Summary
Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.
Abstract
Non-canonico dell'acido nucleico struttura secondaria che g-quadruplex (G4) sono coinvolti in diversi processi cellulari, come ad esempio la replicazione del DNA, trascrizione, elaborazione del RNA e l'allungamento dei telomeri. Durante questi processi, varie proteine legano e risolvere strutture G4 per svolgere la loro funzione. Come la funzione di G4 spesso dipende dalla stabilità della sua struttura piegata, è importante studiare come G4 proteine regolano la stabilità di G4. Questo lavoro presenta un metodo per modificare singole molecole di G4 usando la pinzetta magnetica, che permette studi del regolamento delle proteine leganti G4 su una singola molecola di G4 in tempo reale. In generale, questo metodo è adatto per un ampio campo di applicazioni negli studi per interazioni proteine/ligandi e regolamenti su varie strutture secondarie del DNA o RNA.
Introduction
Quattro-stranded DNA o RNA G4 strutture svolgono un ruolo critico in molti processi biologici importanti1. Molte proteine sono coinvolte nel legame G4 e regolamento, comprese le proteine obbligatorie del telomero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fattori di trascrizione (nucleolina, PARP1)3, RNA, proteine (hnRNP A1, di elaborazione hnRNP A2)4, elicasi (BLM, Pif1, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2)5e replicazione del DNA relative proteine (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Legame con le proteine può stabilizzare o destabilizzare G4 strutture; regolando le successive funzioni biologiche. La stabilità del G4 è stata misurata da thermal fusione utilizzando raggi ultravioletti (UV) o di metodi di dicroismo circolare (CD)7. Tuttavia, tali condizioni non sono fisiologiche rilevanti e sono difficili da applicare per lo studio degli effetti di binding proteine7.
Il rapido sviluppo delle tecnologie di manipolazione di singola molecola ha permesso studi di chiusura e apertura di una biomolecola, ad esempio un DNA o una proteina, a livello di singola molecola con risoluzione nanometrica in tempo reale8. Microscopia a forza atomica (AFM), pinzette ottiche e magnetiche pinzette sono i più comunemente usati metodi di manipolazione di singola molecola. Rispetto a AFM e pinzette ottiche9, magnetiche pinzette permettono misurazioni stabili di chiusura-apertura dinamica di una singola molecola nei giorni utilizzando una tecnica anti-drift10,11.
Qui, una piattaforma di singola molecola manipolazione usando pinzetta magnetica per studiare la regolazione della stabilità di G4 da proteine leganti è segnalato12,13. Questo lavoro delinea gli approcci di base, tra cui campione e flusso preparazione di canale, il programma di installazione di pinzette magnetiche e la calibrazione di forza. Il controllo di forza e i protocolli di antislittamento come descritto nel passaggio 3 consentono misure di tempo lungo sotto diversi controlli di forza, ad esempio costante forza (forza di bloccaggio) e carico costanti votare (forza-rampa) e forza-salto misura. Il protocollo di calibrazione forza descritto nel passaggio 4 consente forza calibrazione di < 1 µm cavezze breve sopra una vasta forza gamma pN fino a 100, con un errore relativo all'interno di 10%. Un esempio di regolazione della stabilità del RNA Helicase associato AU-rich element (RHAU) elicasi (alias DHX36, G4R1) che gioca un ruolo essenziale nella risoluzione di che RNA G4 viene utilizzato per illustrare le applicazioni di questa piattaforma13.
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Protocol
- formazione Tether
- delicatamente il flusso in 200 X diluito M-280, paramagnetici perle nella soluzione di saggio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) in un canale. Incubare per 10 minuti consentire le perline da associare alla biotina di molecole di DNA immobilizzati sulla superficie rivestita con SMCC fino alla fine del tiolo-etichettati. Delicatamente lavare via un-tethered perline utilizzando 200 µ l di soluzione di reazione standard.
Nota: Le perle di M-280 mostrano più basso legame non specifico alla superficie rispetto alle altre biglie magnetiche commerciali come M-270.
- delicatamente il flusso in 200 X diluito M-280, paramagnetici perle nella soluzione di saggio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) in un canale. Incubare per 10 minuti consentire le perline da associare alla biotina di molecole di DNA immobilizzati sulla superficie rivestita con SMCC fino alla fine del tiolo-etichettati. Delicatamente lavare via un-tethered perline utilizzando 200 µ l di soluzione di reazione standard.
- Montare il canale sul palco microscopio. Ricerca per le perle sulla superficie inferiore usando 100 X obiettivo a immersione in olio.
- Selezionare una perlina di riferimento sulla superficie e una perlina tethered commovente. Compilare le librerie di immagine iniziale del branello di riferimento e perlina legato alle diverse defocus aerei.
- Calibrazione dell'immagine di perline
- prima di esperimenti, utilizzare un attuatore piezoelettrico oggettivi per ottenere immagini di riferimento e di perle legati al defocus diversi piani distanziati di 20-50 nm, che vengono archiviati come due immagine separata della perla librerie e sono rispettivamente indicizzati con la distanza di sfocatura ( Figura 2D).
- x, y, z posizione determinazione
- durante gli esperimenti, per determinare la posizione del tallone nel piano x-y il centroide della perla. Determinare la modifica dell'altezza del tallone tethered confrontando l'immagine corrente della perla con quelli memorizzati nella libreria. Utilizzare l'analisi della funzione di auto-correlazione dello spettro di potenza della trasformata di Fourier del branello immagini 16.
- Anti-drift feedback utilizzando perlina riferimento
- durante gli esperimenti, utilizzare il piezo a " blocco " la distanza tra l'obiettivo e un'immagine di perlina di riferimento specifici memorizzati nella libreria tramite una bassa frequenza feedback di controllo, affinché l'immagine di tallone bloccato ha la migliore correlazione con una specifica immagine memorizzata nella libreria ( Figura 2D).
- Determinare se il tether è una molecola singola dsDNA applicando ~ 65 pN forza determinare una molecola singola dsDNA se il tether subisce il DNA caratteristico overstretching transizione 17 , 18 , 19. Ripetere la procedura finché non viene trovato un singolo dsDNA tether. (Fare riferimento alla sezione successiva per forza calibrazione e DNA overstretching transizione).
4. Calibrazione di forza magnetica pinzette
- determinare direttamente la forza (fino a 100 pN) per lunghe molecole di DNA (48.502 bp λ-DNA) utilizzando fluttuazione tallone attraverso:
, dove k B è la costante di Boltzmann, T è la temperatura in Kelvin scala, δ 2 y è la varianza della fluttuazione della perla nella direzione perpendicolare al campo magnetico e la forza direzione. In questa direzione, il movimento del tallone può essere descritto come una fluttuazione di pendolo con una lunghezza di l + r 0, dove l è la distanza di end-to-end lungo la direzione della forza (estensione) del DNA, e r 0 è il raggio del branello 10 ( Figura 3A). - Determinare la curva di taratura per forza F in funzione dei magneti a distanza tallone d e F (d) per differenti perline usando il lungo λ-DNA. Di solito, la distanza tra il magnete e la lamella viene utilizzata come la lunghezza del legare di DNA può essere ignorata. Appoggiare la F-curva d dalla funzione decadimento doppio-esponenziale:
, dove il raccordo parametri α1, α2, γ1, γ2 sono determinati dalla pinzetta magnetica e il parametro C è determinato dalla proprietà eterogenea di biglie magnetiche. Spostando la C, la F-curva d ottenuto da differenti perline può essere sovrapposta 10 ( Figura 3B). - Esperimenti di calibrazione del parametro C per biglie magnetiche individuali per DNA breve.
- Per determinare la forza basata sulla fluttuazione richiede la posizione del tallone ad una frequenza superiore alla frequenza di angolo di registrazione:
, dove γ è il trascinamento coefficiente del tallone. Per breve DNA a forza elevata, richiede più veloce di 100 Hz frequenza di registrazione, pertanto, la forza non può essere misurata direttamente basata sulla fluttuazione con la fotocamera. Tuttavia, il parametro C può essere determinato misurando la forza a bassa forza gamma (< 15 pN) utilizzando fluttuazione e montaggio i dati con un calibrato F-curva d per ottenere il parametro C 20. - In alternativa, per esperimenti con dsDNA, determinare il parametro C usando il DNA overstretching transizione una forza di ~ 65 pN ( Figura 3) 21 , 22 , 23 registrando la posizione d al salto di estensione ha mostrato quale dsDNA (0,6 X aumento di lunghezza di lunghezza di contorno). Dopo aver determinato il parametro C, calcolare la forza per le perline tethered.
- Per determinare la forza basata sulla fluttuazione richiede la posizione del tallone ad una frequenza superiore alla frequenza di angolo di registrazione:
- Controllare la velocità di caricamento di programmazione il movimento dei magneti attraverso la funzione inversa di F (d). Il magnete dovrebbe affrontare il campione doppio esponenzialmente.
Nota: L'errore relativo della forza determinata da un metodo di estrapolazione è ~ 10% ed è principalmente causata dalla perlina raggio eterogeneità 20.
5. Manipolazione di singola molecola del G4 in presenza ed assenza di Binding Proteins
- Force-rampa esperimenti
- dopo aver identificato la lombata di dsDNA, eseguire una scansione di forza-aumento ad un tasso di carico di 0,2 pN/s seguita da un scansione di forza-decesso a -0,2 pN/s. Dopo ogni ciclo di allungamento, tenere la molecola di DNA a 1 pN per 30 s per consentire il ssDNA a ripiegare a G4.
- Force-salto esperimenti
- ciclo la forza tra 54 pN per 30 s in base al quale un G4 piegato potrebbe essere spiegato e 1 pN per 60s, sotto il quale potrebbe ripiegare un piegato G4-15T.
- Soluzione proteica Flowing
- fluire la soluzione della proteina quando al ~ 20 pN forza per evitare allegato delle perline per il vetrino coprioggetti. Il helicase RHAU DEAH-box, che ha mostrato elevata specificità la struttura G4, è stato usato 24. Il ricombinante dell'elicasi RHAU (DmRHAU) di Drosophila melanogaster è stata espressa in Escherichia coli e purificata come descritto in precedenza 25. Il G4 svolgimento attività di DmRHAU è stata analizzata su un G4 DNA substrato 13 tetramolecolari.
- Analizzare la forza di spiegamento utilizzando un in-House scritti Matlab programma 14.
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Representative Results
Figura 5: Misurazioni di forza-salto del G4 svolgimento.
(A) traccia di tempo rappresentativo del cambiamento di altezza tallone durante forza saltare cicli tra 1 pN e pN 54 misurata senza DmRHAU, con 10 nM DmRHAU ma senza ATP e con 10 nM DmRHAU e 1 mM ATP, come indicato nel pannello di figura. (B) traccia tempo rappresentativo del cambiamento di estensione di una molecola di G4 (grigi dati) dopo il salto a pN 54 in parecchi cicli di forza-salto tratte da dati in (A). Le estensioni corrispondenti a piegato (F) e sono indicati anche spiegato G4 (U); Eventi di espansione G4 sono indicati dalle frecce. Questa figura è stata modificata da13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come descritto sopra, una piattaforma per lo studio della stabilità meccanica del G4 DNA e le interazioni della proteina a G4 utilizzando una pinzetta magnetica di singola molecola è segnalata. Accompagnando la piattaforma, sono sviluppati protocolli altamente efficienti di trovare G4 DNA tether e misura della chiusura-apertura dinamica e la stabilità della struttura G4 con risoluzione speciale nanometri. Il bloccaggio del piano focale consente controllo antislittamento altamente stabile, che è importante per la rilevazione di una transizione di piccola struttura come G4 (passo dimensioni ~ 7 nm) e le interazioni con le proteine negli esperimenti di cambio di buffer. Questa piattaforma è stato recentemente impiegata per gli studi delle dinamiche pieghevoli e spiegamento di telomerica G414 e promotore di c-Myc G412, così come studi di G4 associazione proteina RHAU helicase13.
Un errore tipico esperimento è il legame non specifico di DNA e perline sul coprioggetto o DNAs più associare a biglie magnetiche. Per ridurre il legame non specifico, in primo luogo, lo stoccaggio di prodotti chimici quali APTES e SMCC bisogno di essere controllato regolarmente. In secondo luogo, è importante selezionare un tipo appropriato di biglie magnetiche e bloccare il legame non specifico. Utilizzando il buffer di 10 mg/mL BSA o piccolo oligo DNA, quali poli T, per bloccare la superficie idrofoba delle perline può ridurre significativamente il legame non specifico. Infine, una singola pastoia di DNA sono facilmente riconoscibili da attacchi multipli di DNA dalla caratteristica del DNA overstretching transizione17,18,19.
Attualmente, la determinazione di posizione della piattaforma si basa sul tallone imaging analisi, che ha una risoluzione spaziale limitata di ~ 2 nm. Inoltre, ha un tasso di campionamento limitato di ~ 100 Hz, principalmente a causa della velocità di acquisizione limitato di telecamere CCD tipico e analisi di correlazione delle immagini. Queste limitazioni possono essere superate utilizzando illuminazione di microscopia (TIRF) riflessione interna totale. Produce un sottile strato di luce evanescente che decade esponenzialmente con l'altezza dalla superficie, che può essere utilizzata per determinare il cambiamento di estensione delle molecole breve presso un alto rapporto segnale-rumore, evitando l'acquisizione di immagini di perlina e analisi26 . Un'altra limitazione è che è difficile visualizzare direttamente la molecola tethered o ligando legato alla molecola tethered usando la formazione immagine di fluorescenza nella progettazione d'allungamento verticale, che può essere superata da stretching molecole nel piano focale utilizzando pinzetta magnetico trasversale27. Infine, il design attuale del canale reazione non consente scambio di rapida soluzione a causa della perturbazione del flusso alla molecola. Inoltre, una forza di trascinamento grande generata alla velocità di flusso può anche rompere le pastoie. Questa limitazione può essere superata mediante la manipolazione di attacchi all'interno i micropozzetti collocati sulla superficie inferiore del canale28.
G4 stabilizzanti composti sono attualmente considerati come potenziali bersagli terapeutici per le malattie, compreso cancro, virus correlate malattie e neurodegenerazione malattie29,30,31. Il protocollo può essere applicato a una vasta gamma di G4 vincolante proteine2 e piccoli ligandi32. Oltre alle applicazioni in studi di G4, questa piattaforma, nonché i protocolli, in linea di principio, possono essere utilizzati per gli studi delle altre strutture secondarie di acidi nucleici, compreso DNA e RNA forcine, triplex e i-motivo33.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Meng Pan per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato da Singapore Ministero di formazione accademica ricerca fondo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) per J.Y.; la Fondazione di ricerca nazionali attraverso l'Istituto Mechanobiology da Singapore a J.Y.; il National Research Foundation, ufficio, Singapore del primo ministro, nell'ambito del programma Investigatorship NRF (NRF Investigatorship premio No. NRF-NRFI2016-03 al J.Y.; il fondo di ricerca fondamentale per le Università centrale (2017KFYXJJ153) di H. Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
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