Summary
Les cultures organoïde intestinale sont établis de cryptes ensemble et ne permettent pas l’analyse de l’auto-renouvellement et différenciation de façon spécifique des cellules. Ce protocole décrit la reconstitution de tige triée (Lgr5+) et les cellules (Paneth), donnant lieu à organoïdes, tout en permettant leur préalable modifications biochimiques et génétiques et l’analyse fonctionnelle de niche.
Abstract
L’épithélium intestinal se caractérise par un taux de rotation extrêmement rapide. Chez les mammifères, le revêtement épithélial entière est renouvelé dans les 4-5 jours. Les cellules souches adultes intestinaux se trouvent au fond des cryptes de Lieberkühn, sont affectés par l’expression du gène Lgr5 et préserver l’homéostasie grâce à leur caractéristique fort taux proliférative1. Tout au long de l’intestin grêle, Lgr5+ cellules souches s’entremêlent avec les cellules sécrétrices spécialisées appelées cellules de Paneth. Les cellules de Paneth sécrètent des composés antibactériens (c.-à-d., lysozyme et cryptdins/défensines) et exercent un rôle dominant sur la flore intestinale. Plus récemment, une nouvelle fonction a été découvert pour les cellules de Paneth, à savoir leur capacité à fournir un soutien de niche de cellules souches Lgr5+ à travers plusieurs ligands principaux au Wnt3, EGF et Dll12.
Lorsque isolés ex vivo et cultivées en présence de facteurs de croissance spécifiques et des constituants de la matrice extracellulaire, des cryptes intestinales ensemble donnent lieu à longue durée de vie et renouvellement des structures 3D appelé organoïdes qui ressemblent fortement à la crypte-villosités architecture épithéliale de l' intestin grêle adulte3. Organoïde cultures, lors de toute cryptes, permettent l’étude de l’auto-renouvellement et la différenciation de la niche de cellules souches intestinales, sans toutefois aborder la contribution de ses composants, à savoir le Lgr5+ et Cellules de Paneth.
Ici, les auteurs décrivent une nouvelle approche à l’analyse d’organoïde qui tire parti de la capacité de Paneth et des cellules de Lgr5+ pour associer et former les organoïdes lorsque conjointement mis en culture. Cette approche, ici dénommée « essai de reconstitution organoïde » (ORA), permet la modification génétique et biochimique de Paneth ou Lgr5+ des cellules souches, suivis de la reconstitution dans organoïdes. À ce titre, elle permet l’analyse fonctionnelle des deux principales composantes de la niche de cellules souches intestinales.
Introduction
L’épithélium intestinal est le tissu autorenouvellement plus rapidement dans l’organisme chez les mammifères et, à ce titre, a fait l’objet d’une pléthore d’études visant à l’identification et la caractérisation fonctionnelle des cellules souches adultes résidant au fond de la crypte de Lieberkühn, affectée par l’expression du gène Lgr5 et fonction canonique Wnt signaux1. Notamment, Lgr5+ des cellules souches sont flanqués et pris en charge par des cellules spécialisées de créneau, c'est-à-dire des cellules de Paneth, qui dépendent aussi de signalisation Wnt pour leur maturation2. Ensemble, ces deux types de cellules sous-tendent l’auto-renouvellement de la muqueuse épithéliale intestinale et préservation de l’équilibre homéostatique quotidienne : Lgr5+ cellules souches rapidement diviser et donner lieu à des progéniteurs et plus spécialisée intestinales épithéliales cellules ; Les cellules de Paneth fournissent des facteurs essentiels de niche (p. ex., Dll1, Wnt3, EGF) à Lgr5+ 2les cellules souches. La capacité des cryptes intestinales lorsque plaqué ex vivo pour former des structures organisées et autorenouvellement appelée organoïdes, ou « mini-tripes », a été exploitée comme un outil expérimental pour donner un aperçu des processus tels que l’auto-renouvellement et différenciation dans des conditions normales et pathologiques, y compris le cancer4. Organoïde cultures ont été établis de plusieurs tissus, y compris l’intestin, le pancréas, le foie et le rein, à la fois des souris et des échantillons humains4. La méthode d’extraction et les facteurs de croissance employés pour développer ces cultures organoïde sont tissu-spécifique et conçues pour conduire la différenciation des lignées multiples et imiter autant que possible la niche de cellules souches original in vivo. Organoïdes peut avoir des applications potentielles, y compris le traitement des maladies génétiques, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique dans le cancer, l’analyse de la toxicité des médicaments ou l’étude de l’organogenèse in vitro5.
Dans l’ensemble, la principale limitation des cultures organoïde lorsque établies à partir d’échantillons de tissus est un manque de spécificité cellulaire. Par exemple, organoïdes intestinales, établis à partir des cryptes intestinales ensemble ne permettent pas l’analyse des différents composants cellulaires englobés dans la source de tissu (par exemple, contiennent des cryptes toute Lgr5+, Paneth, et cellules souches).
Nous décrivons ici une nouvelle méthode, dénommée ORA, qui combine les avantages des cultures organoïde intestinale avec l’analyse fonctionnelle de ses éléments plus fondamentaux, à savoir les souches (Lgr5+) et les cellules de la niche (Paneth). Ceci est réalisé grâce à la capacité unique de Paneth et des cellules pour associer physiquement à l’autre lorsque co incubés et donner lieu à organoïdes2,6,10 Lgr5+ . Nous avons pris parti de cette fonctionnalité et prétraités individuellement les deux types cellulaires avant leur permettant de reconstituer organoïdes. Ce faisant, chaque composant de la cellule peut être exposé à n’importe quel médicament, facteur de croissance, inhibiteur biochimique, modification génétique ou traitement chimique avant reconstitution et organoïde formation. Par conséquent, essai sur les ORA permettra à la détermination de la question de savoir si un traitement médicamenteux spécifique ou la modification génétique a un effet spécifique sur les cellules souches ou leur homologue de niche.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées selon les directives et lois locales de bien-être animal.
1. préparation des Instruments, les milieux de Culture et plats
- Ensemble d’autoclave 1 intestinale Ciseaux Ciseaux normaux et pinces dans un flacon stérile.
- Placer un plat de 96 puits (fond plat) dans un incubateur à 37 ° C.
- Préparer 10 mL de milieu de culture complet avec les réactifs énumérés dans la table des matières.
- Incuber le milieu complet à 37 ° C dans un bain d’eau.
- Décongelez les membrane plasmique basale reconstituée en le plaçant dans un seau à glace. La membrane plasmique basale reconstituée deviendra liquide à 4 ° C.
- Remplissez 4 boîtes de Pétri avec une solution saline tamponnée au phosphate froide ou abrégé PBS (4 ° C).
2. isolement de petites cryptes intestinales
- Sacrifier, par inhalation de CO2 , une Lgr5- eGFP-IRES-CreERt2 souris sur fond C57BL6/J. Disséquer le péritoine longitudinalement avec une paire de ciseaux.
- Tenir l’estomac avec la pince et couper transversalement en deux.
- En utilisant les ciseaux intestinales par la suite, retirer l’intestin et placez-le dans une boîte de Pétri contenant du PBS.
NOTE : Ciseaux Intestinal ont une forte et une pointe émoussée. L’extrémité arrondie de ces ciseaux est destinée à ne pas endommager l’architecture de la crypte-villosités lors de l’ouverture de l’intestin. - Commencez par placer la pointe émoussée dans l’estomac et le pousser doucement à travers le pylore. Aller de l’avant en coupant avec des ciseaux et en tirant avec la pince.
- Une fois que l’intestin entier est ouverte longitudinalement, lavez-le dans du PBS froid en le tenant avec la pince et le rincer doucement dans la solution de PBS avec des mouvements en forme de U.
- Une fois que tous les restes de selles sont effacés, procéder pour aplatir l’intestin sur une planche à découper, luminal face vers le haut. La face luminale est facilement reconnaissable par l’absence de vaisseaux sanguins et par son aspect pâle en comparaison avec la partie extérieure.
- Avec une lame de verre, retirez délicatement les villosités en grattant l’intestin aplatie. Effectuez cette étape deux fois sur toute la longueur du tissu.
- Couper l’intestin grêle avec une lame chirurgicale stérile en morceaux de 2 à 5 mm.
- Placer les petits fragments intestinales dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de PBS froid de glace.
- Nettoyer les fragments tissulaires, enlever toutes les impuretés restantes en pipettant également, les monter et descendre dans le PBS. Jeter le surnageant et répétez cette étape jusqu'à ce que le PBS est tout à fait clair.
- Ajouter 15 mL de PBS froid, pour porter le volume final total de PBS à 25 mL. Ajouter 2 mM d’acide tétraacétique (EDTA) et incuber pendant 45 min sur un rouleau à 4 ° C.
- Jeter le PBS/EDTA.
- Ajouter 10 mL de PBS et détacher les cryptes de pipetage durement les fragments de tissus haut et en bas (au moins trois fois). Recueillir le liquide surnageant.
- Répétez l’étape 2.13 quatre fois. Ajouter le milieu de culture pour atteindre un volume de 50 mL.
- Les cellules de granule par centrifugation (300 x g pendant 5 min).
- Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture et les cryptes de granule par centrifugation (80 x g pendant 3 min).
3. seule cellule préparation
- Jeter le surnageant des cryptes granulés et les remettre en suspension dans 1 mL, comme la trypsine-enzymes avec 50 µL DNAse (50 µg/mL).
- Incuber les cellules dans un bain d’eau à 32 ° C pendant 2 min.
- Ajouter 10 mL de milieu de culture. Dissocier les cryptes en cellules individuelles en durement pipetage monte et descend au moins 5 fois.
- Filtrer la solution à travers un tamis de 40 µm (pour éliminer les touffes et autres impuretés) et les cellules individuelles à 300 x g pendant 5 min à pellets.
4. flow Cytometry et placage
- Préparer 50 mL de solution saline tamponnée de 1 x Hank ou une solution de sérum (FCS) HBSS/2% vache foetale et Resuspendre le culot dans 1 mL pour chaque 106 cellules
- Ajouter à la suspension de cellules BV421 Lin– (CD31, CD45, TER119) à une concentration de 1/100 et CD24-APC et CD117-PE les deux à une concentration de 1/250 anticorps pendant 30 min.
- Tri Lgr5+ des cellules souches et des cellules de Paneth en bas séparés lient des tubes. Pour plus d’informations sur le tri des protocoles pour Lgr5+ et des cellules de Paneth, s’il vous plaît voir Roth et al. 7 et Schewe et al. 6
- Centrifuger les cellules triées à 300 g pendant 5 min. remettre en suspension les cellules dans 100 µL de milieu avec les composants décrits comme 1.3 (voir la Table des matières).
- Traiter (par exemple, par une modification chimique ou génétique) les cellules de Paneth (n = 2000) ou les cellules souches de Lgr5+ (n = 2000).
- Pour traiter des cellules, utilisez 5 µL de réactif de transfection de liposome-négociée dans un volume total de 100 µL de milieu culture et petits ARN interférents (siARN) à une concentration de 100 nM. Incuber 30 min à 37 ° C pour les siARN ou pour la durée nécessaire à la modification choisie.
- Laver les cellules deux fois en 500 µL de milieu de culture.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes et remettre en suspension les cellules de 10 µL de milieu de culture.
- Mettre en commun les deux composants cellulaires (Paneth ou Lgr5+ cellules) dans un 20 µl volume total et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Incuber conjointement le Paneth et des cellules de Lgr5+ pendant 10 min à température ambiante.
- Enlever 10 µL du liquide surnageant et laisser un ménisque du liquide bien sûr pour ne pas aspirer le culot cellulaire.
- Ajouter 30 µL de membrane plasmique basale reconstituée dans les cellules pour un volume total de 40 µL, remettre les cellules en suspension et la plaque dans une assiette bien 96 préchauffé. Après 10 min, ajouter 200 µL de milieu complet (voir la Table des matières). Moyen de changer toutes les 48 h.
- Multiplicité de comte organoïde au jour 5.
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Representative Results
L’essai de reconstitution organoïde permet l’analyse fonctionnelle séparée des composants essentiels de niche et de cellules souches de l’épithélium intestinal, témoigne ici de petits ARN interférents (siARN) du gène Apc .
Pour atteindre cet objectif, nous avons utilisé tout d’abord fluorescent cellulaire activé triant (FACS) pour séparer les cellules Lgr5+ 8000 et 6000 cellules de Paneth consanguines souris C57BL6/J. Dans la Figure 1 a, est représenté un organigramme du test de l’ORA. Capacité de reconstitution organoïde a été évaluée en incubant les cellules Lgr5+ avec des oligonucléotides de siARN dirigés contre l’ARNm de l’Apc ou englobant une séquence codée (SCR) sous forme de contrôle. Après le traitement, les mêmes siARN Lgr5+ les cellules traitées étaient soit directement plaqués dans organoïde moyen/reconstitué les membranes basales, ou incubées avec un nombre égal de cellules de Paneth non traitées et ensuite plaqués sur. Comme contrôle, les cellules Lgr5+ non traitées ont été plaqués seul (c'est-à-diresans cellules de Paneth) pour déterminer le nombre d’organoïdes dérivée de cellules Lgr5+ non traitées. En outre, comme un contrôle supplémentaire, cellules de Paneth seuls ont été cultivées pour vérifier le fond de formation organoïde provenant de la contamination des doublets de cellules de Paneth-Lgr5 triés dans la porte de cellules de Paneth. Comme prévu, siARN médiée par précipitation du gène Apc murine en cellules souches Lgr5+ (et l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine canonique) affectée positivement organoïde multiplicité par rapport aux homologues non traités ou le contrôle brouillé (Figure 1 b). L’activation constitutive de la voie Wnt a aussi sauvé l’exigence pour les cellules de Paneth, comme indiqué précédemment1. En outre, ces organoïdes est apparu aussi creux sphères (sphéroïdes), un phénotype bien décrit pour Apc-mutant ou stimulée par Wnt organoïdes (Figure 1, tableau 1), par rapport à la morphologie de ceux obtenus à partir des cellules de Paneth-Lgr5 les doublets (Figure 1 C, panneau 2)8,9. Collectivement, ces résultats démontrent que la reconstitution des cellules de Paneth et Lgr5+ cellules peuvent donner un aperçu sur les mécanismes spécifiques des cellules au sein de ces deux types de cellules ; analyse morphologique de l’organoïdes au microscope peut être utile à cet égard puisque la morphologie de l’organoïdes reflète la composition de leur cellulaire (p. ex., les sphéroïdes sont constitués par Lgr5+ cellules seulement). Un autre paramètre important à prendre en compte est la complexité de l’organoïde (p. ex., le nombre d’événements en herbe de crypte).
La figure 1. Effet du siRNA médiée par précipitation d' Apc dans Lgr5+ cellules. Organigramme (A) de la méthode expérimentale. Lgr5 EGFP journaliste souris (EGFP-IRES-creERT2deLgr5)1 ont été utilisés comme une source de Lgr5+ tri des cellules souches. Les cellules de Paneth étaient triés comme indiquées et décrites précédemment6,7. (B) organoïde multiplicité observée lors de la reconstitution des cellules souches Lgr5+ et des cellules de Paneth. Lorsque les cellules indiquées ont été pré-traitées avec oligonucléotides de siARN dirigés contre l' Apc (siRNA Apc) ou brouiller la séquence de contrôle (SCR). Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0,001). Barres d’erreur faire référence aux cellules SD. (1) Lgr5+ , SCR, (3) Lgr5+ cellules siARN Apc, (4) les cellules Lgr5+ + cellules de Paneth, (5) Lgr5des cellules (2) Lgr5+ + cellules siARN Apc + cellules de Paneth, (6) cellules de Paneth. (C) des images représentatives d’organoïdes dérivé de (1) Lgr5+ cellules siARN Apc, des cellules de Paneth - Lgr5+(2). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’ORA permet l’analyse fonctionnelle raffinée des deux composantes essentielles de la niche de cellules souches intestinales, à savoir Lgr5+ et cellules de Paneth. Cette approche a été utilisée précédemment par nous et d’autres avec de légères modifications6,10,11. Nous présentons ici la procédure ORA comme un protocole de laboratoire standardisée et reproductible. En outre, nous rapportons sur les effets de la diminution d’Apc dans les cellules souches Lgr5+ , comme un exemple de la possibilité d’implanter génétique (ou biochimiques6) modifications aux composants cellulaires triées. Ensemble, les données montrent que les siARN médiée par précipitation d’Apc améliore la fonction des cellules souches de cellules Lgr5+ , comme en témoigne la multiplicité organoïde accrue (Figure 1 b).
Plusieurs avantages de l’utilisation de cultures intestinale organoïde 3D ont déjà cotées en commentaires4, y compris la ressemblance frappante de leur organisation avec celle de la crypte-villosités architecture in vivo, en particulier par rapport à la architecture à partir des méthodes de culture 2D standard avec des lignées cellulaires immortalisées. Cependant, une des principales limites de cette méthode qui est plus souvent, organoïde cultures établies des cryptes intestinales ensemble, un processus qui ne permet pas l’analyse fonctionnelle de ses différentes composantes et, en particulier, de la tige et de la niche cellules, ici représentées par Lgr5+ et cellules de Paneth, respectivement.
L’ORA permet de surmonter ces limitations. Cellules souches et niche pouvant être triées de l’animal séparément et reconstitués pour générer organoïdes. Par conséquent, cette approche permet l’analyse fonctionnelle de ces deux composantes cellulaires par deux modèles de souris employant transportant des modifications génétiques spécifiques ou exposés aux facteurs de stress spécifiques(p. ex., DSS ou régimes spécifiques) ; ou en modifiant directement les cellules triées génétiquement (siRNA, CRISPR-Cas9) ou biochimiquement, avant de reconstituer pour générer organoïdes. La multiplicité, la morphologie, capacité d’autorenouvellement et mesure de la différenciation (et éventuellement l’ampleur des changements métaplasique) de l’organoids qui en résulte peuvent être employés comme afficheurs fonctionnelles. Dans le cas de manipulations génétiques, tels que les siRNA, lorsqu’un effet morphologique n’est pas évident, les cellules doivent être analysées une heure après la transfection pour valider la précipitation de l’ADN messagère d’intérêt. Paneth et Lgr5+ peuvent aussi être triés de souris génétiquement modifiées avec des mutations différentes afin d’étudier si différentes mutations dans les cellules souches et niche conduisent à altéré les interactions entre ces deux types de cellules et un organoïde différent l’efficacité de la formation et/ou la morphologie.
Étapes critiques au sein du protocole sont la suppression des villosités (étape 2.7) et la remise en suspension des cellules HBSS/2%FCS (étape 4.1). Enlèvement des villosités est essentielle pour enrichir Paneth et Lgr5+ cellules situées dans le tiers inférieur des cryptes et d’améliorer l’efficacité du tri. Bien que les protocoles de FACS suggèrent couramment tri des cellules en PBS/FCS, l’utilisation de HBSS au lieu de PBS a augmenté et gardé la viabilité cellulaire stable pendant tout le temps de tri. Autres mesures importantes sont étapes 4.7 et 4.8, où physique association de Paneth et Lgr5+ cellules permet ces lignées pour les doublets de forme qui donneront finalement naissance à organoïdes.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrente ou autres conflits d’intérêts
Acknowledgments
Cette étude a été rendue possible par le financement de la société néerlandaise de Cancer (KWF ; EMCR 2012-5473) et le World Cancer Research Fonds International (WCRF ; projet no 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
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