, organisk utvinning etterfulgt av silisium-baserte RNA berikelse tillater fjerning av plasma hemmere bedre så TRIzol alene35. Likevel, i de siste årene, manuell utvinning er erstattet av automatisert utvinning. Mindre risiko for forurensning og høyere reproduserbarhet økonomiske tiden er de viktigste fordelene med automatiserte systemer sammenlignet med manuell isolering protokoller. Dessuten gitt automatisert utvinning metoder høyeste miRNA beløpene fra blodprøver og høyeste effektivitet sammenlignet med manuell protokoller36.

Normalisering problemet
Normalisering av plasma miRNA nivåer er fremdeles kontroversiell. Faktisk kan forskjeller i utvalg kvalitet eller antall forstyrre identifisering av sanne endringer i miRNAs uttrykk nivåene skyldes tilstedeværelse eller risikoen for sykdommer, og dermed fører til tvetydig data tolkninger og villedende konklusjoner. Hittil har har mangel på konsensus resultert i ulike normalisering strategier37.

Totalt RNA utvunnet fra plasmaprøver er vanligvis under sperregrensen på standard kvantifisering metoder som UV spectrophotometry eller fluorescens-baserte spectrophotometry, dermed utelukker RNA masse standardisering38. Følgelig bør et fast volum i stedet for en fast mengde elut RNA velges som inndata for RT reaksjon39.

Rengjøring transkripsjoner brukes for miRNA analyse i vevsprøver, er som RNU48 og RNU6, ikke egnet for normalisering ekstracellulære miRNA målinger, som begge ikke er alltid i sirkulasjon, på grunn av RNase-mediert fornedrelse40, og er også deregulert i en sykdom-spesifikk måte37. Det er uklart om noen sirkulerende miRNAs kan effektivt brukes som referanse kontroller. For eksempel foreslås miR-16 ofte for rengjøring, men dulike studier har vist at det er deregulert i plasmaprøver av kreft pasienter28,37. Videre påvirkes miR-16 nivåer sterkt av hemolyse30.

For høy gjennomstrømming analyser måle flere miRNAs og normalisere på betyr uttrykket verdien er generelt akseptert41, når et begrenset antall miRNAs må analyseres, kan ikke denne normalisering brukes. For å omgå problemet normalisering, etablerte Boeri et al. en algoritme basert på gjensidige prosenter blant 24 miRNAs28. Slik tilnærming, til tross for å være svært nyttig for utvikling av diagnoseverktøyet, tillater lett ikke skille effektivt endret miRNAs muligens ha en rolle i tumor utvikling, og således identifiserte miRNAs som fungerende kalibratorer. En effektiv strategi, vedtatt av Bianchi et al. som utviklet en serum miR-Test for lunge kreft tidlig oppdagelse, var basert på normalisere på det geometriske gjennomsnittet av en gruppe 6 "housekeeping serum-miRNAs" varierende mindre blant prøver og klasser av pasienter42.

MiRNA-baserte flytende biopsi og potensiell program
Plasma-basert MSC er en molekylær ikke-invasiv test studert for tidlig diagnostisering av lungekreft tunge røykere. MSC testen kan identifisere middels eller høy risiko fag før lunge kreft gjenkjenning av LDCT, med høy følsomhet (SE, 87%) og negative logiske verdien (NPV, 99%). Spesielt kunne MSC gjennomføre LDCT screening ved å redusere falske positive resultater til 3,7%, fra 19.7% LDCT alene29. MSC testen har også vist for å ha en god prognostiske ytelse når de vurderer bare lunge kreftpasienter, og kan brukes som avlytting verktøyet alene eller i kombinasjon med andre kliniske patologisk parametere43,44. MSC testen kan muligens gjøre større konsistens av lunge kreft diagnostiske algoritmer, dermed redusere screening kostnadseffektivitet.

Foruten MSC, er andre ikke-invasive tester for tidlig lunge kreft deteksjon rapportert. Bianchi et al. foreslått en sirkulerende miR-Test basert på en 34-miRNA signatur45, og redusert det til en 13 miRNA signatur42. Serum prøver fordiscovery og godkjenningen ble innhentet fra kontinuerlig observasjon av røyking fag (KOSMOS) LDCT screening rettssaken, utføres i den europeiske institusjon onkologi (IEO, Milano, Italia). MiR-testen viste 78% nøyaktighet for påvisning av lunge kreft i høyrisikoatferd frivillige. Mellom 13 serum-miRNAs og 24 komponere MSC, var bare 5 miRNAs overlappende (miR-92a, miR-30b, miR - 30c, miR-148a og miR-140-5 p). Dette kan skyldes ulike type starter prøver (serum og plasma) og data utdypning. Faktisk for miR-testen var forfatterne valgte 6 miRNAs oppfører seg som husarbeid i serum, hvorav 3 også inkludert MSC miRNA forholdstallene (miR 15b, miR-19b og miR-197). Likevel, MSC i plasma og miR-Test i serumprøver mer dypt validerer bruken av miRNA-baserte flytende biopsi for deteksjon av lungekreft.

MiRNAs profilering for identifikasjon av lunge kreft biomarkers er utført også på sputum prøver46. Sputum kan hentes lett og miRNA uttrykk nivåene synes å være ekstremt stabil i den. Men lung cancer screening frivillige er 50-55 år og er tunge røykere med Co-morbidities som KOLS, dermed sputum vanskelig å få. Faktisk, blant annet kroppsvæsker, plasma er en av de beste alternativene å undersøke den potensielle rollen miRNAs som (men ikke begrenset til) lunge kreft biomarkers.

Samlet kan fremgangsmåten som er beskrevet i dagens papir være relevante i forbindelse med ulike sykdommer, med Nei begrensning av patologi gransket (fra Krepsen, nervesystemet og kardiovaskulære lidelser eller diabetes) og i hensikten å klinisk bruk (en biomarkør for diagnose, prognosen eller selv respons på behandling).

Disclosures

Gabriella Sozzi, Mattia Boeri og Ugo Pastorino er co-oppfinnere av tre patentsøknader lisensiert til Gensignia biovitenskap, om miRNA signaturen i denne artikkelen. Alle gjenværende forfatterne erklærer uten interessekonflikter i forhold til arbeidet innsendt.

Acknowledgments

Forfatterne takker Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, og Chiara Banfi for håndtering frivillige i forsøkene og administrativ hjelp; og Claudio Jacomelli og Claudio Citterio for databehandling. Arbeidet ble støttet av den italienske foreningen for kreftforskning [etterforsker tilskudd nr. 15928 å 14318, GS, og 12162 (spesielt Program "Innovative verktøy for risikovurdering for kreft og tidlig diagnose", 5 x 1000)]; Italiensk Helsedepartementet [Grant nr. RF-2010]; Gi UO1 CA166905 fra National Cancer Institute (USA). MB ble støttet av et Fondazione Pezcoller fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).

Tags

Kreftforskning problemet 128 lungekreft tidlig oppdagelse sirkulerer microRNAs biomarkers flytende biopsi Real-Time PCR.
MicroRNA basert flytende biopsi: Opplevelsen av Plasma miRNA signatur klassifiserer (MSC) for Lung Cancer Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C.,… More

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter