Summary
פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.
Abstract
חומצת גרעין Non-קנונית מבנה שניוני ש-g-quadruplexes (G4) מעורבים תהליכים תאיים מגוונים, כגון שכפול ה-DNA, שעתוק, עיבוד RNA טלומר התארכות. במהלך תהליכים אלה, חלבונים שונים לאגד ולפתור G4 מבנים לביצוע תפקידם. הפונקציה של G4 תלוי לעתים קרובות היציבות של מבנהו מקופל, חשוב לחקור כיצד G4 מחייב חלבונים להסדיר את היציבות G4. עבודה זו מציגה שיטה לטיפול יחיד מולקולות G4 באמצעות פינצטה מגנטי, אשר מאפשרת לימודים של ויסות G4 מחייב חלבונים על מולקולה בודדת G4 בזמן אמת. באופן כללי, שיטה זו מתאימה בהיקף רחב של יישומים מחקרים עבור אינטראקציות חלבונים/ליגנדים והתקנות על מבנים משניים שונים DNA או RNA.
Introduction
ארבע גדילי ה-DNA או RNA G4 מבנים לשחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים חשובים רבים1. חלבונים רבים מעורבים G4 איגוד ורגולציה, כולל טלומר מחייב חלבונים (טלומראז, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, גורמי שעתוק (nucleolin, PARP1)3, RNA עיבוד חלבונים (hnRNP A1, hnRNP A2)4helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, שכפול ה-DNA קשורים חלבונים (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. חלבון מחייב ניתן לייצב או יציבות מבנים G4; במטרה לווסת את תפקודים ביולוגיים הבאים. היציבות G4 נמדדה על ידי תרמי התכה באמצעות אולטרה סגול (UV) או שיטות קיווטות (CD)7. עם זאת, בתנאים כאלה אינם פיזיולוגיים הרלוונטיים קשים להחיל על הלומדים את ההשפעות של איגוד חלבונים7.
ההתפתחות המהירה בטכנולוגיות מולקולה בודדת מניפולציה אפשרה מחקרים של קיפול, התגלגלות של biomolecule, כמו של ה-DNA או חלבון, ברמה מולקולה בודדת עם רזולוציה ננומטר בזמן אמת8. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מלקחיים אופטיים, פינצטה מגנטי הם שיטות מניפולציה מולקולה אחת הנפוצות ביותר. לעומת AFM ומלקחיים אופטיים9, פינצטה מגנטי אפשר מדידות יציב של קיפול-התגלגלות הדינמיקה של מולקולה בודדת בימים באמצעות טכניקה הסחף נגד10,11.
כאן, פלטפורמה מניפולציה מולקולה בודדת באמצעות פינצטה מגנטי ללמוד ויסות G4 יציבות על ידי איגוד חלבונים הוא דיווח12,13. עבודה זו מתווה את הגישות הבסיסיות, כולל הכנה ערוץ מדגם וזרימה, ההגדרה של פינצטה מגנטי הכיול כוח. את הפקד כוח ואת הפרוטוקולים הסחף נגד כפי שמתואר בשלב 3 לאפשר זמן זמן מדידות תחת בקרת כוח שונים, כגון כוח קבוע (כוח קלאמפ) ואת קבוע טעינת לדרג (חיל-שיפוע) כוח-לקפוץ המדידה שלך. פרוטוקול כיול כוח המתוארים בשלב 4 מאפשרת כיול כוח של < 1 מיקרומטר היתדות קצר על כוח רחב טווח pN עד 100, עם השגיאה היחסית בתוך 10%. דוגמה של רגולציה היציבות של הליקאז RNA הקשורים AU-עשיר אלמנט (RHAU) הליקאז (כינוי DHX36, G4R1) משחק תפקידים חיוניים בפתרון ש-g4 RNA משמשת כדי להדגים את היישומים של זו פלטפורמה13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של G4 ה-DNA של מולקולה בודדת מתיחות
- הכן 5 '-תיול שכותרתו ו- 5 '-ביוטין תווית dsDNA מטפל באמצעות PCR באמצעות פולימראז DDNA על תבנית ה-DNA phage למבדא באמצעות 5 '-תיול ו- 5 '-ביוטין תחל 14 ( איור 1). שתי ידיות dsDNA יש תכולה גבוהה של GC (> 60%) כדי למנוע ה-DNA נמס כאשר DNA מתקיים לעבר כוחות גבוהה או במהלך מתיחת DNA מעבר 15.
- מוצרים PCR לטהר באמצעות ערכת טיהור מסחרי תקציר עם BstXI אנזים הגבלה על פי היצרן ' פרוטוקול s.
- SsDNA ויוצרים מאתרים ומפסיקים G4, וידיות האגף ssDNA ו- dsDNA באמצעות T4 DNA ליגאז לפי היצרן ' פרוטוקול s. לטהר את המוצר מחוברים על ידי ג'ל חילוץ באמצעות ערכת טיהור מסחרי על פי היצרן ' פרוטוקול s.
2. הכנת תזרים ערוץ
- Coverslip וניקוי השטח functionalization
- המקום למטה coverslips (1.5 #, 22 מ מ × 32 מ מ), העליון coverslips (1.5 #, 20 מ מ x 20 מ מ) לתוך כיסוי זכוכית מכתים צנצנות (כל צנצנת יכול להחזיק 7 חתיכות coverslips, עוצמת הקול ~ 20 מ ל). לשטוף את coverslips בצנצנות עם מים מזוקקים 2 - 5 פעמים.
- הוסף ~ 20 מיליליטר 5-40% פתרון דטרגנט לתוך כל צנצנת, ולאחר מכן מקם באמבט ניקוי אולטראסוניות במשך 30 דקות לשטוף עם מים מזוקקים עבור > 10 פעמים כדי להסיר את הנוזל.
- יבש על coverslips בצנצנות בתנור (~ 150 ° C; זהירות, חם), או על ידי גז 2 N. לאחסן את coverslips העליון יבשים בארון יבש.
- שימוש פלזמה (O 2 גז) כדי לנקות את coverslips בצנצנת במשך 10 דקות. במהלך 10 דקות, להכין 20 מ של 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) פתרון מתנול (זהירות, רעילים/דליק). השתמש ברדס fume כימי כדי להמיס APTES מתנול.
הערה: למנוע לחות בעת אחסון APTES פתרון. APTES הישן גורם לעיתים קרובות בעיה ב functionalizing משטח של coverslips. - מיד לאחר פלזמה ניקוי, להוסיף את כל הפתרון APTES 1% לתוך הצנצנות, דגירה עבור ה 1 לשפוך את הפסולת לתוך הבקבוק פסולת ספציפיות עבור 1% APTES מתנול. לבצע את הפעולות הקשורות מתנול בשכונה fume כימיקלים דליקים.
- לשטוף את הצנצנות פעם אחת עם מתנול, > 10 פעמים עם מים מזוקקים ולאחר מכן יבש על ידי תנור (~ 150 ° C; זהירות, חם). לאחסן את coverslips התחתון מצופה APTES בארון יבש, אם לא נמצא בשימוש במשך שבועיים עד.
הערה: כל תת שלב מ 2.1.1 2.1.4, תהליך הניקוי ניתן להשהות לפני השלב הבא.
- להרכיב ערוץ הזרימה
- להכין שני " מפרידי ", דהיינו, מצלמות-מיקרוסקופים או דו-צדדית קלטת (~ 4 מ מ × 20 מ מ) לכל ערוץ. במקום שתי חתיכות של מפרידי על coverslip התחתונה לאורך זמן-הקצה. במקום של coverslip העליון על מרווח, ויוצרים תא זרימה בין (~ 10 מ"מ × 20 מ"מ באזור, איור 2 א , ב').
- אם מצלמות-מיקרוסקופים משמשת כרווח, מקם את ערוץ הזרימה על הגל (60-120 מעלות צלזיוס; זהירות, חם) עבור 5-10 s בעת לחיצה בעדינות את צידי coverslip העליון להתאחד על coverslips שני על ידי מצלמות-מיקרוסקופים. ערוץ הזרימה וכתוצאה מכך יש לגובה של ~ 100 מיקרומטר, ובכך היא אמצעי האחסון של הערוץ ~ 20 µL-
- חותם האורכי של הערוץ עם דבק סיליקון למניעת דליפה. להשתמש בדבק סיליקון לבצע מבנה דמוי כיור קטן לכל אחד מקצות הערוץ זרימה, אשר משמש כניסה ויציאה של פתרון פתוח.
הערה: הכניסות והיציאות יכולים להתבצע גם על ידי דרכים אחרות, למשל, על ידי הקפדה טבעות פלסטיק קטנות באמצעות שעווה. - לאחסן ערוצי בארון יבש עד 4 שבועות.
- הקשר DNA על גבי המשטח התחתון של ערוץ הזרימה
- לדלל את חרוזי פוליסטירן אמינו מצופים (קוטר: 3 מיקרומטר) על ידי 200 X מזוקקים 1 X פוספט buffered מלוחים (PBS) מאגר. מערבולת הפתרון חרוז וזרימה ואז לתוך ערוצי. דגירה הפתרון חרוז ערוצים עבור ~ 30 דקות להסיר את כל החרוזים שניתק בשטיפה עם 200 µL מאגר X PBS 1-
- התאם (הגדלה/הקטנה) זמן הדגירה כדי להשיג צפיפות המשטח של 1-5 חרוזים לכל אזור 50 מ"מ x 50 מ"מ. לאחסן את ערוצי הופקד עם החרוזים הפניה עד 3 ימים.
- Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) אבקת ציקלוהקסאן-1-carboxylate (Sulfo-SMCC) בתוך תמיסת X PBS 1 (~ 0.5 מ"ג/מ"ל). מערבולת הפתרון וזרימה ואז לתוך הערוץ.
הערה: להכין טרי Sulfo-SMCC פתרון לפני השימוש, להוסיף מיד את הערוץ כדי להימנע hydrolyzation של SMCC. - Incubate הפתרון SMCC בערוץ במשך 30 דקות להסיר את הפתרון SMCC על-ידי כביסה עם כמות גדולה (1 מ"ל, ~ 50 X האחסון ערוץ) של פתרון X PBS 1-
הערה: יש לשטוף את SMCC עודף בקפידה. השלב זה חיוני מאוד עבור האיגוד של ה-DNA על coverslip. - קשירת דנ א
- לדלל את תווית ה-DNA לתוך PBS X 1, עם ריכוז ה-DNA שנוצר של תיול-ביוטין ~ 0.3 ננומטר. פיפטה בעדינות לערבב את הפתרון, לזרום הפתרון DNA לתוך התעלה מצופה SMCC של תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (~ 23 ° C).
- בעדינות לשטוף DNA חופשי עם 200 µL של חסימת פתרון שמכיל PBS X 1 עם 10 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) ו 0.01% מרקפטואתנול.
- לחסום על פני ערוץ על-ידי המקננת הערוץ בחסימה פתרון (10 mg/mL BSA, 0.01% מרקפטואתנול) עבור > 2 h; אחרי זה צעד, הערוץ יהיה מוכן לניסויים. ניתן לשמור את הערוץ מוכן ב 4 ° C עבור ~ 1 יום.
הערה: השלב חסימה חשוב להפחתת הכריכה לא ספציפית של DNA ו beads מגנטי coverslips.
3. DsDNA ההתקנה פינצטה, זיהוי של רווק מגנטית הקשר
- ההתקנה פינצטה מגנטי
- התחל המגנטי פינצטה לשלוט תוכנית. . כאן, הפינצטה מגנטי נשלטו בידי תוכנית LabVIEW in-הבית בכתב.
- יישר את מרכזי מגנט לפני שיקימו את הערוץ. להשתמש עדשה המטרה X 4 כדי להתאים את x - ו y ציר של המגנטים ציר אופטי של המיקרוסקופ.
- השתמש תחמן ממונע מבוקר-מחשב כדי להעביר את המגנטים לאורך בכיוון z ( איור 2 א) לקבוע את המרחק d = 0 (d: המרחק בין מגנטים coverslip) כאשר מייחסים המגנטים coverslip על המיקרוסקופ.
- לתכנת את התנועה של המגנטים דרך manipulator כדי להשיג שליטה על הכוח, כולל כוח קבוע (כלומר, קבוע d), הזמן משתנה כוח F (t) (כלומר, הזמן משתנה (t-d )).
- השתמש בהיר מקור אור דיודות פולטות אור (LED) עבור מפוזרים בחזרה תאורה של החרוז דרך המטרה. לאסוף את התמונות חרוז בקצב דגימה של 100 הרץ באמצעות מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD). < /lאני >
- לטעום ההתקנה ולזהות הקשר יחיד dsDNA
- היווצרות הקשר
- בעדינות הזרימה ב- 200 X מדולל חרוזים M-280, פאראמגנטיים בפתרון assay (100 מ מ, אשלגן כלורי 2 מ מ MgCl 2, 10 מ מ טריס-pH 7.4 ) לתוך ערוץ. תקופת דגירה של 10 דקות לאפשר את החרוזים לאגד התווית על-ידי ביוטין במולקולות דנ א ותשמרו על המשטח מצופה SMCC עד הסוף התווית על-ידי תיול. בעדינות לשטוף חרוזים לא קשור באמצעות µL 200 של התגובה השגרתית פתרון.
הערה: החרוזים M-280 להראות נמוכה יותר מחייב שאינם ספציפיים השטח בהשוואה beads מגנטי מסחריים אחרים כגון M-270.
- בעדינות הזרימה ב- 200 X מדולל חרוזים M-280, פאראמגנטיים בפתרון assay (100 מ מ, אשלגן כלורי 2 מ מ MgCl 2, 10 מ מ טריס-pH 7.4 ) לתוך ערוץ. תקופת דגירה של 10 דקות לאפשר את החרוזים לאגד התווית על-ידי ביוטין במולקולות דנ א ותשמרו על המשטח מצופה SMCC עד הסוף התווית על-ידי תיול. בעדינות לשטוף חרוזים לא קשור באמצעות µL 200 של התגובה השגרתית פתרון.
- הר התעלה לבמה מיקרוסקופ. לחפש החרוזים על המשטח התחתון באמצעות ה-100 X שמן טבילה המטרה.
- בחר חרוז הפניה על פני השטח ואת חרוז קשור נע. בניית ספריות תמונה ראשונית של הפניה חרוז והן חרוז קשור לעבר המטוסים defocus בשכבות שונות.
- כיול של חרוזים תמונה
- לפני הניסויים, להשתמש למפעיל piezo אובייקטיבית של כדי להשיג כמה תמונות של הפניה והן חרוזים קשור לעבר המטוסים defocus בשכבות שונות במרווחים מאת nm 20-50, אשר מאוחסנים כתמונה נפרדת חרוז שני ספריות והם באינדקס בהתאמה עם המרחק defocus בשכבות ( איור דו-ממדי).
- x, y, z עמדה נחישות
- במהלך הניסויים, לקבוע את המיקום של החרוז במישור x-y מאת centroid חרוז. לקבוע את שינוי גובה חרוז קשור על-ידי השוואת התמונה הנוכחית חרוז עם אלה המאוחסנים בספריה. השתמש בהצגת הניתוח פונקציית auto-המתאם של הספקטרום כוח של התמרת פורייה של ה-תמונות חרוז 16.
- הסחף נגד משוב באמצעות הפניה חרוז
- במהלך הניסויים, להשתמש את piezo כדי " לנעול " המרחק בין המטרה לבין תמונת חרוז ייחוס ספציפי מאוחסן בספריה דרך תדר נמוך משוב בקרה, כך שהתמונה חרוז תקוע יש המתאם הטוב ביותר עם תמונה מסוימת המאוחסנים בספריה ( איור דו-ממדי).
- לקבוע אם הכבל הוא מולקולה בודדת dsDNA על-ידי החלת ~ 65 pN כוח לקבוע מולקולה בודדת dsDNA אם הכבל עובר את ה-DNA האופיינית מתיחת המעבר 17 , 18 , 19. חזור על התהליך עד רצועה בארוך dsDNA יחיד. (עיין בסעיף הבא לקבלת DNA מתיחת המעבר וניסוי כוח).
- היווצרות הקשר
4. כיול פינצטה כוח מגנטי
- ישירות לקבוע הכוח (עד 100 pN) עבור זמן במולקולות דנ א (48,502 bp λ-DNA) באמצעות חרוז התנודות באמצעות:
, איפה k B הוא קבוע בולצמן, T היא הטמפרטורה של סולם קלווין, אלפא 2 y הוא השונות של התנודות חרוז בכיוון בניצב השדה המגנטי ואת הכוח כיוון. בכיוון זה, ניתן לתאר את התנועה של החרוז כמו תנודות המטוטלת באורך l + r 0, כאשר l הוא המרחק מקצה-לקצה לאורך הכיוון כוח (סיומת) של ה-DNA ו- r 0 הוא הרדיוס של חרוז 10 ( איור 3 א). - לקבוע עקומת כיול עבור כוח F כפונקציה של מגנטים חרוז מרחק d ו- F (d) עבור חרוזים שונים באמצעות λ ארוך-דנ א. בדרך כלל, המרחק בין המגנט את coverslip משמש אורך הקשר DNA ניתן להתעלם. להתאים את F-עקומת d על-ידי הפונקציה דעיכה מעריכית-כפול:
, איפה ההתאמה בפרמטרים α1, α2, γ1, γ2 נקבעים על-ידי פינצטה מגנטי ובפרמטר C נקבעת על-ידי המאפיין הטרוגנית של חרוזים מגנטי. על ידי הסטה של C, F-עקומת d המתקבל חרוזים שונים יכול להיות חופף 10 ( איור 3B). - כיול של פרמטר C עבור הפרט beads מגנטי עבור הדי קצר ניסויים.
- קביעת הכוח המבוסס על התנודות דורש הקלטה המיקום חרוז בתדר גבוה יותר מאשר תדירות פינה:
, כאשר γ הוא לגרור את מקדם של החרוז. הדי קצר לעבר כוח גבוה, זה דורש הקלטה תדירות מהר יותר מאשר 100 הרץ, לכן, הכוח ישירות נמדד בהתבסס על תנודות עם המצלמה. עם זאת, הפרמטר C יכול להיקבע על ידי מדידת כוח בטמפרטורות נמוכות לאלץ טווח (< 15 pN) תנודות ושימוש הולם את הנתונים עם מכוילת F-עקומת d כדי להשיג את הפרמטר ג 20. - . לחלופין, לניסויים עם dsDNA, לקבוע את הפרמטר C באמצעות DNA מתיחת מיגדרי לכח ~ pN ( איור 3C) 65 21 , 22 , 23 מאת הקלטה המיקום d-איזו קפיצה סיומת הראה dsDNA (0.6 X אורך הגדלה של אורך מתאר). לאחר קביעת הפרמטר C, לחשב את כוח החרוזים קשור.
- קביעת הכוח המבוסס על התנודות דורש הקלטה המיקום חרוז בתדר גבוה יותר מאשר תדירות פינה:
- לשלוט על קצב הטעינה באמצעות תכנות התנועה של המגנטים באמצעות הפונקציה ההופכית של F (d). המגנט תתקרב המדגם זוגי אקספוננציאלית.
הערה: השגיאה היחסית של כוח נקבע על ידי כזה בשיטת אקסטרפולציה היא ~ 10%, והיא נגרמת בעיקר על ידי הטרוגניות הרדיוס 20 חרוז.
5. מולקולה בודדת מניפולציה של G4 נוכחות, היעדרות של חלבונים איגוד
- כוח-שיפוע ניסויים
- לאחר שזיהו את הכבל dsDNA, לבצע סריקה כוח-עלייה בקצב הטעינה של 0.2 pN/s ואחריו סריקת כוח-ז ל--0.2 pN/s. לאחר כל מחזור מתיחה, להחזיק את ה-dna על pN 1 ל 30 s כדי לאפשר את ssDNA לקפל ל G4.
- כוח-לקפוץ ניסויים
- מחזור הכוח בין pN 54 ב-30 s שתחתיו G4 מקופל יכול להיות פרש, ו- pN 1 עבור בשנות ה-60, תחת אשר יכול לקפל מקופל G4-15T.
- לזרום חלבון פתרון
- לזרום הפתרון חלבון כאשר אתה נמצא ~ 20 כוח pN כדי למנוע את הקובץ המצורף של החרוזים coverslip. הליקאז דעה-box RHAU, אשר הראו ירידה לפרטים גבוה למבנה G4, היה בשימוש 24. רקומביננטי melanogaster דרוזופילה RHAU (DmRHAU) הליקאז היה לידי ביטוי Escherichia coli וטיהרו כפי שתואר לעיל 25. G4 פעילות ליהנות מבריכה חיצונית גדולה של DmRHAU היה לבדיקה על tetramolecular ה-DNA G4 המצע 13.
- לנתח הכוח התגלגלות באמצעות שבאתר כתוב תוכנית Matlab 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגדרת הניסוי למתיחת מולקולה בודדת G4 מוצג באיור4. חד-גדילי G4 ויוצרים רצף המורחב בין שתי ידיות dsDNA הייתה קשורה בין coverslip של חרוז פאראמגנטיים. כדי לחפש חרוז קשור dsDNA יחיד, overstretching assay בוצעה על ידי הגדלת הכוח במחירים טעינה קבועה. שלושה סוגי מדידות שימשו לעיתים קרובות לומדים את הקיפול, התגלגלות של מולקולות: מדידת כוח קבוע (i), (ii) כוח-סרגל מדידה של מדידה (iii) כוח-לקפוץ. בשל שיעור התגלגלות איטי מאוד של מבנה זה G4, האיזון קיפול-התגלגלות המעבר יכול להתרחש רק בפעם הימים, אז כבש כוח, כוח-לקפוץ מדידות שימשו אפיון את התגלגלות קינטיקה והיציבות של G4 מבנים.
מידות כוח-כבש עבור G4 התגלגלות in נוכחות או היעדרות של חלבון RHAU:
איור 4B מראה כוח-סיומת אופיינית עקומות מתקבל על ידי עלייה כוח לסרוק בקצב הטעינה של 0.2 pN/s ואחריו סריקת כוח-ז ל--0.2 pN/s. לאחר כל מחזור מתיחה, מולקולת הדנ א נערך ב- pN 1 ל 30 s כדי לאפשר ssDNA לקפל ל G4. הקפיצה סיומת שנסרקו כוח-גידול מצוינת של המעבר התגלגלות של G4. בעת שימוש ברצף ויוצרים שאינם G4, לא יכול להיות שנצפו הקפיצה סיומת פתאומית. התפלגות כוח התגלגלות יכולה להיות מושגת על ידי הקלטה לכוחות אשר התרחשה התגלגלות. התגלגלות לכפות חלוקת G4-15T שהושג ב 0.2 pN/s הגיע לשיא יחיד ב ~ 52 pN. עם זאת, בנוכחות 10 nM RHAU, G4-15T נשאר מקופל במהלך הסריקה כוח-עלייה של עד 60 pN, ייצוב G4 אנלוגיים על-ידי איגוד RHAU. בנוכחות nM RHAU 10 עד 1 מ מ ATP, התפלגות כוח התגלגלות היה מוזז על כוח התחתונה, מעידה על הקשורה תלויית ATP של G4 על-ידי RHAU.
כוח-לקפוץ מדידות של G4 התגלגלות in נוכחות או היעדרות של חלבון RHAU:
איור 5 מראה עקבות נציג של הגובה חרוז בזמן כוח-לקפוץ ארבעה מחזורים (איור 5, פאנל שמאלי); לחיל. מוחל על המולקולה היה רכב על אופניים בין pN 54 ב-30 s שתחתיו G4 מקופל יכול להיות פרש, ו 1 pN 60 s שתחתיו G4-15T מקופל יכול לקפל. היה אורך החיים הממוצע של מקופלת G4-15T-54 pN ~ 6.4 s, מוערך על ידי התאמת היסטוגרמה לכל החיים עם פונקציה דעיכה מעריכית13. לאחר זורם בתמיסה של הליקאז RHAU nM 10 ללא ATP, ההרחבה של DNA קשור נשאר ברמה מקופל לאורך כל הזמן מחזיק s 30-54 pN, המציין RHAU בחום מייצבת המבנה G4-15T נגד מכני התגלגלות in העדר ATP. לאחר שתזרים 10 nM RHAU עד 1 מ מ ATP, ההרחבה של המולקולה אותו מיד אחרי קפיצה מ 1 pN כדי 54 pN היה ברמה של ssDNA פרש, המציין RHAU שיערער את מבנה G4 בנוכחות ATP.
איור 1: הכנה של ה-DNA G4 לניסויים מתיחה מולקולה בודדת.
ידיות dsDNA הוכנו על ידי ה-PCR באמצעות תחל 5'-תיול ו- 5'-ביוטין. מוצרי ה-PCR היו מטוהרים, מתעכל עם האנזים הגבלה BstXI, היו מטוהרת על-ידי מיצוי ג'ל. SsDNA ויוצרים G4, שניים לאגף ssDNA, ידית dsDNA היו מאתרים באמצעות T4 DNA ליגאז. המוצר מחוברים היה טהור על ידי ג'ל החילוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שרטוטים של המנגנון הבסיסי פינצטה מגנטי.
סקיצה (A) של ערוץ הזרימה עם זוג מגנטים הממוקמת מעל מטרה מיקרוסקופ הממוקמת מתחת. סקיצה (B) של ערוץ הזרימה שהורכב שבו המלבנים בצבע כחול לייצג את coverslips העליונים והתחתונים, קווים אפורים אליפטית לייצג את כניסה ויציאה של ערוץ הזרימה. (ג) סקיצה של יצירת כח, כיול של ההתקנה פינצטה מגנטי. (ד) דוגמאות של תמונות של הפניה חרוז והן חרוז מרגש ברמות שונות והתבקשתי המוקד תפקידים בספריות תמונות חרוז. הסימן האדום מסמל תמונת ייחוס חרוז שהושג מסוימת דה-המוקד מטוס-נעילת במישור המוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: כוח כיול של פינצטה מגנטי.
כיול (A) של כוח באמצעות סמך תנודות של חרוז לאורך כיוון y ללא סיבוב. ציר ה-x נמצא באותו כיוון השדה המגנטי. כוח לאורך ציר z ונשלט על-ידי כוונון המרחק, d, בין הזוג מגנט קבוע של coverslip. כיול (B) של שימוש 48,502 ארוכה של bp-DNA. המאפיין הטרוגנית חרוז מגנטי יכול להיות מתואר על ידי מודיע משטרתי פרמטר אחד איור זה השתנה מ-10. (ג) כיול של פרמטר C של חרוז מגנטי המחובר kb 2-הדנ א באמצעות B ל- S מתיחת המעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מולקולה בודדת מניפולציה של G4.
(א) סקיצה של מתיחות מבנה בודד G4 ו מדידה האירועים התגלגלות. (B) דוגמה טיפוסית של כוח-עלייה (ציאן), ירידה בכוח. עיקול G4 קשור. איור זה השתנה מ12. (ג) עקומת כוח-סיומת של G4 העדר (אפור) או נוכחות (ורוד) של חלבון RHAU. (ד) התפתחות לכפות חלוקת G4 בהיעדר (אפור) (n = 140) או נוכחות של RHAU ו- ATP (אדום) (n = 117). איור זה השתנה מ13. נא לחץכאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מדידות כוח-לקפוץ G4 מתוכה.
(א) עקבות הזמן נציג של שינוי גובה חרוז במהלך כוח לקפוץ מחזורים בין 1 pN 54 pN נמדד ללא DmRHAU, עם 10 nM DmRHAU אבל ללא ATP, ועם 10 nM DmRHAU והן 1 מ מ ATP, כפי שצוין בחלונית ' איור '. (B) זמן נציג סימן שינוי סיומת של מולקולה G4 (נתונים אפור) לאחר קפיצה כדי 54 pN מספר מחזורים כוח-לקפוץ שנלקחו נתונים ב- (א). הסיומת המתאימה מקופל (נ), G4 (U) פרש גם מסומנים; האירועים ייפתחו G4 מסומנים באמצעות החצים. איור זה השתנה מ13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמתואר לעיל, פלטפורמה עבור הלומדים את יציבות מכנית של ה-DNA G4 ו את האינטראקציות של חלבון ל G4 באמצעות פינצטה מגנטי מולקולה בודדת הוא דיווח. המלווה את הפלטפורמה, פרוטוקולים יעילים ביותר למציאת הקשר G4 DNA, מדידה של הדינמיקות קיפול-התגלגלות ויציבות המבנה G4 עם רזולוציה מיוחד ננומטר מפותחים. נעילת במישור המוקד מאפשר שליטה הסחף נגד יציב מאוד, וזה חשוב לזיהוי שינוי מבנה קטן כגון G4 (שלב גודל ~ 7 ננומטר) ואינטראקציות עם חלבונים בניסויים מאגר exchange. פלטפורמה זו לאחרונה נוקטים מחקרים של הדינמיקות מתקפלים, התגלגלות של telomeric G414 ו- c-Myc יזם G412, כמו גם מחקרים של G4 מחייב חלבון RHAU הליקאז13.
שגיאת ניסוי טיפוסי הכריכה לא ספציפית של DNA וחרוזים על coverslip או DNAs מרובים לאגד beads מגנטי. כדי להפחית את האיגוד לא ספציפית, ראשית, האחסון של כימיקלים כגון APTES ו- SMCC צריך להיבדק באופן שגרתי. שנית, חשוב לבחור את סוג חרוז מגנטי המתאים ולחסום את האיגוד לא ספציפית. באמצעות מאגר 10 מ"ג/מ"ל BSA או oligo דנ א קטנים, כגון פולי T, כדי לחסום את השטח הידרופוביות של החרוזים להפחית באופן משמעותי האיגוד לא ספציפית. בסופו של דבר, רצועה בארוך DNA בודד ניתן בקלות להבדיל בין היתדות DNA מרובים על-ידי המאפיין דנ א מתיחת המעבר17,18,19.
כיום, קביעת המיקום של הפלטפורמה מבוססת על החרוז הדמיה ניתוח, אשר יש רזולוציה מרחבית מוגבלת של ~ 2 ננומטר. בנוסף, יש לו קצב הדגימה מוגבלת של ~ 100 הרץ, בעיקר בשל קצב רכישת מוגבל של מצלמות CCD טיפוסיות וניתוח מתאם של התמונות. מגבלות אלה ניתן להתגבר באמצעות תאורה מיקרוסקופ (TIRF) גמורה. היא יוצרת שכבה דקה של אור evanescent נרקב אקספוננציאלית עם הגובה מעל פני השטח, אשר יכול לשמש כדי לקבוע את השינוי סיומת של מולקולות קצרות-יחס אות לרעש גבוה, תוך הימנעות ייבוא תמונות חרוז וניתוח26 . מגבלה נוספת היא שזה מאתגר ישירות להמחיש את מולקולה קשור או ליגנד מאוגדים המולקולה קשור באמצעות קרינה פלואורסצנטית הדמיה עיצוב מתיחה אנכי, אשר ניתן להתגבר על ידי מתיחת מולקולות בשימוש במישור המוקד פינצטה מגנטי רוחבי27. בסופו של דבר, העיצוב הנוכחי של תגובת הערוץ אינו מאפשר פתרון מהיר המרת בשל ההפרעות זרימה כדי המולקולה. יתר על כן, כוח גרירה גדול שנוצר זרימה מהירות גבוהה עשוי אפילו לשבור את היתדות. מגבלה זו ניתן להתגבר על-ידי מניפולציה היתדות פנימה microwells על המשטח התחתון של ערוץ28.
G4 תרכובות ייצוב נחשבים כיום מטרות טיפוליות אפשריות עבור מחלות, כולל סרטן, וירוס הקשורים למחלות, הקשורים ניוון מוחיים מחלות29,30,31. הפרוטוקול ניתן להחיל על טווח רחב של G4 מחייב חלבונים2 ו ליגנדים קטן32. בנוסף יישומים במחקרים G4, פלטפורמה זו, כמו גם את הפרוטוקולים, בעקרון, יכול לשמש עבור מחקרים של מבנים משניים אחרים חומצות גרעין, כולל ה-DNA ו- RNA סיכות, טריפלקס i-מוטיב33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים מנג פאן על הגהה כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי סינגפור משרד של חינוך אקדמי מחקר קרן שורה 3 (MOE2012-T3-1-001) כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי דרך סינגפור Mechanobiology המכון כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי, משרד, סינגפור ראש הממשלה, תחת תכנית Investigatorship ה-NRF (ה-NRF Investigatorship פרס מס ' ה-NRF-NRFI2016-03 כדי J.Y.; קרן מחקר בסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזי (2017KFYXJJ153) לה Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
