Summary
肠道化文化是建立在整个棺, 不允许分析自我更新和分化的细胞特有的方式。本协议描述了对排序后的词干 (Lgr5+) 和小生境 (氏) 单元的重构, 这些细胞在进行生物化学和遗传修饰和功能分析之前, 会产生 organoids。
Abstract
小肠上皮的特点是以极快的速度流动。在哺乳动物中, 整个上皮衬里在 4-5 天内更新。成体肠道干细胞位于 Lieberkühn 棺的底部, 由Lgr5基因的表达指定, 并通过其特有的高增殖率1保持稳态。在整个小肠中, Lgr5+ 干细胞与称为氏细胞的特殊分泌细胞混合在一起。氏细胞分泌抗菌化合物 (即、溶菌酶和凹/防御), 并对肠道菌群发挥控制作用。最近, 发现了一个新的功能, 氏细胞, 即他们的能力提供利基支持的Lgr5+干细胞通过几个关键配体作为 Wnt3, EGF, 和 Dll12。
当孤立的ex 体内和培养在特定生长因子和细胞外基质成分的存在下, 整个肠道棺产生长寿命和更新3D 结构称为 organoids, 高度类似于地穴绒毛成人小肠的上皮结构3。化的文化, 当建立从整个棺, 允许研究的自我更新和分化的肠道干细胞利基, 但没有解决的贡献, 其各个组成部分, 即Lgr5+和氏细胞。
在这里, 我们描述了一种新的方法, 化分析利用的能力, 氏和Lgr5+细胞关联和形成 organoids 时共。这种方法, 这里称为 "化重构化验" (), 允许遗传和生物化学的修改氏或Lgr5+ 干细胞, 然后重组成 organoids。因此, 它允许功能分析的两个主要组成部分的肠道干细胞利基。
Introduction
肠上皮是哺乳动物体内最快速的更新组织, 因此, 它一直是大量研究的对象, 目的是在隐窝底部的成体干细胞的鉴定和功能表征。Lieberkühn, 由Lgr5基因的表达式指定, 并依赖于标准 Wnt 信号1。值得注意的是, Lgr5+干细胞是由专门的小生境细胞 (氏细胞) 所支持的, 它也依赖于其成熟度 2的 Wnt 信号。同时, 这两种细胞类型的基础上的肠道上皮内膜的自我更新和保持每日的稳态平衡: Lgr5+ 干细胞迅速分化并引起祖细胞和更专门的肠上皮细胞;氏细胞提供必要的利基因素 (如, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ 干细胞2。肠道棺的能力, 当镀前体形成组织和更新结构称为 organoids, 或 "mini-guts", 已被作为一个实验工具, 以提供洞察的过程, 如自我更新和正常和病理条件下的分化, 包括癌症4。从老鼠和人类样本中的几个组织, 包括肠道、胰腺、肝脏和肾脏, 都建立了化的培养4。这些化培养物的提取方法和生长因子是组织特异性的, 其目的是促使多分化, 并尽可能地模仿原干细胞生态位在体内.Organoids 可能有潜在的应用, 包括基因疾病的治疗, 对癌症的疗效评估, 药物毒性分析, 或器官的研究体外5。
总的来说, 从组织标本中建立的化文化的主要局限是缺乏细胞特异性。例如, 肠道 organoids 建立从整个肠道棺不允许分析的个别细胞成分包含在组织来源 (如, 整个棺包含Lgr5+, 氏, 和祖细胞)。
在这里, 我们描述了一种新的方法, 称为化, 结合了肠道的优势, 其最基本的组成部分, 即词干 (Lgr5+) 和利基 (氏) 细胞的功能分析。这是通过氏和Lgr5+单元格的独特功能实现的, 当 co-incubated 并引发 organoids2、610时, 它们之间的物理关联。我们利用这一功能, 并预处理两个细胞类型, 然后再允许他们重建 organoids。当这样做时, 每个细胞成分可以暴露在任何给定的药物, 生长因子, 生化抑制剂, 基因改造, 或化学处理之前, 重组和化形成。因此, 使用 "化验" 将允许确定特定药物治疗或基因修饰对干细胞或其生态位对应物是否有特定的影响。
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Protocol
所有的程序都是根据当地的动物福利法和指导方针进行的。
1. 文书、文化媒体和菜肴的准备
- 高压釜1套肠剪刀、普通剪刀和无菌容器中的镊子。
- 在37° c 的恒温箱中放置一个96井 (平底) 盘。
- 用材料表中所列试剂制备10毫升的完整培养基。
- 在37° c 的水浴中孵育整个培养基。
- 把地下室的膜放在冰桶里融化。重组后的基底膜将在4° c 时变为液体。
- 用冷磷酸盐缓冲盐水或简称 PBS (4 ° c) 填充4培养皿。
2. 小肠棺的分离
- 牺牲 CO2吸入Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2鼠标在 C57BL6/J 背景上。用剪刀对腹膜进行纵向解剖。
- 用钳子抓住胃, 把它切成横。
- 使用肠剪刀从现在起, 拉出肠道和放置在一个培养皿含有 PBS。
注: 肠剪刀有尖锐和钝尖。这些剪刀的钝尖是为了不破坏地穴绒毛建筑, 同时打开肠道。 - 先把钝尖放进胃里, 然后轻轻地把它穿过幽门。继续用剪刀剪, 用钳子拉。
- 一旦整个小肠被纵向打开, 在冷 pbs 中用镊子把它拿出来, 用 U 形的动作轻轻地冲洗它在 pbs 溶液中。
- 一旦所有的粪便残渣被清除, 继续在砧板上平坦的肠道, 腔一侧向上。腔侧是容易辨认的由血管的缺席和它的苍白出现与外在部分比较。
- 用玻璃滑动, 通过刮平的肚腑轻轻地去除绒毛。沿着整个组织的长度执行这一步骤两次。
- 将不育的手术刀片切成 2-5 毫米的小肠。
- 将小肠碎片放在50毫升的管中, 其中含有10毫升的冰冷 PBS。
- 通过在 PBS 中上下移, 清除组织碎片, 去除残留的杂质。丢弃上清, 重复此步骤, 直到 PBS 完全清楚。
- 加入15毫升冷 pbs, 使 pbs 的最终总容量为25毫升。在4° c 的滚筒上加入2毫米乙酸酸 (EDTA), 孵育45分钟。
- 丢弃 PBS/EDTA。
- 添加10毫升 PBS 和分离的棺通过严厉移组织碎片上下 (至少三次)。收集上清。
- 重复步骤2.13 四次。添加培养基以达到50毫升的最终体积。
- 通过离心 (300 x g 为5分钟) 将细胞颗粒。
- 重10毫升培养基中的颗粒和棺的离心 (80 x g 3 分钟)。
3. 单细胞制备
- 丢弃颗粒状棺的上清液, 在1毫升胰蛋白酶样酶中重它们, 连同50µL dnasei (50 µg/毫升)。
- 在32° c 的水浴中孵育细胞2分钟。
- 添加10毫升培养基。将棺分离成单个细胞, 移至少5次。
- 过滤解决方案通过一个40µm 过滤器 (以消除团簇和其他杂质) 和颗粒的单个细胞在 300 x g 5 分钟。
4. 流式细胞仪和电镀
- 准备50毫升的1x 汉克的缓冲盐溶液或 HBSS/2%fetal 牛血清 (FCS) 溶液和重每 106细胞1毫升的颗粒
- 添加到细胞悬浮 BV421 林- (CD31, CD45, TER119) 在浓度为 1:100, CD24-APC 和 CD117-PE 都在1:250 抗体浓度为30分钟。
- 将Lgr5+ 的干细胞和氏细胞分类成单独的低绑定管。有关Lgr5+ 和氏单元格的排序协议的详细信息, 请参阅罗斯et al.7和 Schewe et al.6
- 离心分离的细胞在 300 x g 为 5 min. 重100µL 介质中的单元格, 其中的组件为 1.3 (请参见材料目录)。
- 治疗 (例如, 通过化学或基因修饰) 氏细胞 (n = 2000) 或Lgr5+干细胞 (n = 2000)。
- 为了治疗细胞, 使用5µL 脂质体介导的转染试剂在总体积100µL 培养基和小干扰 RNA (siRNA) 的浓度 100 nM。孵育30分钟, 在37° c 为 siRNA 或为所选的修改所需的时间。
- 在500µL 培养基中两次冲洗细胞。
- 离心机在 300 x g 为 5 min, 重10µL 培养基中的细胞。
- 将两个蜂窝组件 (氏或Lgr5+单元格) 集中在20µl 总体积和离心机中, 在 300 x g 处进行5分钟的 RT。
- 在 RT 中共孵化氏和Lgr5+单元格10分钟。
- 去除10µL 的上清液, 留下一个半月板的液体, 以确保不吸细胞颗粒。
- 在 5ml 96 井板中, 将重组基底膜的30µL 添加到细胞中, 总体积为40µL, 重细胞和板。10分钟后, 添加200µL 的完整介质 (请参见材料表)。每48小时更换培养基。
- 计数化多样性在天5。
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Representative Results
化重构试验允许对小肠上皮细胞的基本生态位和干细胞成分进行单独的功能分析, 这是由Apc基因的小干扰 RNA (siRNA) 证明的。
为了达到这个目的, 我们首先利用荧光活化细胞分类 () 分离 8000 Lgr5+细胞和6000氏细胞从近亲 C57BL6/J 小鼠。在图 1a中, 描述了该方法的流程图。化重组能力的评估, 孵化Lgr5+细胞与 siRNA 寡核苷酸针对的 mRNA 的Apc或包括一个混乱序列 (SCR) 作为一个控制。治疗后, 相同的 siRNA 治疗的Lgr5+细胞要么直接镀在化培养基/重组基底膜上, 要么用等量的未经处理的氏细胞孵育, 随后被镀出来。作为一个控件, 未经处理的Lgr5+单元格单独被镀 (即, 没有氏单元格) 来确定从未经处理的Lgr5+单元格派生的 organoids 的数量。此外, 作为一个额外的控制, 氏细胞单独被镀检查的背景化形成的污染 Paneth-Lgr5 细胞双峰排序在氏细胞门。如预期, siRNA 介导的小鼠Apc基因在Lgr5+干细胞 (和由此产生的规范 Wnt/β-蛋白信号通路的活化), 积极影响化的多样性相比未经处理的对应方或已加密的控件 (图 1B)。本构 Wnt 激活也拯救了对氏细胞的要求, 如先前所报告的1。此外, 这些 organoids 出现作为空心球体 (椭球), 一个良好的描述表型为Apc-突变或 Wnt 刺激 organoids (图 1C, 面板 1), 与那些从 Paneth-Lgr5 细胞获得的形态学比较双峰 (图 1C, 面板 2)8,9。总的来说, 这些结果表明, 重组氏单元和Lgr5+ 单元可以洞察这两个单元格类型中的特定于单元的机制;organoids 的形态学分析在这方面可能是有价值的, 因为 organoids 的形态学反映了他们的细胞组成 (例如, 椭球由Lgr5+ 单元格构成)。另一个要考虑的重要参数是化的复杂性 (例如, 隐窝萌芽事件的数量)。
图1。siRNA 介导的Apc在 Lgr5+单元格中的击倒效果。(A)实验过程的流程图。Lgr5EGFP报告鼠 (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1被用作Lgr5+排序的干细胞源。氏单元格按指示进行排序, 以前描述为6,7。(B)化在重构Lgr5+干细胞和氏细胞时观察到的多重性。当指示的细胞被 siRNA 的寡核苷酸对apc (siRNA apc) 或被打乱的 (SCR) 控制序列进行预处理时。星号表示有统计学意义的差异 (n = 3, * p < 0.05 ** p < 0.001)。误差线指 SD (1) Lgr5+单元格, (2) Lgr5+单元格 SCR, (3) Lgr5+单元格 siRNA Apc, (4) Lgr5+单元格 + 氏单元格, (5) Lgr5+单元格 siRNA Apc + 氏细胞, (6) 氏细胞。(C) organoids 的代表图像来自 (1) Lgr5+单元格 siRNA Apc、(2) Lgr5+氏单元格。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该方法允许对肠道干细胞生态位的两个基本成分, 即Lgr5+和氏细胞进行精细的功能分析。此方法以前已被我们和其他一些轻微修改6,10,11。在这里, 我们提出了作为一个可重复和标准化的实验室协议的过程。此外, 我们报告的影响, Apc下调在Lgr5+干细胞, 作为一个例子的可能性实施遗传 (或生物化学的6) 对排序的蜂窝组件的修改。总的来说, 数据显示, siRNA 介导的Apc击倒增强了Lgr5+单元格的干细胞功能, 如增加的化多样性 (图 1B) 所示。
使用肠道3D 化文化的几个优点已经在审查4中列出, 其中包括其组织与隐窝绒毛结构的惊人相似性在体内, 特别是当与建筑学从标准2D 文化方法与永生的细胞线。然而, 这种方法的一个主要限制是, 在大多数情况下, 化文化是建立从整个肠道棺, 一个过程, 不允许功能分析其个别组成部分, 特别是, 茎和利基单元格, 分别由Lgr5+和氏单元格表示。
这是克服这些局限的。茎和小生境细胞可以分别从动物和重组, 以产生 organoids。因此, 这种方法允许对这两种细胞成分进行功能分析, 要么采用带有特定基因修饰的小鼠模型, 要么暴露于特定的应力因子 (例如、DSS 和/或特定的饮食);或直接修改已排序的细胞基因 (siRNA, CRISPR-Cas9) 或生化, 然后重组它们生成 organoids。所产生的 organoids 的多样性、形态学、自我更新能力和分化程度 (最终化生变化的程度) 可以作为功能性的读出。在遗传操作的情况下, 如 siRNA, 当形态学效果不明显时, 应在转染后一小时分析细胞, 以验证感兴趣的 mRNA 被击倒。氏和Lgr5+ 也可以从具有不同突变基因的小鼠中进行分类, 以研究干细胞和小生细胞中的不同突变是否导致这两种细胞类型之间的相互作用和不同的化形成效率和/或形态学。
协议中的关键步骤是去除绒毛 (步骤 2.7) 和 HBSS/2%FCS 中细胞的悬浮 (步骤 4.1)。去除绒毛的关键是丰富氏和Lgr5+ 单元格位于棺的下部, 以提高排序效率。尽管在 pbs/FCS 中一般都建议对细胞进行分类, 但使用 HBSS 代替 pbs, 在整个分拣时间内保持细胞活力稳定。其他重要步骤是步骤4.7 和 4.8, 在这里, 氏和Lgr5+单元格的物理关联允许这些沿袭形成双峰, 最终导致 organoids。
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Disclosures
作者没有竞争的财务利益或其他利益冲突
Acknowledgments
这项研究是由荷兰癌症协会 (凯) 资助的。EMCR 2012-5473) 和世界癌症研究基金国际 (WCRF; 2014-1181 号项目)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
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