Summary
Här presenterar vi de detaljerade protokoll som antogs i BioMILD screening trial för att utföra cirkulerande mikroRNA signaturer klassificerare testet för tidig lung cancer upptäckt.
Abstract
Utvecklingen av ett minimalt invasiva test, såsom flytande biopsi, för tidig lung cancer upptäckt i den prekliniska fasen är avgörande för att förbättra resultatet av denna dödliga sjukdom. MikroRNA (Mirna) är vävnad specifika, små, icke-kodande RNAs reglering av genuttryck, som får agera som extracellulära budbärare av biologiska signaler härrör från överhörning mellan tumören och dess omgivande närmiljön. De kunde således representerar perfekta kandidater för tidig upptäckt av lungcancer. I detta arbete föreslås en metodologisk arbetsflöde för prospektiv validering av ett cirkulerande miRNA test med anpassade gjort mikroflödessystem kort och kvantitativa Real-Time PCR i plasmaprover av frivilliga inskrivna i en lungcancer screening trial. Dessutom, eftersom lanseringen av hemolys-relaterade MicroRNA och mer allmänna tekniska frågor kan påverka analysen, presenteras kvalitetskontroll stegen ingår i standardrutinerna också. Protokollet är reproducerbara och ger tillförlitliga kvantitativa resultat; men när du använder stora kliniska serier, bör både före analytisk och analytiska funktioner försiktigt utvärderas.
Introduction
Lungcancer är mest vanligen diagnostiseras cancer i världen, för cirka 25% av all cancer diagnoser1. Trots den stadig minskningen av lungcancer dödlighet under de senaste 2 decennierna, främst på grund av minskad tobaksanvändning, fortfarande lungcancer den vanligaste orsaken till cancerdöd hos både män och kvinnor. 2017 spås det konto för cirka 25% och 20% av de totala cancer dödsfall i USA och Europa, respektive1,2.
Eftersom symtomen vanligtvis inte förekommer i tidig sjukdom, diagnostiseras majoriteten av lung cancer i sena skeden. Detta leder till en begränsad möjlighet för terapeutisk intervention och dålig effekt av behandlingar3. Därför syftar många vetenskapliga insatser till att identifiera ett effektivt test för tidig lung cancer upptäckt.
En mängd screening prövningar visar att lungröntgen har inget värde i lung cancerscreening, medan låg dos beräknas tomografi (LDCT) är ett bättre verktyg jämfört med röntgen för att upptäcka tidiga skede lung cancer4. Det har dessutom visat thatscreening med användning av LDCT minskar Lungcancerdödligheten upp till 20% bland nuvarande och tidigare storrökare5. Dessa data stödjer användningen av lung cancerscreening i en hög risk population enligt definitionen i riktlinjerna av flera professionella organisationer4,6.
Notera, bland den stora oron LDCT screening, är det den höga andelen falskt positiva resultat och över-diagnos. Att därför forskarvärlden söker en strategi för att övervinna problemen och öka specificiteten av LDCT övervakningstestet. Utvecklingen av icke-invasiva kompletterande biomarkörer kan vara användbart här. Hittills, det finns en omfattande lista med kandidat biomarkörer under utredning, exempelvis MicroRNA cellfria DNA, gen metylering, små proteiner och andra7.
Blod-baserade biomarkörer, inklusive immunsvar biomarkörer och cirkulerande MicroRNA, är de som når de mer avancerade validering fas8. De immunsvar biomarkörer är baserade på den kunskap som immunsvar mot båda intracellulära och ytan tumör antigener byggs upp i lung cancer patienter9. Exempelvis Storboba82 o.a. utvärderade C4d, en nedbrytningsprodukt av den klassiska komplementbanan, av diagnos och prognos av lung cancer10roll. Annars, testa en kommersiellt tillgänglig autoantikroppar serum att undersöka sju tumör-relaterade antigener har validerats hos patienter med icke-small cell lung cancer och visade 36% av sensibilitet och 91% av specificitet11. Immunsvar biomarkörer är intressanta, men det behövs ytterligare valideringsstudier för en potentiell klinisk tillämpning.
MicroRNA är endogena små icke-kodande RNAs med bevarade mekanism och stor funktionell betydelse över hela djur- och växtarter riken. Rollen av MicroRNA är att reglera protein översättning: de förtränga uttrycket av en stor uppsättning mål gener12. Det är väl dokumenterat att förändringar ofmiRNAs' uttryck bidra till patogenesen av de flesta mänskliga cancer12,13,14. Dessutom släppa både tumör och stromaceller MicroRNA, stabiliseras av inkorporeras in i microvesicles eller genom anslutningen till RNA-bindande proteiner, in i kroppsvätskor såsom plasma och serum15,16, urin17 , och saliv18. Cirkulerande MicroRNA återspeglar således värd svaret och det dynamiska samspelet mellan tumören och dess mikromiljö19. Tillsammans har dessa observationer gjorda cirkulerande MicroRNA en lovande klass av biomarkörer för detektion av mänskliga cancer.
Cirkulerande MicroRNA kan upptäckas med olika metoder: microarray plattformar20, kvantitativa omvänd Transkription PCR (RT-qPCR)21, och nästa generations sekvensering (NGS)14,22. Olika uttryck profil studier baserade på de nämnda teknikerna har utvecklats under de senaste åren. Microarray är en hög genomströmning teknik, kunna analysera upp till tusentals MicroRNA i en enda analys. Det har dock lägre dynamiskt omfång och specificitet jämfört med RT-qPCR eller NGS. Dessutom microarray är en icke-kvantitativa metod, därför ytterligare experimentell validering krävs. Sekvens-baserade metoder kan tillåta identifiering av okända MicroRNA och lämpar sig särskilt i en discovery-fas. Däremot, NGS metoder är fortfarande dyra och kräver speciell utrustning och expert bioinformatiker, vilket begränsar deras användning i stora validering kohorter och i kliniska inställningar23. För tillfället är RT-qPCR mest antagna plattformen för cirkulerande miRNA upptäckt i en diagnos och kliniska sammanhang24. Det finns olika tekniker som RT-qPCR för MicroRNA analys, men stammen-loop RT följt av TaqMan PCR är den mest använda25. Denna teknik är extremt känslig och korrekt (singel nukleotid diskriminering) och har ett stort dynamiskt omfång; Det tillåter dock upptäckt av kända MicroRNA endast.
MikroRNA kvalitetskontroll studie (miRQC-studien) av Mestdagh et al. utförligt undersökt egenskaperna hos vissa kommersiellt tillgängliga plattformar för miRNA profilering baserat på de tre nämnda teknik26. Genom att analysera 196 MicroRNA i vävnader och serumprov, bedömdes prestanda för de olika plattformarna när det gäller reproducerbarhet, känslighet, noggrannhet, specificitet och concordance av differentiell uttryck. Resultaten har visat att plattformar baserat på NGS och microarray technologies hade en högre reproducerbarhet och specificitet, men RT-qPCR plattformar mer exakt, känslig och hade en högre träffsäkerhet, särskilt för låg input RNA-prover, såsom kroppen vätskor. RT-qPCR förefaller således vara den lämpligaste metoden för en potentiell ansökan i rutinmässig klinisk diagnostik.
I 2011 analyserade Sozzi et al. plasmaprover som tagits från frivilliga inskrivna i en första LDCT screeningtrial (INT-IEO trial)27 och fyra miRNA signaturer komponerad av ömsesidiga nyckeltal bland 24 cirkulerande MicroRNA miRNA profil genererades. Dessa signaturer var kunna diskriminera sjukdom fria individer från patienter med någon eller dödlig lungcancer tid eller upp till 2 år innan LDCT sjukdom upptäckt28. I ett ytterligare papper, samma grupp beskrivs för första gången miRNA signatur klassificeraren (MSC), erhålls genom att kombinera fyra miRNA underskrifter för att stratifiera patienter i tre nivåer av risk: höga, mellanliggande och låga. Dess kliniska nytta har validerats i en stor retrospektiv av mer än 1 000 individer som rekryterats i MILD screening studien, en randomiserad studie som jämförde årlig eller tvåårig LDCT armar med en observation arm29. Faktiskt, kombinationen av MSC och LDCT minskade andelen falskt positiva LDCT av ungefärligt 5 gånger och de tre MSC riskgrupperna varassocierade med överlevnad.
Senare, under 2013 på den ”Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” (Milano, det) en prospektiv screening trial (BioMILD) genomföra LDCT med plasma baserat MSC test lanserades. Frivilliga inskrivna i BioMILD rättegången genomgå LDCT och blod uttag att behandlas omedelbart för att separera plasma för miRNA profilering med anpassade gjort mikroflödessystem kort. Kombinationen av LDCT och MSC resultaten definierar de specifika screening algoritm24.
I den nuvarande arbetet, hela metodologiska protokollet som används i BioMILD-studien beskrivs, börjar från provtagning i blod, plasma isolering, RNA-extraktion, och 24 MicroRNA uttryck profilering med hjälp av anpassade gjort RTqPCR mikroflödessystem kort. Ges hög konsekvens och reproducerbarhet, kan dessa förfaranden också användas för utveckling av miRNA-baserade flytande biopsier i andra sjukdomar.
Protocol
protokollet godkändes av en forskningsetisk kommitté av vår institution.
1. plasma provsamling
- samla 10 mL helblod prov i Vacutainer rör med spray-belagd K 2 EDTA och förvara i rumstemperatur.
Obs: För att minimera hemolys, separera plasma inom 2 h. Förvara inte i helblod vid låg temperatur (dvs, 4 ° C) att undvika termisk chock och cell lysis som leder till en ospecifik miRNA release. - Inom 1 h, separera plasma av en första centrifugeringssteget vid 1 258 x g och 4 ° C i 10 min.
- Överför plasman supernatanten till en 15 mL tub, noggrant undvika kontakt med lymfatisk ringen.
- Centrifugera plasma en andra gång vid 1 258 x g och 4 ° C i 10 min.
- Alikvotens 1 mL plasma in 1,5 mL cryovials, undvika att samla plasma bråket vid basen av röret.
- Lagra alla alikvoter vid − 80 ° C, utom en för utvärdering av hemolys. Den molekylära analysen bör utföras inom 5 veckor.
2. Utvärdering av hemolys av spektrofotometrisk mätning
- omedelbart efter steget plasma separation i en kyvetten för spektrofotometri, göra en 1:10 utspädning av plasma provet i 1 X PBS (t.ex., det 100 µL plasma i 900 µL av 1 X PBS) och blanda för att homogenisera den.
Obs: Plasma provet bör inte frysas innan spektrofotometrisk mätningarna, som frysa-upptining av provet (och i synnerhet i lipemiska prover), kunde bilda flocculates som interfererar med spektrofotometrisk analysen. - Läs absorbansen vid 375 nm, 414 nm, 541 nm och 576 nm med en spektrofotometer som UV-Vis, med en Baslinjejustering bosatte sig vid 750 nm och sökvägens längd av 10 mm. utföra en tom mätning med 1 mL 1 x PBS.
- Beräkna förhållandet mellan absorbansen vid 414 nm och 375 nm; om högre än 1,4, överväga hemolyserade provet och upprepa blod tillbakadragande (QC1 i tabell 1).
3. Plasma totala RNA-extraktion
- Förbered en 1-Thioglycerol/homogenisering (OMG) lösning med 20 µL av 1-Thioglycerol per mL homogenisering lösning. Eftersom 1-Thioglycerol är trögflytande, pipett noggrant för exakt mätning. Chill OMG lösningen på is eller vid 2-10 ° C innan du använder den.
Obs: Arbetslösning är stabil vid 2-10 ° C i 1 månad. - Avbryta den frystorkade DNAS jag genom att lägga till 275 µL nuclease-fritt vatten i flaskan och blanda försiktigt (gör inte vortex). Som ett visuellt hjälpmedel, tillsätt 5 µL av blått färga till den rekonstituerade DNAS jag och fördela lösningen i engångsbruk alikvoter i nuclease-fri rör. Lagra rekonstituerade DNAS jag vid-30 ° C till -10 ° C.
- Start från 200 µL plasma, tillsätt 200 µL av kylda OMG lösningen.
- Vortex 15-30 s att säkerställa en fullständig homogenisering. Om skumbildning inträffar, låt provet bosätta sig på ice.
- Tillsätt 200 µL av lyseringsbuffert och 25 µL av proteinas K till homogeniserade provet och virvel för 20 s.
- Inkubera proverna för 15 min i en thermomixer förvärmd vid 37 ° C.
- Fyll en patron för varje prov på däck facket av instrumentet och placera plugger i korrekt position.
- Överför den lysate till lämplig position i instrumentet patronen.
- Tillsätt 5 µL av DNAS jag lösningen till rätt position i patronen.
- Lägga till 60 µL nuclease-fritt vatten till basen på varje eluering tube.
- Välj det " RSC miRNA vävnad " metod och börja automatisk rening kör. De totala RNA-proverna kan lagras på − 80 ° C.
4. Taq-baserade RT
- använda Taq RT Primer poolen med MicroRNA sevärdheter för att konvertera RNA till cDNA med Taq mikroRNA omvänd Transkription Kit.
- Förbereda 12 µL av RT reaktionsblandning på is i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör enligt anvisningarna i kit och använder 6 µL av anpassade Taq RT Primer poolen.
- Lägga till 3 µL av totalt RNA för en slutlig volym av 15 µL och inkubera i is för 5 min.
- Ladda RT reaktionen på en thermo-apparat konfigureras enligt följande: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 min, och håll vid 4 ° C.
Obs: CDNA kan förvaras vid -15 till-20 ° C för minst en vecka.
5. Före förstärkning
- Mix 2,5 µL av varje RT produkt med 12,5 µL av Taq Master Mix 2 x 3,75 µL anpassad Taq pool och 6,25 µL nuclease-gratis vatten, för en total volym på 25 µL.
- Utföra före förstärkning reaktionen med hjälp av en termo-apparat enligt följande termiska profil: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 min, 72 ° C i 2 min, 12 behandlingscykler om 95 ° C för 15 s, och 60 ° C under 4 minuter , håll sedan vid 99,9 ° C i 10 min och vid 4 ° C.
- Späd produkten genom att lägga till 175 µL 0,1 X TE, pH 8,0.
Obs: Den utspädda produkten kan förvaras vid -15 till-20 ° C för minst en vecka.
6. RT-qPCR reaktion på Custom Taq Array mikroRNA kort
- användning av 384-väl microfluidicCustom Taq Array mikroRNA kort att mäta plasmanivåerna av de 24 specifika MicroRNA (fläckig i dubblett) på 8 prover samtidigt. MiRBase ID (v21) för de 24 MicroRNA är: har-miR-101-3 p, har-miR-106a - 5p, har-miR-126-3 p, har-miR-133a - 3p, har-miR-140-3 p, har-miR-140-5 p, har-miR-142-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-148b - 3p, har-miR-15b - 5p, har-miR-16-5 p, har-miR-17-5 p, har-miR-197-3 p, har-miR-19b - 3p, har-miR-21-5 p, har-miR-221-3 p, har-miR-28-3 p, har-miR-30b - 5p, har-miR - 30c - 5p, har-miR-320a, har-miR-451a, har-miR-486-5 p, har-miR-660-5 p och har-miR-92a - 3p.
- Mix 1.13 µL av det utspädda provet PreAmp med 56.25 µL av 2 X Taq Universal Master Mix och 55.69 µL nuclease-fritt vatten på 0,5 mL tub.
- Ladda upp till 8 PCR-reaktionsblandning på Custom Taq Array mikroRNA korten.
- Centrifugera vid 311 x g i 2 min.
- Tätning anpassad kortet med array kortet sealer.
- Kör i realtid reaktion Real-Time PCR System ändra parametrarna för cykling som följde med: 94,5 ° C i 10 min, 40 cykler av 97 ° C för 30 s och 59,7 ° C för 60 s.
7. Data extrapolering och nyckeltal Generation
- använda programvaran att få rå Ct-värden, ställa in en automatisk baslinjen för att ta bort bakgrunden signalerna och en fast gräns på 0,15 för alla analyser och prover. Ta bort fläckar med dålig förstärkning kurvor och/eller dålig passiva referens signaler.
- Export rå Ct-värden i " .xls " format och använda Ct menar värdet av två dubbletter för vidare analys.
- Korrelerar MicroRNA ' uttrycksnivåerna till historiska mätningar på klinisk studie prover (Tabell 2). Om minst 50% av proverna på varje anpassade gjort mikroflödessystem kort resulterar i en Pearson ' s korrelation < 97,5, upprepa kortet (QC2 i tabell 1).
- Beräkna de − ΔCts mellan alla MicroRNA, motsvarande log2 värdena av miRNA kvoterna.
8. Utvärdering av hemolys av de relaterade miRNA signatur
- generera hemolys-relaterade miRNA signaturen med följande miRNA nyckeltalen med respektive cut-off (log2 värden) för kort lagring plasmaprover (1-5 veckor på − 80 ° C): miR-126/451 < − 0,07, 15b/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15b/486-5 p < − 3,86, 221/486-5 p < − 3,17, 30b/486-5 p < − 1,42, 126/92a < 1,8, 15b/92a < − 1,8, 221/92a < − 1.04, 30b/92a < 0.87, 126/16 < − 2,85, 15b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30b/16 < − 3,68.
- Klassificera som hemolyserade prover där minst 50% av nyckeltal (8 av 16) överstiger respektive cut-off (QC3 i tabell 1).
9. Definition av den nivå av Risk: hög, medel och låg
- definiera fyra signaturer över miRNA nyckeltal komponera MSC som redovisas i figur 3: risk för sjukdom (RD), risk för aggressiv sjukdom (RAD), förekomst av sjukdom (PD) och förekomsten av aggressiv sjukdom (PAD).
- För varje signatur, definiera nyckeltalen överstiger respektive cut-off värdet för kort lagring plasmaprover (1-5 veckor på − 80 ° C). Antalet överstiger nyckeltal för att vara betraktas positivt är 9 av 27 RD och PD, och 14 av 28 för RAD och PAD ( figur 3 A).
- Attribut till varje prov respektive MSC risknivån enligt följande: låg risk om RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg; intermediär risk om RD pos ∪ PD pos ∩ RAD neg ∩ PAD neg; eller hög risk om RAD pos ∪ PAD pos ( figur 3 B).
Representative Results
BioMILD rättegången är en prospektiv studie för tidig upptäckt av lungcancer med syfte att testa effektiviteten av ett kombinerat LDCT-MSC tillvägagångssätt som första linjens screeningtest i en stor kohort av storrökare individer. En klass av risk tillskrivs varje volontär på grundval av miRNA testet, som utvärderar förhållandet mellan 24 plasma cirkulerande microRNA. Som till stor del rapporterade30,31,32är hemolys en kritisk fråga för analys av cirkulerande miRNA, eftersom falska resultat kan erhållas på grund av en ospecifik release av MicroRNA av blodkroppar. I det föreslagna metodologiska arbetsflödet en pre analytisk kvalitetskontroll steg (QC1 i tabell 1) för att identifiera hemolyserade, och således icke-analyserbart, plasmaprover beskrevs. Figur 1 rapporterar en spektrofotometrisk analys av hemolyserade (figur 1A) och icke-hemolyserade (figur 1B) plasmaprover med respektive A414/A375 värden. I en klinisk kontext var resultatet av en molekylär test är avgörande för volontär förvaltning, denna QC1 tillåter upprepa blodprovstagning och, i de flesta fall återställa provet.
Efter molekylär bearbetning utvärderas RT-qPCR prestanda noggrant för att identifiera eventuella tekniska problem. Figur 2 A visar en RT-qPCR med en låg prestanda på grund av en dålig passiva referenssignal. I detta fall omlastning före förstärkning produkten till ett nytt mikroflödessystem rekommenderas. När den RT-qPCR presterar bra, som i figur 2B, kortet fortsätter till första inlägget analytisk kvalitetskontroll steg för att säkerställa att miRNA uttryckets värden är jämförbara med historiska mätningen (QC2 i tabell 1). Om steget QC2 misslyckas, ett tekniskt problem kan ha uppstått under omvänd Transkription eller i före förstärkning reaktioner, och det är bekvämt att upprepa hela molekylär behandling från omvänd Transkription.
Det sista steget för kvalitetskontroll (QC3 i tabell 1) utvärderar hemolys också på molekylär nivå. Uttrycksnivåerna för 4 erytrocyt-specifika MicroRNA (mir-16, mir-451, mir-486-5 p och mir-92a) jämfördes de 4 icke-hemolys relaterade MicroRNA (mir-126, mir-15b, mir-221 och mir-30b), generera hemolys-relaterade miRNA signaturen består av den 16 (4 x 4) miRNA nyckeltal. Positiva prov klassificeras som hemolyserade, medan negativa prover fortsätta till den slutliga MSC riskklassificeringen nivå som beskrivs i protokollet avsnitt 9 och figur 3.
Figur 1: Spektrofotometrisk analys av färska plasmaprover. Spektrofotometrisk profiler av (A), 2 hemolyserade och (B) 2 icke-hemolyserade plasmaprover, mäta absorbansen förhållandet mellan våglängder A414 och A375. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : RT-qPCR prestanda i ultrakalla kort analys. Förstärkning och multicomponent tomter jämföra (A) fattiga och (B) bra kvalitet mikroflödessystem kort. Alla 24 MicroRNA och en enda exemplifierar miRNA redovisas i varje panel. Flerkomponents tomterna illustrera passiva referens signaler som förekommer i dessa RT-qPCR-reaktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MSC algoritm för riskstratifiering. Representativa resultat med tanke på 6 plasmaprover från frivilliga inskrivna i BioMILD screening trial. (A) miRNA-nyckeltal signaturer av risken för sjukdom (RD), risk för aggressiv sjukdom (RAD), förekomst av sjukdom (PD), förekomst av aggressiv sjukdom (PAD) och motsvarande cut-off-värden (log2) för plasmaprover som lagras vid-80 ° C för vid minst 1 vecka och upp till 5 veckor. (B) kombination av de fyra signaturerna att stratifiera analyserbart prover i hög (H), intermediär (I) och låg (L) MSC risknivån. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Fallgropar och utmaningar av metodologiska arbetsflödet
BioMILD är den första prospektiva studien analysera cirkulerande MicroRNA som ett diagnostiskt verktyg, genererades cut-off används för dataanalys och tröskelvärden från retrospektiv serie. För att övervinna frågan om de olika lagringsintervall för plasmaprover, kan parametrarna förfinas att möjligen få en ökning av MSC prestanda. Ändå innan du börjar MicroRNA analys, flera aspekter av den övergripande processen måste utvärderas noggrant, såsom inklusionskriterierna, provtagning och behandling, och bioinformatik algoritmen antog för dataanalys. Följande avsnitt kommer att fokusera på de mest kritiska punkterna på det arbetsflöde som beskrivs i detta dokument, att ta itu med de stora frågorna för varje enskilt steg och sedan föreslå strategier för att övervinna dem.
Studiepopulationen
Registrering kriterierna för den BioMILD screening trial: 50-75 år gamla, tunga nuvarande eller tidigare (mindre än 10 år) rökare med minst 30 pack-år och ingen tidigare historia av cancer inom 5 år. I denna population var beräknad lung cancer prevalens och incidens per år omkring 1% 0,7%, respektive. För att applicera på MSC-prov som beskrivs i det föreslagna protokollet, bör befolkningen analyseras upprätthålla liknande egenskaper. I synnerhet steget i QC2 ovan beskrivna jämförelse med givna historiska uppgifterna från en liknande population. Medan en korrelation nedanför 97,5 kunde vara vägledande för tekniska problem, däremot, är de flesta individer med cirkulerande av miRNA förändrad återspeglar risken att få lungcancer faktiskt att tröskelvärdet. Med andra ord, om den QC2 stegen med parametrarna redovisas här tillämpas en befolkning på högre risk att utveckla lungcancer, kan utesluta godtagbara prover. Ny, korrekt referens parametrar bör sedan definieras som är specifika för varje population analyseras enligt förväntade resultat.
Blodinsamling och hemolys
Insamling av biologiska prover är ett avgörande före analytiska steg, eftersom det kan försämra prov kvalitet och egenskaper, och därmed ändra slutresultaten av analyserna. Om blodprov är det viktigt att samla in färskt blod och bearbeta preparatet så snabbt som möjligt. Prover bör varken lagras vid 4 ° C eller frysas efter blod tillbakadragande, eftersom frysning och upptining passager kan orsaka cell lysis (hemolys) och RNA nedbrytning. För att minimera hemolys processen, föreslås det för att separera plasma inom 2 h från blod insamling31 .
Hemolys är till stor del på grund av nedbrytning av röda blodkroppar (RBC) och påföljande frisättning av deras innehåll i den omgivande miljön. Detta kan vara ett problem för cirkulerande MicroRNA testning eftersom release av röda blodkroppar intracellulära innehåll dramatiskt förändrar mikroRNA profil i blod, som potentiellt påverkar riktigheten i plasma-baserad analys30.
Att kunna identifiera också minimal nivåer av hemolys i plasmaprover är avgörande för studier baserade på cirkulerande MicroRNA som biomarkörer. Hemolys kan initialt bedömas genom okulär besiktning, sen efter de två centrifugering stegen plasma färg kan variera från gul till röd för mycket hemolyserade prover. Enbart okulärbesiktning kan dock inte tillräckligt känslig för i samband med molekylär biomarkör forskning.
En enkel, före analytisk metod att identifiera hemolyserade plasmaprover är spektrofotometrisk mätning vid våglängd (λ) = 414 nm av huvudsakliga oxyhemoglobin peak absorbans, efter lämplig justering för någon annan källa till störningar. Av den anledningen vi normaliserade den 414 nm toppen absorptionsvärdet på 375 nm, vägledande den lipidic innehåll33. Alternativt, eller bättre, i kombination, en lipemi-independenthemolysis Poäng (HS) kan vara begagnade34. Proceduren spektrofotometriskt-baserade kan identifiera minst 6,1 mg/dL av fritt hemoglobin. Annars kan hemolyserade prover identifieras genom påvisande av erytrocyt-specifika microRNA. Eftersom även en mycket liten andel av hemolys kan framkalla en avsevärd ökning av erytrocyt-specifika miRNA nivåer32, identifieras Fortunato et al. en viss hemolys-relaterade signatur baserad på 16 MicroRNA-nyckeltal som kan effektivt klassificera hemolys i plasma prover33. Alla de nämnda analyserna kan användas i kombination sedan förhållandet absorbansen 414/375 eller HS antas i en pre analytisk fas sparar ytterligare kostnader, medan mätning hemolys-relaterade MicroRNA kan användas i en post analytisk fas som en kvalitetskontroll steg.
Cirkulerande MicroRNA isolering och RNA renhet
Utvinning RNA förfarande är ett mycket inflytelserikt steg för att lyckas med de efterföljande analyserna. Start från en låg ingång provet, såsom plasma, måste utvinning vara så effektiv som möjligt för att säkerställa en exakt kvantifiering av microRNA. Plasma kännetecknas av höga koncentrationer av många proteiner, inklusive nukleaser och andra komponenter som kan störa nedströms enzymatiska reaktioner av RT-qPCR och kunde påverka cirkulerande-MicroRNA upptäckt. Flera extraktionsmetoder har använts i dessa typer av studier, men i allmänhet, organiska utvinning följt av kisel-baserade RNA anrikning tillåter borttagning av plasma-hämmare bättre sedan TRIzol ensam35. Under de senaste åren, har dock manuell utvinning ersatts av automatiserade utvinning. Mindre risk för kontaminering, högre reproducerbarhet och ekonomisk tidsanvändning är de främsta fördelarna med automatiserade system jämfört med manuell isolering protokoll. Automatiserad extraktionsmetoder gav dessutom de högsta miRNA beloppen från blodprov och högsta effektivitet jämfört med manuell protokoll36.
Normalisering frågan
Normalisering av miRNA plasmanivåerna är fortfarande en kontroversiell fråga. Skillnader i provet kvalitet eller kvantitet kan faktiskt störa identifiering av verkliga förändringar i MicroRNA uttrycksnivåerna orsakas av närvaro eller risk för sjukdomar, och därmed leder till tvetydiga data tolkningar och vilseledande slutsatser. Avsaknaden av samförstånd har hittills resulterat i olika normalisering strategier37.
Total-RNA extraherade från plasmaprover är vanligtvis under tröskelvärdet på standard kvantifiering metoder såsom UV spektrofotometri eller fluorescens-baserade spektrofotometri, utgör således hinder RNA massa standardisering38. Följaktligen, en fast volym i stället för ett fast belopp på eluerade RNA bör väljas som indata för RT reaktion39.
Städning avskrifter för miRNA analys i vävnadsprover, är som RNU48 och RNU6, inte lämpliga för att normalisera extracellulära miRNA mätningar, eftersom de båda inte är alltid påvisas i cirkulation, på grund av RNase-medierad nedbrytning40, och är också avregleras i en sjukdomsspecifik sätt37. Det är oklart om någon cirkulerande MicroRNA kan effektivt användas som referens kontroller. Till exempel föreslås miR-16 ofta för städning, men dolika studier har visat att det är avreglerade i plasmaprover av cancer patienter28,37. Dessutom påverkas mycket miR-16 nivåer av hemolys30.
För hög genomströmning analyser mäta flera MicroRNA och normalisera på genomsnittlig Uttryckets värde är allmänt accepterade41, när ett begränsat antal MicroRNA behöver analyseras, kan inte detta normalisering tillvägagångssätt tillämpas. För att kringgå problemet normalisering, fastställts Boeri et al. tidigare en algoritm baserad på ömsesidiga nyckeltal bland 24 MicroRNA28. En sådan strategi, trots att de är mycket användbara för utvecklingen av diagnosinstrumentet, tillåter inte enkelt skilja effektivt förändrat MicroRNA som möjligen har en roll i tumörutveckling och därmed identifierar MicroRNA som fungerande kalibratorer. En annan effektiv strategi, antogs av gruppen av Bianchi et al. som utvecklat ett serum miR-Test för tidig upptäckt i lung cancer, baserades på normalisering på det geometriska medelvärdet av en grupp av 6 ”städning serum-MicroRNA” varierande mindre bland prover och klasser av patienter42.
Dragen av miRNA-baserade Liquid Biopsy och potentiella tillämpning
Plasma-baserade MSC är en molekylär icke-invasiva testet studerade för tidig diagnos av lungcancer hos storrökare. MSC testet kan identifiera mellanliggande eller riskfyllda ämnen innan lung cancer upptäckt av LDCT, med hög känslighet (SE, 87%) och negativt prediktivt värde (NPV, 99%). Specifikt, kunde MSC genomföra LDCT screening genom att minska falskt positiva resultat till 3,7%, från 19,7% för LDCT ensam29. MSC testet har också visat sig ha en god prognostisk prestanda när man överväger bara lung cancerpatienter, och kan användas som ett övervakningsverktyg ensamt eller i kombination med andra kliniska patologiska parametrar43,44. Potentiellt, kunde MSC testet aktivera större konsekvens av lung cancer diagnostiska algoritmer, vilket minskar screening kostnadseffektivitet.
Förutom MSC, har andra icke-invasiva tester för tidig lung cancer upptäckt rapporterats. Bianchi et al. föreslog en cirkulerande miR-Test baserat på en 34-miRNA signatur45, sedan minskas det till en 13 miRNA signatur42. Serum prover fordiscovery och validering erhölls från kontinuerlig Observation av rökning försökspersoner (kosmos) LDCT screening trial, utförs på den Europeiska institutet för onkologi (IEO, Milano, Italien). MiR-testet visade 78% noggrannhet för lung cancer upptäckt i högriskområden volontärer. Mellan de 13 serum-MicroRNA och 24 komponera MSC, endast 5 MicroRNA överlappande (miR-92a, miR-30b, miR - 30c, miR-148a och miR-140-5 p). Detta kunde bero på att olika typer av börjar prover (serum vs. plasma) och data utarbetandet. I själva verket för miR-Test ingick de författarna valda 6 MicroRNA beter sig som städning i serum, varav 3 också bland de MSC miRNA nyckeltal (miR-15b, miR-19b och miR-197). Ändå, MSC i plasma och miR-testet i serumprov mer djupt validera användningen av miRNA-baserade flytande biopsi för upptäckt av lungcancer.
MiRNA profilering för identifikation av lung cancer markörer har också utförts på sputum prover46. Sputum kan samlas enkelt och miRNA uttryck nivåer verkar vara extremt stabil i den. Men lung cancer screening volontärer är äldre än 50-55 år och är storrökare med komorbiditet såsom kol, vilket gör slem som är svårt att få. Faktiskt bland de olika kroppsvätskorna, plasma är en av de bästa alternativen att undersöka den potentiella rollen som MicroRNA som (men inte begränsat till) lung cancer biomarkörer.
Övergripande, det förfarande som beskrivs i detta dokument kan vara relevanta i samband med olika sjukdomar, med nej begränsningen i typ av patologi undersökt (från cancer, nervsystemet och hjärt-och kärlsjukdomar eller diabetes) och i syfte att klinisk användning (en biomarkör för diagnos, prognos eller ens behandlingssvaret).
Disclosures
Gabriella Sozzi, Mattia Boeri och Ugo Pastorino är samtidig uppfinnare av tre patentansökningar som licensierad till Gensignia Life Sciences, angående miRNA signaturen avslöjas i denna artikel. Alla återstående författarna förklarar inga intressekonflikter i förhållande till det arbete som läggs upp.
Acknowledgments
Författarna tackar Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, och Chiara Banfi för hantering volontärer i prövningar och för administrativt stöd; och Claudio Jacomelli och Claudio Citterio för datahantering. Arbetet stöddes av den italienska föreningen för cancerforskning [utredare bidrag nr 15928 till UP, 14318 till GS och 12162 (särskilt Program ”innovativa verktyg för Cancer riskbedömning och tidig diagnos”, 5 x 1000)]; Italienska hälsoministeriet [Grant nr. RF-2010]. Bevilja UO1 CA166905 från National Cancer Institute (USA). MB stöddes av en Fondazione Pezcoller gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Lonza | BE-17-516 | |
| 20xTE Buffer, pH 8.0 | Molecular probe | T11493 | Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of 0,1X in Nuclease-free water |
| Nuclease-free water | |||
| Maxwell RSC miRNA Tissue Kit | Promega | AS1460 | The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet. |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4366596 | |
| Custom TaqMan RT Primer Pool | Thermo Fisher | 4459649 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix 2X | Thermo Fisher | 4391128 | |
| Custom TaqMan PreAmp pool | Thermo Fisher | 4459657 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x | Thermo Fisher | 4440048 | |
| Custom TaqMan Array MicroRNA Cards | Thermo Fisher | 4449137 | Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples |
| Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367286-364815 | |
| Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube. | Becton Dickinson | 366643 | Lavender BD Hemogard closure |
| Cuvette PS semi-micro | VWR/PBI | 643-0326 | Light path 10 mm |
| NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Cryogenic vials 1.5 ml | Sigma-Aldrich | Z359033 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection | |
| Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge | Thermo Fisher | D-37520 | |
| Vortex Mixer | Velp Scientifica | F202A0173 | |
| ThermoMixer T- shaker | Euroclone | A00564 | Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA extraction |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | |
| GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler | Thermo Fisher | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| ViiA 7 RUO software | Thermo Fisher | ||
| Arrey Card Staker/Sealer | Thermo Fisher | 4331770 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
- Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
- Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
- Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
- Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
- Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
- Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
- Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
- Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
- Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
- Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
- Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
- Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
- Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
- Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
- Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
- Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
- Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
- Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
- Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
- Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
- Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
- Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
- Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
- Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
- Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
- Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
- Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
- Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
- Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
- Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
- Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).
