Summary
आंतों organoid संस्कृतियों पूरे तहखाने से स्थापित कर रहे हैं और एक सेल विशेष फैशन में आत्म नवीकरण और भेदभाव के विश्लेषण की अनुमति नहीं है । इस प्रोटोकॉल हल स्टेम (Lgr5+) और आला (Paneth) कोशिकाओं है, जो organoids को जंम देते समय उनके पहले जैव रासायनिक और आनुवंशिक संशोधन और कार्यात्मक विश्लेषण को सक्षम करने के पुनर्गठन का वर्णन करता है ।
Abstract
आंतों उपकला एक अत्यंत तेजी से कारोबार की दर की विशेषता है । स्तनधारियों में, पूरे उपकला अस्तर 4-5 दिनों के भीतर नए सिरे से है. वयस्क आंत्र स्टेम कोशिकाओं Lieberkühn के तहखाने के नीचे रहते हैं, Lgr5 जीन की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित हैं, और उनकी विशेषता उच्च प्रफलन दर1के माध्यम से homeostasis की रक्षा । छोटी आंत के दौरान, Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं विशेष स्रावी कोशिकाओं Paneth कोशिकाओं कहा जाता है के साथ मिश्रित कर रहे हैं । Paneth कोशिकाओं जीवाणुरोधी यौगिकों (यानी, lysozyme और cryptdins/defensins) स्रावित और आंतों वनस्पति पर एक नियंत्रित भूमिका डालती है । अभी हाल ही में, एक उपंयास समारोह Paneth कोशिकाओं के लिए खोज की गई है, अर्थात् उनकी क्षमता के लिए आला समर्थन प्रदान करने के लिए Lgr5+ स्टेम सेल Wnt3, EGF, और Dll12के रूप में कई महत्वपूर्ण लाइगैंडों के माध्यम से ।
जब अलग पूर्व vivo और विशिष्ट विकास कारकों और extracellular मैट्रिक्स घटकों की उपस्थिति में प्रसंस्कृत, पूरे आंत्र तहखाना लंबे समय तक रहने वाले और आत्म नवीकरण 3 डी संरचनाओं को जन्म दे organoids कहा जाता है कि अत्यधिक तहखाने-अंकुर समान वयस्क छोटी आंत की उपकला वास्तुकला3. Organoid संस्कृतियों, जब पूरे तहखाने से स्थापित, स्व के अध्ययन के नवीकरण और आंत्र स्टेम सेल आला के भेदभाव की अनुमति है, हालांकि इसके व्यक्तिगत घटकों के योगदान को संबोधित कर के बिना, अर्थात् Lgr5+ और Paneth कक्ष ।
यहां, हम organoid परख के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण का वर्णन है कि Paneth और Lgr5+ कोशिकाओं की क्षमता का लाभ लेता है सहयोगी और organoids के रूप में जब सह संस्कृति । इस दृष्टिकोण, यहां के रूप में संदर्भित करने के लिए "organoid पुनर्गठन परख" (ORA), आनुवंशिक और जैव रासायनिक संशोधन की अनुमति देता है Paneth या Lgr5+ स्टेम सेल, organoids में पुनर्गठन के बाद । जैसे, यह आंत्र स्टेम सेल आला के दो मुख्य घटकों के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है ।
Introduction
आंतों उपकला स्तनधारी शरीर में सबसे तेजी से आत्म नवीकरण ऊतक है और, इस तरह के रूप में, तहखाने के तल पर रहने वाले वयस्क स्टेम कोशिकाओं की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के उद्देश्य से अध्ययन के ढेर सारे की वस्तु किया गया है Lieberkühn की, निर्धारित की अभिव्यक्ति द्वारा Lgr5 जीन और विहित Wnt संकेतों पर निर्भर1. विशेष रूप से, Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं और पार्श्व विशेष आला कोशिकाओं, यानी Paneth कोशिकाओं है, जो भी उनकी परिपक्वता2के लिए संकेत Wnt पर निर्भर द्वारा समर्थित हैं । एक साथ, इन दो कोशिका प्रकार आबाद आंत्र उपकला अस्तर के स्व-नवीकरण और दैनिक समस्थिति संतुलन की रक्षा: Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं तेजी से विभाजित और जनक और अधिक विशेष आंत्र उपकला को जन्म दे कोशिकाओं; Paneth कोशिकाओं आवश्यक आला कारकों (जैसे, Dll1, Wnt3, EGF) प्रदान करने के लिए Lgr5+ स्टेम सेल2। आंतों तहखाने की क्षमता जब चढ़ाया पूर्व vivo को संगठित और स्व-नवीकरण संरचनाओं organoids, या "मिनी हिंमत" कहा जाता है, एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में ऐसे स्व के रूप में प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के नवीकरण और शोषण किया गया है 4कैंसर सहित सामान्य और रोग की स्थिति में भेदभाव. Organoid संस्कृतियों कई ऊतकों से स्थापित किया गया है, आंत सहित, अग्ंयाशय, जिगर, और गुर्दे, दोनों माउस और मानव नमूने4से । निष्कर्षण विधि और विकास के लिए इन organoid संस्कृतियों के विकास के लिए कार्यरत कारकों ऊतक विशिष्ट है और बहु वंश भेदभाव ड्राइव और के रूप में संभव के रूप में मूल स्टेम सेल आला vivo में नकल करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । Organoids आनुवंशिक रोगों के उपचार सहित संभावित अनुप्रयोगों हो सकता है, कैंसर में चिकित्सीय प्रभावकारिता का आकलन, दवा विषाक्तता के विश्लेषण, या organogenesis के अध्ययन इन विट्रो में5.
कुल मिलाकर, organoid संस्कृतियों की मुख्य सीमा जब ऊतक नमूनों से स्थापित सेल विशिष्टता की कमी है । उदाहरण के लिए, आंतों organoids पूरे आंत्र तहखाना से स्थापित व्यक्तिगत सेलुलर घटकों के विश्लेषण ऊतक स्रोत के भीतर शामिल की अनुमति नहीं देते (उदा., पूरे तहखाना होते हैं Lgr5+, Paneth, और जनक कक्ष) ।
यहां, हम एक उपंयास विधि का वर्णन, ORA के रूप में संदर्भित, कि अपने सबसे बुनियादी घटकों के कार्यात्मक विश्लेषण के साथ आंत्र organoid संस्कृतियों के लाभों को जोड़ती है, अर्थात् स्टेम (Lgr5+) और आला (Paneth) कोशिकाओं । यह Paneth और Lgr5+ कोशिकाओं की अद्वितीय क्षमता के माध्यम से प्राप्त की है शारीरिक रूप से एक दूसरे के साथ सहयोगी जब सह-मशीन और organoids को जंम देने के लिए2,6,10। हम इस सुविधा का लाभ लिया और पूर्व उंहें organoids पुनर्गठन की अनुमति देने से पहले दो सेल प्रकार व्यक्तिगत रूप से इलाज किया । ऐसा करने पर, प्रत्येक कोशिका घटक को पुनर्गठन और organoid गठन से पहले किसी भी दवा, विकास कारक, जैव रासायनिक अवरोधक, आनुवंशिक संशोधन, या रासायनिक उपचार से अवगत कराया जा सकता है । इसलिए, ORA परख का उपयोग कर कि एक विशिष्ट दवा उपचार या आनुवंशिक संशोधन स्टेम सेल या उनके आला समकक्ष पर एक विशिष्ट प्रभाव है के निर्धारण की अनुमति देगा ।
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Protocol
सभी प्रक्रियाएं स्थानीय पशु कल्याण कानूनों और दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया ।
1. उपकरणों की तैयारी, संस्कृति मीडिया, और व्यंजन
- आटोक्लेव एक बाँझ कंटेनर में आंतों कैंची, सामान्य कैंची, और संदंश के 1 सेट.
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एक ९६-अच्छी तरह से (फ्लैट नीचे) पकवान प्लेस ।
- सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध रिएजेंट के साथ पूर्ण संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
- एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूरा मध्यम गर्मी ।
- गल यह एक बर्फ की बाल्टी में रखकर तहखाने झिल्ली का पुनर्गठन किया । गठित तहखाने झिल्ली 4 डिग्री सेल्सियस पर तरल हो जाएगा ।
- 4 पेट्री डिश को कोल्ड फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा या संक्षिप्त पंजाब (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ भरें ।
2. छोटे आंत्र तहखाने का अलगाव
- सह द्वारा बलिदान2 साँस लेना एक Lgr5-eGFP-आयरेस-CreERटी 2 माउस एक C57BL6/ टुकड़े को एक जोड़ी कैंची से longitudinally ।
- संदंश के साथ पेट को पकड़ लें और इसे आधे में transversally काट लें ।
- अब से आंतों कैंची का प्रयोग, बाहर आंत खींचो और यह एक पेट्री युक्त डिश में जगह पंजाबियों ।
नोट: आंतों कैंची एक तेज और एक कुंद टिप है । इन कैंची के कुंद टिप तहखाने अंकुर वास्तुकला को नुकसान नहीं है, जबकि आंत खोलने का मतलब है । - पेट में कुंद टिप रखने और धीरे से यह जठरनिर्गम के माध्यम से धक्का द्वारा शुरू करो । कैंची के साथ काटने और संदंश के साथ खींच कर आगे बढ़ें ।
- एक बार पूरी छोटी आंत longitudinally खोल दिया जाता है, यह संदंश के साथ पकड़ और धीरे यू के आकार आंदोलनों के साथ पंजाब के समाधान में कुल्ला इसे ठंडे पंजाबियों में धो लो ।
- एक बार सभी मल अवशेष को मंजूरी दे दी है, एक काटने बोर्ड पर आंत समतल करने के लिए आगे बढ़ना, चमकदार ओर । चमकीला पक्ष रक्त वाहिकाओं के अभाव और बाहरी हिस्से की तुलना में जब इसकी पीली उपस्थिति द्वारा आसानी से पहचानने योग्य है ।
- एक गिलास स्लाइड के साथ, धीरे चपटा आंत परिमार्जन द्वारा विल्ली निकालें । इस चरण में दो बार ऊतक की पूरी लंबाई के साथ प्रदर्शन ।
- 2-5 mm टुकड़ों में एक बाँझ सर्जिकल ब्लेड के साथ छोटी आंत में कटौती ।
- एक ५० मिलीलीटर में छोटे आंत्र टुकड़े प्लेस बर्फ ठंडा पंजाबियों की 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब ।
- उनके ऊपर और नीचे pipetting द्वारा किसी भी शेष अशुद्धियों को हटाने के ऊतकों टुकड़े साफ, पंजाबियों में । supernatant छोड़ें और यह चरण तब तक दोहराएं जब तक कि पंजाब पूरी तरह स्पष्ट न हो जाए ।
- 15 मिलीलीटर ठंडे पंजाबियों जोड़ें, पंजाब के कुल अंतिम मात्रा 25 मिलीलीटर लाने के लिए । 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर पर ४५ मिनट के लिए मशीन ।
- EDTA/
- पंजाब के 10 मिलीलीटर जोड़ें और कठोरता से ऊतक टुकड़े ऊपर और नीचे pipetting द्वारा तहखाने अलग करें (कम से कम तीन बार) । supernatant लीजिए.
- दोहराएं चरण २.१३ चार बार । संस्कृति माध्यम जोड़ें ५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए ।
- (5 मिनट के लिए ३०० x g) के द्वारा कोशिकाओं को गोली ।
- संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड और केंद्रापसारक द्वारा तहखाने गोली (८० एक्स जी 3 मिनट के लिए) ।
3. सिंगल सेल की तैयारी
- गोली के तहखाने के supernatant त्यागें और उन्हें 1 मिलीलीटर trypsin में reसस्पैंड-५० µ l DNAse (५० µ g/एमएल) के साथ एक साथ एंजाइमों ।
- 2 मिनट के लिए ३२ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में कोशिकाओं को मशीन ।
- संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें । अलग एकल कोशिकाओं में तहखाने को कठोरता से ऊपर और नीचे से नीचे 5 बार pipetting ।
- एक ४० µm छलनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर (झुरमुट और अंय अशुद्धियों को खत्म करने के लिए) और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर एकल कोशिकाओं गोली ।
4. फ्लो Cytometry और चढ़ाना
- 1x हांक के बफर नमक समाधान या HBSS/2% भ्रूण गाय सीरम (FCS) समाधान और हर 106 कोशिकाओं के लिए 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड के ५० मिलीलीटर तैयार
- सेल निलंबन BV421 लिन में जोड़ें- (CD31, CD45, TER119) 1:100 की एकाग्रता में, और CD24-APC और CD117-पीई दोनों 30 मिनट के लिए 1:250 एंटीबॉडी की एकाग्रता पर ।
- सॉर्ट करें Lgr5+ स्टेम कक्ष और Paneth कक्षों को अलग कम बाइंड ट्यूबों में । Lgr5+ और Paneth कक्षों के लिए सॉर्टिंग प्रोटोकॉल पर विवरण के लिए, कृपया रोथ एट अल देखें । 7 और Schewe एट अल । ६
- ३०० x g पर सॉर्ट की गई कक्षों को 5 min. reसस्पैंड १०० µ l माध्यम में घटकों के साथ १.३ में वर्णित के साथ कोशिकाओं को reसस्पेंड ( सामग्री की तालिकादेखें).
- उपचार (जैसे, रासायनिक या आनुवंशिक संशोधन द्वारा) Paneth कोशिकाओं (n = २०००) या Lgr5+ स्टेम सेल (n = २०००) ।
- कोशिकाओं के इलाज के लिए, १०० एनएम की एकाग्रता पर १०० µ एल संस्कृति मध्यम और छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) की कुल मात्रा में liposome-मध्यस्थता अभिकर्मक रिएजेंट के 5 µ एल का उपयोग करें । सिरना के लिए या चुना संशोधन के लिए आवश्यक समय के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- ५०० µ एल कल्चरल मीडियम में दो बार कोशिकाओं को धोएं.
- 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक और 10 µ एल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
- दो सेलुलर घटकों पूल (Paneth या Lgr5+ कोशिकाओं) में एक 20 µ एल कुल मात्रा और 5 मिनट के लिए RT पर ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
- आरटी में 10 मिनट के लिए Paneth और Lgr5+ कोशिकाओं की सह-मशीन ।
- supernatant के 10 µ एल निकालें और तरल की एक meniscus छोड़ने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सेल गोली महाप्राण नहीं है ।
- ४० µ एल की कुल मात्रा के लिए कोशिकाओं को फिर से गठित तहखाने झिल्ली के 30 µ एल जोड़ें, एक पूर्व में कोशिकाओं और प्लेट reसस्पेंड-९६ अच्छी तरह से थाली गरम । 10 मिनट के बाद, जोड़ें २०० µ पूर्ण माध्यम के एल ( सामग्री की तालिकादेखें) । परिवर्तन माध्यम प्रत्येकी ४८ एच.
- 5 दिन में organoid गुणा गिनती ।
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Representative Results
organoid पुनर्गठन परख आवश्यक आला और आंत्र उपकला के स्टेम सेल घटकों के अलग कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है, यहां छोटे हस्तक्षेप आरएनए के (सिरना) Apc जीन के द्वारा प्रदर्शन किया ।
इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम पहले फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) अलग ८००० Lgr5+ कोशिकाओं और C57BL6/जे चूहों से ६००० Paneth कोशिकाओं को इस्तेमाल किया । चित्र 1aमें, ORA परख का एक फ़्लोचार्ट दर्शाया गया है । Organoid पुनर्गठन क्षमता Apc या एक नियंत्रण के रूप में एक तले हुए अनुक्रम (ए. ए.) को शामिल किया गया Lgr5+ कोशिकाओं के साथ सिरना oligonucleotides के साथ मशीनिंग का मूल्यांकन था । उपचार के बाद, एक ही सिरना-इलाज किया Lgr5+ कोशिकाओं को या तो सीधे organoid माध्यम में चढ़ाया गया/विगठित तहखाने झिल्ली, या अनुपचारित Paneth कोशिकाओं की एक समान संख्या के साथ मशीन और बाद में बाहर चढ़ाया । एक नियंत्रण के रूप में, अनुपचारित Lgr5+ कोशिकाओं को अकेले चढ़ाया (यानी, Paneth कोशिकाओं के बिना) अनुपचारित Lgr5+ कोशिकाओं से व्युत्पंन organoids की संख्या निर्धारित करने के लिए किया गया । इसके अलावा, एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, Paneth कोशिकाओं को अकेले organoid Paneth के संदूषण से व्युत्पंन गठन की पृष्ठभूमि के लिए जांच करने के लिए चढ़ाया गया-Lgr5 सेल दोहरी कक्ष गेट में हल । के रूप में की उंमीद है, सिरना मध्यस्थता Lgr5में murine Apc जीन की पछाड़ना+ स्टेम सेल (और विहित Wnt के परिणामी सक्रियण/β-catenin संकेतन मार्ग) सकारात्मक प्रभावित organoid बहुलता जब की तुलना में अनुपचारित समकक्षों या तले हुए नियंत्रण (चित्र 1b). गठित Wnt सक्रियण ने Paneth कक्षों की आवश्यकता को भी बचाया, जैसा कि पहले1बताया गया है । इसके अलावा, इन organoids खोखले क्षेत्रों के रूप में प्रकट (spheroids), एक अच्छी तरह से Apc-उत्परिवर्ती या Wnt-उत्तेजित organoids के लिए वर्णित phenotype (चित्रा 1C, पैनल 1), जब Paneth से प्राप्त उन की आकृति विज्ञान के साथ तुलना-Lgr5 सेल दोहरी (चित्रा 1C, पैनल 2)8,9. सामूहिक रूप से, ये परिणाम प्रदर्शित करते है कि Paneth कक्ष और Lgr5+ कक्षों को पुनर्गठित करने से इन दो कक्ष प्रकारों के भीतर कक्ष-विशिष्ट तंत्रों को इनसाइट प्रदान किया जा सकता है; सूक्ष्मता से organoids का रूपात्मक विश्लेषण इस संबंध में मूल्यवान हो सकता है के बाद से organoids की आकृति विज्ञान उनके सेल संरचना को दर्शाता है (जैसे, spheroids Lgr5+ कोशिकाओं द्वारा गठित कर रहे हैं केवल). खाते में लिया जाने वाला एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर organoid की जटिलता (उदा., तहखाना नवोदित घटनाओं की संख्या) है ।
चित्र 1. Lgr5+ कोशिकाओं में Apc की सिरना मध्यस्थता पछाड़ना का प्रभाव. (A) प्रयोगात्मक प्रक्रिया का फ़्लोचार्ट । Lgr5 EGFP रिपोर्टर चूहों (Lgr5EGFP-आयरेस-creERT2)1 Lgr5+ स्टेम सेल हल के एक स्रोत के रूप में कार्यरत थे । Paneth कक्षों को दर्शाया गया के रूप में सॉर्ट किया गया और पहले6,7बताया गया है । (ख) Organoid बहुलता Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं और Paneth कोशिकाओं के पुनर्गठन पर मनाया. जब संकेत कोशिकाओं सिरना oligonucleotides के साथ इलाज किया गया apc (सिरना apc) या तले () नियंत्रण अनुक्रम के खिलाफ निर्देश दिया । तारांकन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है (n = 3, * p < 0.05 * * p < 0.001) । त्रुटि पट्टियों को देखें SD. (1) Lgr5+ कक्ष, (2) Lgr5+ कोशिकाएं, (3) Lgr5+ कोशिकाएं सिरना Apc, (4) Lgr5+ कोशिकाओं + Paneth कोशिकाओं, (5) Lgr5+ कोशिकाओं सिरना Apc + Paneth कोशिकाओं, (6) Paneth कोशिकाओं. (ग) organoids से प्राप्त की प्रतिनिधि छवियाँ (१) Lgr5+ कोशिकाएँ सिरना सुरक्ष, (२) Lgr5+-Paneth कोशिकाएँ हैं. स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
ORA आंत्र स्टेम सेल आला, अर्थात् Lgr5+ और Paneth कोशिकाओं के दो आवश्यक घटकों के परिष्कृत कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है । यह दृष्टिकोण पहले हमारे और मामूली संशोधनों6,10,11के साथ दूसरों के द्वारा नियोजित किया गया है । यहां, हम एक प्रतिलिपि और मानकीकृत प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के रूप में ORA प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, हम Lgr5+ स्टेम सेल में Apc downregulation के प्रभाव पर रिपोर्ट, हल सेलुलर घटकों के लिए आनुवंशिक (या जैव रासायनिक6संशोधन) को लागू करने की संभावना का एक उदाहरण के रूप में । सामूहिक रूप से, डेटा बताते है कि Apc के सिरना मध्यस्थता पछाड़ना Lgr5+ कोशिकाओं के स्टेम सेल समारोह को बढ़ाता है, के रूप में वृद्धि हुई organoid गुणा (आंकड़ा 1b) द्वारा संकेत दिया ।
आंत्र 3d organoid संस्कृतियों का उपयोग करने के कई लाभ पहले से ही समीक्षा में सूचीबद्ध किया गया है4, vivo मेंतहखाना-अंकुर आर्किटेक्चर के साथ उनके संगठन के हड़ताली सादृश्य सहित, विशेष रूप से जब की तुलना में मानक 2d संस्कृति तरीके से अमर सेल लाइनों के साथ वास्तुकला । हालांकि, इस विधि की प्रमुख सीमाओं में से एक है कि ज्यादातर मामलों में, organoid संस्कृतियों पूरे आंत्र तहखाने से स्थापित कर रहे हैं, एक प्रक्रिया है जो अपने व्यक्तिगत घटकों के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति नहीं है और विशेष रूप से, स्टेम और आला की कक्ष, यहां क्रमशः Lgr5+ और Paneth कक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
ORA इन सीमाओं पर काबू पाता है । स्टेम और आला कोशिकाओं अलग जानवर से हल किया जा सकता है और organoids उत्पंन करने के लिए पुनर्गठन । जैसे, इस दृष्टिकोण या तो माउस विशिष्ट आनुवंशिक संशोधनों ले जाने या विशिष्ट तनाव कारकों को उजागर मॉडल द्वारा इन दो सेलुलर घटकों के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है (उदा, DSS और/ या सीधे क्रमबद्ध कोशिकाओं को संशोधित करके आनुवंशिक रूप से (सिरना, CRISPR-Cas9) या जैव रासायनिक, उन्हें organoids उत्पन्न करने के लिए गठित करने से पहले. परिणामी organoids की बहुलता, आकृति विज्ञान, स्व-नवीनीकरण क्षमता, और विभेद की सीमा तक (और अंततः metaplastic परिवर्तन की सीमा) को कार्यात्मक पठन-बहिष्कार के रूप में नियोजित किया जा सकता है. आनुवंशिक हेरफेर के मामले में, जैसे सिरना, जब एक रूपात्मक प्रभाव स्पष्ट नहीं है, कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाना चाहिए अभिकर्मक के बाद एक घंटे के पछाड़ना को मान्य करने के लिए ब्याज की mRNA. Paneth और Lgr5+ भी चूहों से हल किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से विभिंन उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए कि स्टेम और आला कोशिकाओं में विभिंन उत्परिवर्तनों के लिए इन दो सेल प्रकार और एक अलग organoid के बीच संबंधों को बदल नेतृत्व से इंजीनियर गठन दक्षता और/
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों विल्ली (चरण २.७) और HBSS/2% FCS (चरण ४.१) में कक्षों का resuspension को हटाने हैं । विल्ली को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है Paneth और Lgr5+ तहखाने के निचले तीसरे में स्थित कोशिकाओं को समृद्ध और छंटाई की क्षमता में सुधार होगा । हालांकि FACS प्रोटोकॉल आमतौर पर पंजाब में सेल छंटाई सुझाव/FCS, HBSS के बजाय पंजाब के उपयोग में वृद्धि हुई है और सेल व्यवहार्यता समय भर में स्थिर रखा । अंय महत्वपूर्ण कदम ४.७ और ४.८, जहां Paneth और Lgr5+ कोशिकाओं के शारीरिक एसोसिएशन के इन वंश दोहरी कि अंततः organoids को जंम दे देंगे फार्म की अनुमति देता है ।
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Disclosures
लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित या हित के अंय संघर्ष है
Acknowledgments
यह अध्ययन डच कैंसर सोसायटी (KWF से धन द्वारा संभव बनाया गया था; EMCR 2012-5473) और विश्व कैंसर अनुसंधान कोष अंतर्राष्ट्रीय (WCRF; परियोजना सं 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
