Summary
Одной молекулы Магнитные пинцеты платформу для манипулирования G-quadruplexes сообщается, что позволяет для изучения G4 стабильность и регулирование различных белков.
Abstract
Non канонические нуклеиновой кислоты вторичная структура, которую G-quadruplexes (G4) участвуют в различных клеточных процессах, таких как репликация ДНК, транскрипция, обработки РНК и удлинение теломер. В ходе этих процессов различные белки связывают и разрешить G4 структуры для выполнения их функций. Как функция G4 часто зависит от стабильности ее складчатые структуры, важно исследовать, как белки, связывающие G4 регулировать стабильности G4. Эта работа представляет метод для обработки одной молекулы G4, используя Магнитные пинцеты, который позволяет исследования регулирования G4 связывания белков на одной молекулы G4 в режиме реального времени. В общем этот метод подходит для широкий спектр применений в исследованиях для взаимодействия белков/лигандов и правил на различных вторичных структур ДНК или РНК.
Introduction
Четыре мель ДНК или РНК G4 структуры играют решающую роль в многих важных биологических процессов1. Многие белки участвуют в привязке G4 и регулирования, включая белки, связывающие теломер (теломеразы, РПА, TEBPs, Аппл1, TRF2)1,2, факторы транскрипции (nucleolin, PARP1)3, РНК, белков (hnRNP А1, обработки hnRNP A2)4, Хеликазы (BLM, FANCJ, RHAU, предупреждение, Dna2, Pif1)5и репликацию ДНК, связанных белков (Rif1, Rev. 1, PrimPolymerase)6. Связывание с белками может стабилизировать или дестабилизировать G4 структур; Таким образом, регулирующих последующие биологические функции. Стабильность G4 измерялась тепловой плавка с использованием ультрафиолетового (УФ) или круговой дихроизма (CD) методы7. Однако, такие условия не являются физиологические соответствующих и трудно применять к изучению воздействия связывания белков7.
Бурное развитие в одной молекулы манипуляции технологий позволило исследования складывания и раскладывания биомолекулы, такие как ДНК или белка, на уровне одной молекулы с резолюцией нанометров в реальном времени8. Атомно-силовой микроскопии (АСМ), Оптический пинцет и Магнитные пинцеты являются наиболее часто используемые методы манипуляции одной молекулы. По сравнению с AFM и Оптический пинцет9, Магнитные пинцеты позволяют стабильные измерения складные разворачивается динамики одной молекулы дней, используя технику анти дрейф10,11.
Здесь один молекула манипуляции платформы, используя магнитные Пинцеты для изучения регуляции G4 стабильности путем связывания белков-сообщил12,13. Этой работе излагаются основные подходы, включая подготовку образца и потока канала, установки Магнитные пинцеты и калибровки силы. Управления сил и против дрейфа протоколов, как описано в шаге 3 позволяют на долгое время измерения при различных сил элементы управления, например постоянная сила (силы зажима) и постоянной загрузки оценить (сил рампы) и сила прыжок измерения. Протокол калибровки силы, описанные в шаге 4 позволяет калибровки силы < 1 мкм короткие тросов над большой силой диапазон до 100 pN, с относительной погрешностью в пределах 10%. Пример регулирования устойчивости Helicase РНК, связанные с AU-богатые элемент (RHAU) helicase (псевдоним DHX36, G4R1), который играет существенную роль в урегулировании что РНК G4 используется для демонстрации применения этой платформы13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка G4 ДНК для одной молекулы растяжение
- подготовить 5 '-тиоловых помечены и 5 '-биотин, помечены dsDNA ручки методом ПЦР с помощью DDNA полимеразы на шаблоне ДНК фага лямбда, используя 5 '-тиоловых и 5 '-биотин Праймеры 14 ( рис. 1). Обе ручки dsDNA имеют высокое содержание GC (> 60%) для предотвращения ДНК плавления когда ДНК проводится на высокой силы или во время распыления ДНК перехода 15.
- Продукты PCR, очищают с помощью комплекта коммерческой очистки и дайджест с BstXI энзима ограничения по заявлению производителя ' протокол s.
- Перевязать G4 формируя ssDNA и фланка ssDNA и dsDNA ручки с помощью T4 ДНК лигаза согласно данным производителя ' протокол s. Очистить перевязаны продукта экстракцией гель, используя набор коммерческой очистки согласно данным производителя ' протокол s.
2. Подготовка канала потока
- Coverslip очистки и Функционализация поверхности
- место снизу coverslips (#1.5, 22 × 32 мм) и верхний coverslips (#1.5, 20 x 20 мм) в Стекло покровное пятнать банок (каждый сосуд вмещает 7 штук coverslips, объем-~ 20 мл). Промыть coverslips в банки с дистиллированной водой в 2 - 5 раз.
- Добавить ~ 20 мл стирального раствора 5-40% в каждой банку, а затем место в ультразвуковой очистки бане 30 мин смойте дистиллированной воды для > 10 раз для удаления моющего средства.
- Сухой coverslips в банках в духовке (~ 150 ° C; Осторожно, горячие), или N 2 газом. Хранить сушеные Топ coverslips в шкаф сухой.
- Использования плазмы (O 2 газ) для очистки coverslips в банке за 10 мин. В течение 10 мин, подготовить 20 мл раствора 1% (3-аминопропил) triethoxysilane (APTES) в метаноле (осторожно, токсичный/горючих). Используйте Химический вытяжной шкаф для растворения APTES в метаноле.
Примечание: Избегайте влажность при хранении APTES решение. Старые APTES часто вызывает проблемы в поверхности functionalizing coverslips. - Сразу же после плазменной очистки, добавьте все 1% раствора APTES в банки и инкубировать на 1 ч. залить отходов в конкретных для метанола APTES 1% отходов бутылку. Необходимо выполнить связанные с метанолом Зонта химических веществ, легковоспламеняющихся.
- Промыть банки раз с метанолом и > 10 раз с дистиллированной водой, а затем сухой печи (~ 150 ° C; Осторожно, горячий). Магазин APTES-покрытием снизу coverslips в шкаф сухой, если не используется на срок до двух недель.
Примечание: После каждого подпункта шаг от 2.1.1 для 2.1.4, процесс очистки может быть приостановлена в перед следующим этапом.
- Собрать канал потока
- подготовить два " прокладки ", то есть, парафина или двухсторонней ленты (~ 4 мм × 20 мм) для каждого канала. Место два куска распорки на нижней coverslip вдоль Лонг края. Место Топ coverslip на прокладку, образуя ячейку потока между ними (~ 10 мм × 20 мм площадь, Рисунок 2а , Б).
- Если парафина используется как заполнитель, место канал потока на подогреватель (60-120 ° C; Осторожно, горячие) для 5-10 s нежно нажимая стороны Топ coverslip склеить два coverslips, парафина. В результате поток канал имеет высоту ~ 100 мкм, и тем самым объем канала составляет ~ 20 мкл.
- Уплотнение длинной канала с силиконовый клей, чтобы избежать утечки. Использовать клей силиконовый сделать небольшой раковиной как структура каждой открытой краю канала потока, который служит в качестве входа и выхода раствора.
Примечание: Вход и выход может также быть сделаны другими способами, например, придерживаясь небольшие пластиковые кольца, с помощью воска. - Хранить каналы в сухой кабинета на срок до 4 недель.
- Tether ДНК на нижней поверхности канала потока
- развести шарики полистироля амино покрытием (диаметр: 3 мкм) 200 X в дистиллированной 1 X фосфат буфер солевой буфера (PBS). Вихревой шарик решения и затем впадают в каналы. Инкубировать решение шарик в каналах для ~ 30 мин удалить любой расклеиваться бусины промывкой 200 мкл буфера 1 ПБС.
- Регулировка (увеличение/уменьшение) время инкубации для достижения поверхностная плотность 1-5 шариков на площади 50 мм x 50 мм. Сохранение каналов, сданные бисера ссылка на срок до 3 дней.
- Развести sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу-ККАП) порошка в 1 раствор ПБС (~ 0,5 мг/мл). Вихревой решения и затем впадают в канал.
Примечание: Готовить свежий раствор сульфогруппу ККАП перед использованием и добавьте его непосредственно на канал, чтобы избежать гидролиза ККАП. - Инкубировать решение ККАП в канале на 30 мин удалить решение ККАП, омыв с большим количеством (1 мл, ~ 50 X громкость канала) раствора 1 ПБС.
Примечание: Тщательно вымойте избыток ККАП. Этот шаг является очень важным для связывания ДНК на coverslip. - , Привязывая ДНК
- развести тиоловых биотин помечены ДНК в ПБС, в результате концентрации ДНК ~ 0,3 Нм. Аккуратно Пипетка mix решение, поток раствора ДНК в канал ККАП покрытием и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре (~ 23 ° C).
- Аккуратно смыть бесплатные ДНК с 200 мкл блокирования решения, содержащего ПБС с 10 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0,01% 2-меркаптоэтанол.
- Блок поверхности канала по инкубации канал в преграждая разрешение (10 мг/мл BSA, 0,01% 2-меркаптоэтанол) для > 2 h; после этого шага, канал готов для экспериментов. Подготовленный канал может храниться при температуре 4 ° C для ~ 1 день.
Примечание: Блокирование шаг имеет важное значение для уменьшения неспецифической связывания ДНК и магнитные бусы для coverslips.
3. Магнитные пинцеты установки и идентификации одного dsDNA троса
- Магнитные пинцеты установки
- начала Магнитные пинцеты управления программы. Здесь, Магнитные пинцеты контролировались написано в дом программы LabVIEW.
- Выравнивание центров магнит перед монтажом канала. Используйте 4 X объектив для настройки осей x и y - магнитов в оптической оси микроскопа.
- Использовать управляемая компьютером моторизованных манипулятор для перемещения магниты вдоль z оси ( рисунок 2A) и задайте расстояние как d = 0 (d: расстояние между магнитами и coverslip) когда магниты прикрепить к coverslip на микроскопе.
- Программа движения магнитов через манипулятор для достижения контроля силы, включая постоянное (т.е., постоянные d) и время разной силы F (t) (то есть, время различной d(t )).
- Использовать яркий источник света светоизлучающих диодов (СИД) для обратно рассеянного освещения шарик через объектив. Собирать изображения шарик на дискретизации 100 Гц с зарядовой (связью ПЗС) камеры. < / ля >
- образца установки и идентификации троса единый dsDNA
- Tether формирования
- нежно потока в 200 X разбавленным M-280, парамагнитная бусины в Пробирной растворе (100 мм KCl, 2 MgCl 2, 10 мм трис рН 7,4 ) в канал. Проинкубируйте втечение 10 мин позволить бусы для привязки к биотин меченых молекул ДНК иммобилизованных на ККАП покрытием поверхности до конца тиоловых меченых. Аккуратно смыть ООН привязанный бусы, используя 200 мкл раствора стандартная реакция.
Примечание: Бусы M-280 Показать нижний неспецифической привязки к поверхности по сравнению с других коммерческих магнитные бусы, например M-270.
- нежно потока в 200 X разбавленным M-280, парамагнитная бусины в Пробирной растворе (100 мм KCl, 2 MgCl 2, 10 мм трис рН 7,4 ) в канал. Проинкубируйте втечение 10 мин позволить бусы для привязки к биотин меченых молекул ДНК иммобилизованных на ККАП покрытием поверхности до конца тиоловых меченых. Аккуратно смыть ООН привязанный бусы, используя 200 мкл раствора стандартная реакция.
- Монтировать канал на микроскопа. Поиск для бусин на нижней поверхности с помощью 100 X Нефть погружения цель.
- Выберите ссылку шарик на поверхности и движущихся привязанный шарик. Построения библиотек исходное изображение ссылка бисера и привязал шарик на самолеты различных defocus.
- Калибровка изображения бусы
- до экспериментов, использовать объективные пьезо привода для получения изображения ссылки и привязал бусы на самолеты различных defocus, расположенных на 20-50 Нм, которые хранятся как два отдельных бисера образ библиотеки и являются соответственно индексируются с defocus расстояние ( Рисунок 2D).
- x, y, z расположите определение
- во время экспериментов, определить положение шарик в плоскости x-y, центр тяжести шарика. Определите изменение высоты привязанный шарик, сравнивая текущее изображение шарик с теми, хранящиеся в библиотеке. Используйте функции auto корреляционный анализ мощности спектра Фурье изображений шарик 16.
- Против дрейфа обратной связи, с использованием бисера ссылка
- во время экспериментов, используйте пьезо для " замок " расстояние между объективную и конкретную ссылку бисера образ, хранящийся в библиотеке через низкой частоты Обратная связь управления, так что изображение застрял шарик имеет лучшее соотношение с определенного изображения, хранящиеся в библиотеке ( Рисунок 2D).
- Определить, является ли tether молекула единый dsDNA путем применения ~ 65 pN силы определяют молекула единый dsDNA если tether подвергается характерным ДНК, распыления переход 17 , 18 , 19. повторить процесс, пока не будет найден троса единый dsDNA. (Пожалуйста, обратитесь к следующему разделу для калибровки силы и ДНК, распыления перехода).
- Tether формирования
4. Магнитные пинцеты силу калибровки
- непосредственно определяют силу (до 100 pN) для длинные молекулы ДНК (48,502 bp λ-ДНК), с использованием бисера колебания через:
, где k B — постоянная Больцмана, T — температура по шкале Кельвина, δ 2 y-дисперсия колебаний шарик в направлении, перпендикулярном магнитном поле и силы направление. В этом направлении движение шарика можно описать как колебания маятника с длиной l + r 0, где l — это конец в конец расстояние вдоль направления сил (расширение) ДНК, и r 0 радиус в бисера 10 ( рис. 3A). - Определение Калибровочная кривая для силы F как функция магнитов шарик расстояние d и F (d) для разных бусинок, используя длинные λ-ДНК. Обычно расстояние между магнитом и coverslip используется как длина троса ДНК могут быть проигнорированы. Вписываются в F-кривой d функцией двойной экспоненциальный распад:
, где установку параметров α1, α2, γ1, γ2 определяются Магнитные пинцеты и параметр C определяется свойством неоднородных магнитных шариков. Переключив C, F-d кривой, полученные из различных бисер может быть перекрытием 10 ( рис. 3B). - Калибровка параметра C для индивидуальных магнитных шариков для коротких ДНК экспериментов.
- Определении силы, основанные на колебания требует записи шарик позиции с частотой выше чем угловой частоты:
, где γ — перетаскивания Коэффициент шарик. Для коротких ДНК на высокой силы она требует быстрее, чем 100 Гц частота записи, таким образом, силы не могут быть измерены непосредственно основаны на колебания с камерой. Однако, параметр C может быть определена путем измерения силы на низком силу диапазона (< 15 pN) с использованием колебания и установку данных с калиброванной F-кривой d для получения параметра C 20. - В качестве альтернативы, для экспериментов с dsDNA, определить параметр C использованием ДНК, распыления перехода в силу ~ 65 pN ( рис. 3 c) 21 , 22 , 23, записывая положение d на прыжок показал расширение которых dsDNA (0,6 X увеличение длины контура длины). После определения параметра C, рассчитать силу для привязи бусины.
- Определении силы, основанные на колебания требует записи шарик позиции с частотой выше чем угловой частоты:
- Контролировать скорость загрузки, программирование движения магнитов через обратная функция F (d). Магнит должен подходить образец двойной экспоненциально.
Примечание: Относительная ошибка силы, определяется методом экстраполяции является ~ 10% и главным образом вызваны шарик радиус неоднородность 20.
5. Сингл молекула манипуляции G4 в присутствие и отсутствие привязки белки
- силы рампа экспериментов
- после выявления dsDNA троса, выполнить проверку сил увеличение 0.2 pN/s, а затем со скоростью загрузки силу смерти сканирования на – 0,2 pN/сек. После каждого цикла растяжения, удерживайте молекулы ДНК в 1 pN 30 s чтобы позволить ssDNA сворачивают G4.
- Силы прыжок эксперименты
- цикл силы между 54 pN 30 s, под которым сложенном G4 может быть развернут и 1 pN для 60-х, под которым может сворачивают сложенном G4-15т.
- Раствор белка потока
- потока раствора белка когда на ~ 20 pN силы чтобы избежать приверженность бусы из coverslip. Helicase ДЕА box RHAU, который показал высокую специфичность к структуре G4, был используется 24. Рекомбинантные helicase Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) была выражена в Escherichia coli и очищенный, как описано ранее 25. G4 разматывания деятельность DmRHAU была assayed на tetramolecular G4 ДНК субстрата 13.
- Анализ разворачивающихся силы, с использованием собственных написано Matlab программы 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Настройки эксперимента для растяжения одной молекулы G4 показан на рисунке 4. Последовательность формирования G4 одноцепочечной интервале между двумя ручками dsDNA был привязанный между coverslip и парамагнитными шарик. Чтобы найти шарик привязанный единый dsDNA overstretching assay была выполнена путем увеличения силы по ставкам постоянной загрузки. Три вида измерений часто использовались для изучения складывания и раскладывания биомолекул: (i) постоянной силой измерения, измерения силы рампа (ii) и (iii) силы прыжок. Из-за крайне медленно разворачивается ставки этой структуры G4, равновесия, которые складывающиеся разворачивается переход может произойти только раз в течение дней, поэтому измерения силы рампа и силы прыжок были использованы для характеризующие разворачивающихся кинетики и стабильность G4 структуры.
Измерения силы рампа для G4 разворачивается в наличие или отсутствие RHAU белка:
Рисунок 4B показывает типичный силы расширение кривые полученные увеличением силы сканировать со скоростью загрузки 0.2 pN/s следуют силы кончина сканирования на – 0,2 pN/сек. После каждого цикла растяжения, молекулы ДНК была проведена на 1 pN 30 s чтобы позволить ssDNA сворачивают на G4. Расширение прыжок в силу увеличение сканирования указали разворачивается переход G4. При использовании последовательности формирования-G4, внезапное расширение прыжок не могут быть соблюдены. Разворачивающихся распределение силы могут быть получены путем записи силы в которой разворачивается произошло. Разворачивается силы распределение полученных на 0.2 pN/s показал один пик на G4-15T ~ 52 pN. Однако, в присутствии 10 Нм RHAU, G4-15T остались сложенными во время сканирования сил увеличение для pN до 60, указывающий G4 стабилизации RHAU привязки. В присутствии 10 Нм RHAU и 1 мм АТФ разворачивающихся распределение силы был перенесен на нижней силы, свидетельствует о АТФ зависимых дестабилизации G4, RHAU.
Сил прыжок измерения G4 разворачивается в наличие или отсутствие RHAU белка:
На рисунке 5 показана представитель след шарик высоты во время четырех циклов силы прыжок (рис. 5, левой панели); усилие, прилагаемое к молекуле был циклическое между 54 pN 30 s, под которым сложенном G4 может быть развернут и 1 pN 60 s, под которой может сворачивают сложенном G4-15т. Средний срок службы сложенном G4-15T в 54 pN был ~ 6.4 s, оценивается путем установки жизни гистограмма с функции экспоненциального распада13. После течет в растворе 10 Нм RHAU helicase без СПС, расширение привязанный ДНК оставалась на сложенном уровне на протяжении 30 время выдержки s на 54 pN, указав, что RHAU сильно стабилизирует структуру G4-15T против механического разворачивается в отсутствие СПС. После течет в 10 Нм RHAU и 1 мм АТФ, расширение той же молекулы сразу после прыжков с 1 pN до 54 pN был на уровне развернул ssDNA, указав, что RHAU дестабилизирует структуры G4 в присутствии АТФ.
Рисунок 1: Подготовка G4 ДНК одной молекулы растяжения экспериментов.
DsDNA ручки были подготовлены методом ПЦР с использованием 5'-тиоловых и 5'-биотин грунтовки. Продукты PCR были очищены и переваривается с энзима ограничения BstXI и были очищены извлечения геля. Формируя ssDNA G4, два фланга ssDNA и dsDNA ручки были лигируют с помощью T4 ДНК лигаза. Перевязаны продукт был очищен путем извлечения геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Эскизы основных Магнитные пинцеты аппарата.
(A) эскиз канала потока с парой магнитов, расположенных выше и ниже цели микроскопии. (B) эскиз собрал потока канала, где синий цветные прямоугольники представляют coverslips сверху и снизу, а серые эллиптические линии входа и выхода канала потока. (C) эскиз формирования сил и поверочные установки Магнитные пинцеты. (D) примеры изображений ссылка бисера и движущихся шарик на различных уровнях де фокус позиции, хранящиеся в библиотеках изображений из бисера. Красный знак обозначает ссылка бисера изображение, полученное в частности де фокус плоскости, используемой для блокировки фокальной плоскости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Силы калибровки магнитных пинцетом.
(A) калибровка силы, используя колебания шарик вдоль y направления вращения бесплатно. Ось x проходит вдоль же направлении, что магнитное поле. Силы вдоль оси z и находится под контролем, регулируя расстояние dмежду парой постоянного магнита и coverslip. (B) калибровка с помощью длинный 48,502 bp-ДНК. Свойства неоднородных магнитных шарик может быть описана одной параметра C. Этот рисунок был изменен с10. (C) калибровка параметра C магнитной бусины, крепится на 2 КБ ДНК с помощью B S распыления перехода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Один молекула манипуляции G4.
(A) эскиз растяжение структуры single G4 и измерения разворачивающихся событий. (B) типичный пример силы увеличение (голубой) и силы снижение кривой привязанный G4. Этот рисунок был изменен с12. (C) кривая силы расширение G4 в отсутствие (серый) или наличие (розовый) RHAU белка. (D) развертывание сил распределение G4 в отсутствие (серый) (n = 140) или наличие (красный) RHAU и АТФ (n = 117). Эта цифра была изменена13. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Измерения силы прыжок G4 разворачивается.
(A) представитель время след изменения высоты шарик в силу прыгать циклов между 1 pN и 54 pN, измеряемой без DmRHAU, с 10 Нм DmRHAU но без СПС и с 10 Нм DmRHAU и 1 мм АТФ, как указано на рисунке панели. (B) представитель время след расширение изменения молекулы G4 (серый данных) после прыжка в 54 pN в несколько циклов силы прыжок, взяты из данных в (A). Расширения, соответствующие сложить (F) и указаны также развернул G4 (U); G4 разворачивающиеся события обозначаются стрелками. Эта цифра была изменена13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как описано выше, платформу для изучения механическая стабильность G4 ДНК и взаимодействий протеина G4 с помощью одной молекулы Магнитные пинцеты сообщается. Сопроводительных платформа, разработаны высокоэффективные протоколы нахождения G4 ДНК троса и измерение динамики складной разворачивается и стабильность структуры G4 с нанометров специальной резолюции. Фокальной плоскости блокировки позволяет высокостабильных анти дрейф элемент управления, который имеет важное значение для обнаружения небольшой структуры переходного периода, например G4 (шаг размер ~ 7 Нм) и взаимодействие с белками в буфер обмена экспериментов. Эта платформа недавно был нанят для исследования динамики складной и разворачивается telomeric G414 и c-Myc промоутер G412, а также исследования G4 связывания белка RHAU helicase13.
Типичная эксперимент ошибка является неспецифической связывания ДНК и бусы на coverslip или несколько ННО привязку к магнитной бусины. Во-первых, чтобы уменьшить неспецифической привязки, хранения химических веществ, таких как APTES и ККАП должны регулярно проверяться. Во-вторых важно выбрать соответствующий тип магнитный шарик и блокировать неспецифической привязки. Используя буфер 10 мг/мл BSA или небольших oligo ДНК, таких как поли T, чтобы блокировать гидрофобной поверхности бисер может значительно уменьшить неспецифической привязки. Наконец один троса ДНК можно легко отличить от нескольких тросов ДНК характеристикой ДНК распыления переход17,18,19.
В настоящее время, определение положения платформы основывается на шарик, визуализации анализа, который имеет ограниченный пространственное разрешение ~ 2 Нм. Кроме того, он имеет ограниченный дискретизации ~ 100 Гц, главным образом вследствие ограниченного приобретение скорость типичных CCD камер и корреляционного анализа изображений. Эти ограничения могут быть преодолены с помощью полного внутреннего отражения микроскопии (TIRF) освещения. Она производит тонкий слой исчезающий свет, который экспоненциально убывает с высотой от поверхности, который может использоваться для определения изменения расширения коротких молекул в высокое соотношение сигнал шум, избегая захвата изображений из бисера и анализ26 . Еще одним ограничением является то, что сложные непосредственно визуализировать привязанный молекулы или лиганд, привязан к молекуле привязал с использованием визуализации флуоресценции в вертикальное растяжение дизайн, которые могут быть преодолены путем растяжения молекул в фокальной плоскости с помощью Поперечная Магнитные пинцеты27. Наконец текущий дизайн реакцию канала не допускает обмен быстрого решения из-за потока возмущений в молекуле. Кроме того большим drag силы, созданные на высокой скорости потока может даже сломать тросов. Это ограничение можно преодолеть путем манипулирования тросов внутри microwells, расположенных на нижней поверхности канала28.
G4, которые стабилизирующим соединений в настоящее время рассматриваются в качестве потенциальных терапевтических целей для заболеваний, включая рак, вирус связанных заболеваний и нейродегенеративные заболевания29,30,31. Протокол может применяться широкий диапазон G4 связывания белков2 и32малых лигандов. Помимо применения в исследованиях G4 этой платформы, а также протоколы, в принципе, может использоваться для исследования других вторичных структур нуклеиновых кислот, включая ДНК и РНК заколки, триплекс и i мотив33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Meng Pan за корректуру рукопись. Эта работа поддерживается, Сингапур министерства от образования академических исследований Фонд Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) до Д.Ю; Национальный исследовательский фонд через Сингапур Mechanobiology института для Д.Ю; Национальный исследовательский фонд, офис премьер-министра, Сингапур, в рамках своей программы Investigatorship СР (СР № Investigatorship премии СР-NRFI2016-03 для Д.Ю; Фонд фундаментальных исследований университетов Центральной H. Y (2017KFYXJJ153).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
