Summary
장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.
Abstract
장 상피는 매우 빠른 회전 속도 의해 특징입니다. 포유류에서 전체 상피 안 대기는 4-5 일 이내에 갱신 됩니다. 성인 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 하단에, Lgr5 유전자의 표현에 의해 배정 있으며 그들의 특성 높은 증식 속도1통해 항상성 유지. 작은 창 자에 걸쳐 Lgr5+ 줄기 세포 Paneth 세포 라고 하는 특수 분 비 세포와 혼합 된. Paneth 세포 항균 화합물 (즉, lysozyme과 cryptdins/defensins) 분 비와 창 자 식물에 제어 역할을 발휘. 더 최근에, 소설 함수 Paneth 세포, 즉 그들의 용량을 Wnt3, EGF, 및 Dll12로 몇 가지 주요 ligands 통해 Lgr5+ 줄기 세포 틈새 지원 제공에 대 한 발견 되었습니다.
전 비보 를 격리 하 고 특정 성장 인자와 세포 외 기질 구성 요소 존재 양식, 전체 장 지하실을 일으키 긴와 매우 유사한 크립 트 모 organoids 라는 자체 3D 구조를 갱신 성인 소장3의 상피 아키텍처입니다. Organoid 문화, 전체 지하실에서 설치 될 때 비록 그것의 개별 구성 요소, 즉는 Lgr5+ 의 기여를 해결 하지 않고 자기 갱신의 연구와 장 줄기 세포 틈새의 허용 및 Paneth 세포입니다.
여기, organoid 분석 결과 Paneth의 능력을 활용 하는 새로운 접근 방식을 설명 및 Lgr5+ 연결 하 고 organoids 형성을 셀 때 공동 경작. 이 이렇게, 여기 "organoid 재구성 분석 결과" 라고 (오 라), Paneth 유전 그리고 생 화 확 적인 수정할 수 있게 또는 Lgr5+ organoids로 재구성 뒤 줄기 세포. 따라서, 장 줄기 세포 틈새의 두 가지 주요 구성 요소 기능 분석을 수 있습니다.
Introduction
장 상피 포유류 몸에 있는 가장 빠르게 자기 갱신 조직 그리고, 따라서, 식별 및 크립 트의 하단에는 성인 줄기 세포의 기능적 특성을 겨냥 하는 연구의 과다의 개체 Lieberkühn, Lgr5 유전자의 표현에 의해 갑니다 고 정식 Wnt 신호1의 특히, Lgr5+ 줄기 세포 형벌 이며 전문된 틈새 세포, 즉 Paneth 세포, 또한 그들의 성숙2Wnt 신호에 의존 하는 의해 지원. 함께, 이러한 두 셀 형식 자체-갱신 창 자 상피 안 대기의 기초 및 일일 homeostatic 균형 유지: Lgr5+ 줄기 세포는 급속 하 게 분할 하 고 뿌리를 및 더 많은 전문 장 상피 셀; Paneth 세포 제공 필수 틈새 요인 (예를 들어, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ 줄기 세포2. 장 지하실 때 도금 비보 전 조직과 자체 갱신 구조를 형성 하기 위하여 organoids, 또는 "미니-배 짱", 용량 자체 갱신 등 프로세스에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험 도구로 이용 되 고 암4를 포함 하 여 정상 및 병 적인 조건에서 차별화. Organoid 문화 소장, 췌 장, 간, 그리고 신장, 마우스 및 인간의 샘플4에서 포함 하 여 여러 조직에서 설립 되었습니다. 추출 방법 및 성장 요인이 organoid 문화를 개발 하는 조직 및 다중 계보 차별화를 운전 하 고 최대한 원래 줄기 세포 틈새를 모방 하도록 설계 된 vivo에서. Organoids는 유전 질환의 치료, 암에서 치료 효능, 약물 독성의 분석 또는 생체 외에서organogenesis5의 연구의 평가 포함 하 여 잠재적인 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
전반적으로, organoid 문화 조직 샘플에서 설립 하는 때의 주요 제한은 세포 특이성의 부족입니다. 예를 들어 장 organoids 전체 장 지하실에서 설립 조직 소스 내 포함 개별 세포 구성 성분의 분석을 허용 하지 않습니다 (예를 들어, 전체 지하실 포함 Lgr5+, Paneth, 그리고 조상 세포)입니다.
여기, 우리 소설 메서드, 오 라로 그것의 가장 기본적인 구성 요소, 즉 줄기 (Lgr5+)와 틈새 (Paneth) 세포의 기능 분석 장 organoid 문화의 장점을 결합 하 여 설명 합니다. 이 Paneth의 독특한 능력을 통해 이루어집니다 그리고 실제로 공동 인 큐베이 팅 및 organoids2,,610을 때 서로 연관 Lgr5+ 세포. 우리는이 기능 활용 하 고 미리 organoids를 다시 구성 하도록 허용 하기 전에 개별적으로 2 개의 세포 유형 취급. 때 이렇게, 특정된 약물, 성장 인자, 생화학 억제제, 유전자 조작, 또는 재구성 및 organoid 형성 전에 화학적 치료 각 셀 구성 요소를 노출 될 수 있습니다. 따라서, 지금 분석 결과 사용 하 여 특정 약물 치료 또는 유전 수정에 줄기 세포 또는 그들의 틈새에 특정 효과 있는지 여부의 결정을 허용할 것 이다.
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Protocol
모든 절차는 로컬 동물 복지 법률과 지침에 따라 수행 되었다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
- 장가 위, 일반가 위, 및 살 균 컨테이너에 집게의 압력솥 1 세트.
- (플랫 바닥) 96 잘 접시 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치
- 시 약 재료의 테이블에 나열 된 완전 한 문화 매체의 10 mL를 준비 합니다.
- 물 욕조에 37 ° C에서 완전 한 매체를 품 어.
- 해 동 한 얼음 양동이에 그것을 배치 하 여 지하실 멤브레인을 재구성 된다. 재구성 된 지하실 막 4 ° C에 액체 될 것입니다.
- 인산 염 버퍼 차가운 식 염 수 또는 약식된 PBS (4 ° C)로 4 접시를 채우십시오.
2입니다. 작은 창 자 지하실의 격리
- Lgr5-eGFP IRES 있다t2 마우스 C57BL6/J 배경에 CO2 흡입에 의해 희생. 가 위 쌍 복 경도 해 부.
- 집게와 위를 누른 종횡 반으로 잘라.
- 이제 장가 위를 사용 하 여, 내장을 꺼내 고 PBS를 포함 하는 페 트리 접시에 놓습니다.
참고: 장가 위는 샤 프와 무딘 팁 있다. 무뚝뚝한 끝이가이 위 소장을 여는 동안 토 굴 모 건축을 손상 하지 의미입니다. - 복 부에 무뚝뚝한 끝을 배치 하 여 시작 하 고 부드럽게는 pylorus 통해 밀어. 여는 위로 절단 하 고 당기는 집게와 함께 진행 합니다.
- 일단 전체 소장 경도 열는 집게로 잡고 차가운 PBS에서 그것을 세척 하 고 부드럽게 U 모양 움직임으로 PBS 솔루션에 그것을 씻어.
- 모든의 자 나머지는 들어가면 절단 보드, luminal 쪽에 내장을 평평 하 게 진행 합니다. Luminal 측면은 쉽게 인식할 수 있는 혈관의 부재 및 외부 부품과 비교 될 때 창백한 모습.
- 유리 슬라이드, 부드럽게 제거는 villi 평평된 내장 된다고 하 여. 이 단계는 조직의 전체 길이 따라 두 번 수행 합니다.
- 2-5 밀리미터 조각으로 메 마른 외과 블레이드와 소장을 잘라.
- 포함 하는 얼음 차가운 PBS의 10 mL 50 mL 튜브에 작은 창 자 조각 놓습니다.
- PBS에서 그들을 아래로 pipetting으로 모든 남아 있는 불순물을 제거 조직 파편을 청소. 상쾌한 삭제 하 고 PBS 완전히 취소 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
- 25 ml PBS의 총 최종 볼륨을가지고 15 mL 차가운 PBS를 추가 합니다. 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 추가 하 고 4 ° c.에 롤러에 45 분 동안 품 어
- PBS/EDTA를 삭제 합니다.
- PBS의 10 mL을 추가 하 고 거칠게 pipetting 조직 조각을 아래로 (세 번 이상)는 지하실을 분리. 상쾌한을 수집 합니다.
- 반복 단계 2.13 4 시간. 문화 매체 도달 50 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
- 원심 (300 x g 5 분)에 의해 셀을 펠 렛.
- 문화 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 원심 (80 x g 3 분)으로 지하실을 작은.
3. 단일 셀 준비
- 수송과 지하실의 상쾌한 무시 하 고 1 mL의 트립 신 같은-효소 50 µ L 함께 resuspend DNAse (50 µ g/mL).
- 2 분 동안 32 ° C에 물 욕조에 셀을 품 어.
- 문화 매체의 10 mL를 추가 합니다. 가혹 하 게 아래로 5 번 이상 pipetting으로 단일 셀에는 지하실을 해리.
- 40 µ m 여과기 (덩어리 및 기타 불순물 제거)를 통해 솔루션을 필터링 및 5 분에 대 한 300 x g에서 단일 셀을 작은.
4. flow Cytometry 및 도금
- 1 x 행 크의 버퍼링 된 소금 솔루션 또는 HBSS/2% 소 태아 혈 청 (FCS) 솔루션 50 mL를 준비 하 고 모든 106 셀 1 mL에 펠 릿 resuspend
- 세포 현 탁 액 BV421 린- (CD31, CD45, TER119) 30 분 1: 250 항 체의 농도에서 1: 100, 및 CD24-APC CD117-PE 모두의 농도에 추가 합니다.
- 정렬 Lgr5+ 줄기 세포 그리고 Paneth 세포로 별도 낮은 바인딩 튜브. 정렬에 대 한 프로토콜에 대 한 내용은 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포, 보십시오 로스 외. 7 과 Schewe 외. 6
- 5 분에 대 한 300 x g에서 정렬된 셀 1.3에서 설명 하는 구성 요소와 100 µ L 매체에 셀 Resuspend 원심 분리기 ( 재료의 표참조).
- (예를 들어, 화학 또는 유전 수정에 의해) Paneth 세포 치료 (n = 2000) 또는 Lgr5+ 줄기 세포 (n = 2000).
- 세포 치료를 사용 하 여 transfection liposome 중재 시 약의 5 µ L 100 µ L 문화 매체와 100의 농도에 작은 간섭 RNA (siRNA)의 총 볼륨에 nM. SiRNA 또는 선택한 수정에 필요한 시간 동안 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
- 워시 500 µ L 문화 매체에 두 번 셀.
- 5 분 x 300g에 centrifuge 고 10 µ L 문화 매체에 셀 resuspend.
- 수영장 2 개의 세포 구성 성분 (Paneth 또는 Lgr5+ 세포)는 20 µ l 총 볼륨에 실시간에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기
- 공동은 Paneth 품 어 및 Lgr5+ 셀 실시간에서 10 분
- 상쾌한의 10 µ L을 제거 하 고 반드시 셀 펠 릿을 발음 하지 액체의 초승달 모양을 두고.
- 40 µ L의 전체 볼륨에 대 한 셀을 재구성된 지하실 막의 30 µ L을 추가 하 고 셀 resuspend는 미리 데워 진 96 잘 접시 접시. 10 분 후 완전 한 매체의 200 µ L 추가 ( 재료의 표참조). 변화 중간 마다 48 h입니다.
- 날 5에 organoid 다양성을 계산 합니다.
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Representative Results
Organoid 재구성 분석 결과 Apc 유전자의 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 증명 여기 장 상피의 필수 틈새 및 줄기 세포 구성 요소의 별도 기능 분석을 수 있습니다.
이 목표를 달성 하기 위해 우리는 먼저 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 타고 난된 C57BL6/J 쥐에서 8000 Lgr5+ 세포와 6000 Paneth 세포를 분리 하 활용. 그림 1a또는 분석 결과의 순서도 그려져 있습니다. Organoid 재구성 용량 siRNA oligonucleotides Apc 의 mRNA에 대 한 감독과 Lgr5+ 세포를 배양 하 여 평가 되었다 또는 컨트롤로 스크램블된 시퀀스 (SCR)을 포괄. 치료 후, 같은 siRNA 치료 Lgr5+ 세포 중 organoid 매체/재구성 지하실 멤브레인에 직접 도금 또는 치료 Paneth 세포의 동등한 수와 함께 알을 품 되었고 그 후 밖으로 도금. 컨트롤, 치료 Lgr5+ 세포는 혼자 도금 했다 (즉, Paneth 세포 없이) 치료 Lgr5+ 세포에서 파생 된 organoids의 수를 확인 하려면. 또한, 추가 컨트롤, Paneth 세포 혼자 Paneth Lgr5 셀 남자 Paneth 세포 게이트 정렬의 오염에서 파생 된 organoid 형성의 배경에 대 한 확인을 도금 했다. Lgr5+ 줄기 세포 (와 정식 Wnt/β-catenin 신호 통로의 결과 활성화) murine Apc 유전자의 siRNA 중재 최저 organoid 다양성에 비해 긍정적인 영향을 예상 했던 대로, 치료 대응 또는 스크램블된 제어 (그림 1B). 제정 Wnt 활성화는 또한 이전에 보고 된1Paneth 세포에 대 한 요구를 구출. 또한, 이러한 organoids 등장으로 속이 빈 구체 (spheroids), Apc에 대 한 설명된 잘 표현 형-돌연변이 또는 Wnt 자극 organoids (그림 1C, 패널 1), Paneth Lgr5 세포에서 얻은 그의 형태와 비교할 때 (그림 1 C, 패널 2) 남자8,9. 샨 다, 이러한 결과 재구성 보여 Paneth 세포와 Lgr5+ 셀 내에서 이러한 두 셀 형식; 세포 특정 메커니즘에 통찰력을 줄 수 있습니다 현미경 검사 법에 의해 organoids의 형태소 분석 유용할 수 있습니다이 점에서 organoids의 형태로 반영 셀 구성 이후 (예를 들어, spheroids에 의해 구성 된다 Lgr5+ 만 셀). 고려 될 또 다른 중요 한 매개 변수 (예를 들어, 암호 신진 이벤트 수) organoid의 복잡성 이다.
그림 1입니다. SiRNA의 효력 중재에 Lgr5 Apc 의 최저+ 셀. (A) 실험 절차의 흐름도. Lgr5 EGFP 기자 쥐 (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1 Lgr5+ 의 소스 정렬 줄기 세포로 채택 되었다. Paneth 세포 표시 하 고 앞에서 설명한6,7정렬 했다. (B) Organoid 다양성 관찰 Lgr5+ 줄기 세포 그리고 Paneth의 재구성에 따라 셀. 표시 된 셀은 청소용으로 siRNA oligonucleotides Apc (siRNA Apc)에 대 한 감독 또는 발진 (SCR) 제어 시퀀스. 별표 표시 통계적으로 유의 한 차이 (n = 3, * p < 0.05 * * p < 0.001). 오차 막대 sd (1). Lgr5+ 셀 참조, (2) Lgr5+ 세포 SCR, (3) Lgr5+ 세포 siRNA Apc, (4) Lgr5+ 셀 + Paneth 세포, (5) Lgr5+ 세포 siRNA Apc + Paneth 세포, (6) Paneth 세포. (C) organoids의 대표 이미지 (1) Lgr5+ 세포 siRNA Apc, (2) Lgr5+-Paneth 세포에서에서 파생. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
오 라는 두 가지 필수 구성 요소 장 줄기 세포 틈새의 즉 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포의 세련 된 기능 분석을 허용 한다. 이 방법은 이전 우리와 다른 사람에 의해 약간의 수정6,,1011를 고용 하고있다. 여기, 재현할 수 및 표준화 된 실험실 프로토콜 또는 프로시저 선물이. 또한, 우리 유전자 구현의 가능성의 예를 들어 Lgr5+ 줄기 세포, Apc downregulation의 효과에 보고 (또는 생화학6) 정렬된 세포 구성 요소에 대 한 수정. 데이터는 siRNA를 표시 하는, 증가 organoid 복합성 (그림 1B)에 의해 표시 된 대로 Apc 의 중재 최저 Lgr5+ 세포의 줄기 세포 기능을 향상 시킵니다.
장 3D organoid 문화를 사용 하 여 몇 가지 장점이 이미 리뷰4, 특히에 비교 될 때 그 토 굴 모 아키텍처에는 vivo에서, 그들의 조직의 눈에 띄는 닮 았을 포함 한에 나열 되어 있는 불멸 하 게 셀 라인 표준 2 차원 문화 메서드에서 아키텍처. 그러나,이 방법의 주요 한계 중 하나는 대부분의 경우, organoid 문화과, 개별 부품의 기능 분석을 허용 하지 않는 프로세스 전체 장 지하실에서 설립 하는 특히, 줄기 및 틈새의 셀, 여기 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포로 표현 하는 각각.
지금 이러한 한계를 극복 한다. 줄기 및 틈새 세포를 별도로 동물에서 정렬 하 고 organoids를 생성 하기 위해 재구성 될 수 있습니다. 따라서,이 이렇게 특정 유전 수정 운반 중 고용 마우스 모델에 의해이 두 세포 구성 성분의 기능 분석을 수 또는 특정 스트레스 요인 (예, DSS 또는 특정 다이어트); 노출 또는 직접 유전자 정렬된 셀을 수정 하 여 (siRNA, CRISPR-Cas9) 또는 화학적, organoids를 생성 하는 그들을 재구성 하기 전에. 다양성, 형태, 자기 갱신 용량 및 차별화 (그리고 결국 metaplastic 변경의 범위)의 결과 organoids의 범위는 기능 지요로 사용할 수 있습니다. 유전자 조작, siRNA, 같은 경우 형태학 효과 분명 때 세포 분석 되어야 합니다 transfection 관심의 mRNA의 최저 유효성을 후 한 시간. Paneth 및 Lgr5+ 또한이 두 세포 유형 및 다른 organoid 간의 상호 작용을 변경된 이어질 줄기 및 틈새 셀에 다른 돌연변이 여부를 공부 하는 다른 돌연변이와 유전자 조작 생쥐에서 분류 될 수 있다 형성 효율 또는 형태학입니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 villi (2.7 단계)의 제거 및 물의 resuspension 셀 HBSS/2%FCS (단계 4.1)에 합니다. villi의 제거는 중요 Paneth 풍부 하 고 Lgr5+ 세포와 정렬의 효율을 개선 하는 지하실의 더 낮은 세 번째에 있는. FACS 프로토콜은 일반적으로 PBS/FCS에서 셀 정렬 제안, 비록 HBSS 대신 PBS 사용 하 여 증가 하 고 세포 생존 능력을 정렬 시간에 걸쳐 안정 유지. 다른 중요 한 단계는 4.7과 4.8, 어디에 물리적 Paneth의 협회 및 Lgr5+ 셀 수행 상승 organoids에 게 결국 것입니다 양식 남자를이 계보를 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 금융 관심 또는 다른 충돌
Acknowledgments
이 연구 (KWF; 네덜란드 암 학회 로부터 자금에 의해 가능 하 게 되었다 EMCR 2012-5473)와 세계 암 연구 기금 국제 (WCRF; 프로젝트 번호 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
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- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
